בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה
Summary
טכנולוגיות CRISPR-Cas חוללו מהפכה בתחום עריכת הגנום. עם זאת, מציאת ובידוד עריכת קו הנבט הרצויה נותרה צוואר בקבוק משמעותי. לכן, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון מהיר של זרע דג זברה מוזרק F0 CRISPR לעריכות קו הנבט באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות, תקציר הגבלה ואלקטרופורזה בג’ל.
Abstract
הופעתן של טכנולוגיות נוקלאז CRISPR-Cas ממוקדות חוללה מהפכה ביכולת לבצע עריכת גנום מדויקת במערכות מודל מבוססות ומתפתחות כאחד. מערכות עריכת הגנום של CRISPR-Cas משתמשות ב-RNA מנחה סינתטי (sgRNA) כדי לכוון אנדונוקלאז הקשור לקריספר (Cas) ל-DNA loci גנומי ספציפי, שבו אנדונוקלאז Cas יוצר שבר דו-גדילי. תיקון שברים דו-גדיליים על ידי מנגנונים המועדים לטעויות מהותיות מוביל להחדרות ו/או מחיקות, המשבשות את הלוקוס. לחלופין, הכללתם של תורמי DNA דו-גדיליים או אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים של DNA בתהליך זה יכולה לעורר הכללת עריכות גנום מדויקות החל מפולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים ועד תגים אימונולוגיים קטנים או אפילו מבנים חלבוניים פלואורסצנטיים גדולים. עם זאת, צוואר בקבוק משמעותי בהליך זה יכול להיות מציאת ובידוד העריכה הרצויה בקו הנבט. פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון ובידוד מוטציות של תאי נבט במוקדים ספציפיים בדגי זברה ( Danio rerio ); עם זאת, עקרונות אלה עשויים להיות ניתנים להתאמה בכל מודל שבו איסוף זרע in vivo אפשרי.
Introduction
מערכת CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas היא כלי רב עוצמה לביצוע מוטגנזה ספציפית ללוקי ועריכת גנום מדויקת במערכת מודל Danio rerio (דג זברה) 1,2,3,4. Cas-ribonucleoprotein (RNP) מורכב משני מרכיבים עיקריים: Cas endonuclease (בדרך כלל Cas9 או Cas12a) ו- RNA מדריך סינתטי ספציפי ללוקוס (sgRNA)5. יחד, Cas-RNP יוצר שבר דו-גדילי (DSB) במיקום הרצוי שניתן לתקן על ידי אחד משני מנגנוני תיקון פנימיים. מנגנון התיקון הלא הומולוגי של הצטרפות הקצה (NHEJ) מועד לשגיאות ולעתים קרובות גורם למגוון של הוספות או מחיקות (indels) סביב DSB. אינדלים אלה יכולים להיות מזיקים אם הם מציגים מוטציה frameshift או עצירה מוקדמת ברצף החלבונים המתקבל. לחלופין, מנגנון התיקון מונחה הומולוגיה (HDR) משתמש בתבנית תורם עם אזורי הומולוגיה המקיפים את אתר DSB כדי לתקן את הנזק. חוקרים יכולים לנצל את מערכת HDR כדי ליצור עריכות גנומיות מדויקות. באופן ספציפי, הם יכולים להזריק במשותף מבנה תורם DNA דו-גדילי המכיל את העריכות הרצויות, כמו גם אזורים של הומולוגיה הצמודים לאתר DSB בגנום. הגידול בכלכלת הגודל של רכיבי CRISPR המיוצרים באופן מסחרי צמצם מאוד את המחסומים לסינון אתרים מרובים ולהקמת מאמצים בקנה מידה גדול יותר לעריכה מדויקת של הגנום. עם זאת, במודלים של בעלי חיים המתרבים מינית, צוואר בקבוק עיקרי הוא זיהוי ובידוד של בעלי חיים מוטנטיים יציבי נבט.
מערכת מודל דגי הזברה מציגה מספר תכונות מפתח המשפרות את השימוש בה במחקרים גנטיים הפוכים. קל לגדל אותם במספרים גדולים עם ציוד דיור ימי בסיסי, והנקבות מפגינות פריון גבוה כל השנה6. יתר על כן, הטלת הביצים וההפריה החיצונית שלהם הופכות אותם למקובלים למיקרו-הזרקה של רכיבי CRISPR/Cas. ה- Cas-RNP מוזרק בדרך כלל לעוברים של דגי זברה בשלב חד תאי כדי ליצור DSBs/תיקון שהוא, בתיאוריה, בירושה על ידי כל תאי הבת. עם זאת, גנומים דיפלואידים דורשים שני אירועי DSB/תיקון כדי לבצע מוטגניזציה של שני הכרומוזומים ההומולוגיים. יתר על כן, למרות ש- Cas-RNP מוזרק בשלב התא האחד, ה- DSB/תיקון עשוי להתרחש רק בנקודות מאוחרות יותר בהתפתחות. יחד, גורמים אלה תורמים לאופי הפסיפס של דגים המוזרקים F0. נוהג נפוץ הוא לחצות דגים המוזרקים F0 ולסנן את צאצאי F1 עבור indels / עריכות ספציפיות. עם זאת, מכיוון שלא לכל הדגים המוזרקים F0 יש מוטציות בקו הנבט, נוהג זה גורם להצלבות לא פרודוקטיביות רבות שאינן מייצרות את העריכה הרצויה. סינון הרקמה הסומטית F0 במקום F1 מגדיל את ההסתברות לבידוד מערך הנבט הרצוי ומקטין את מספר בעלי החיים הדרושים בתהליך זה.
ניתן לאסוף זרע בקלות מדגי זברה המוזרקים F0 ללא צורך בהמתת חסד. תכונה זו מאפשרת שימור בהקפאה וגזירה מחדש של מלאי זרע קפוא7 אך ניתן גם לנצל אותה כדי לסנן, לזהות ולבודד במהירות את נשאי הנבט של מוטציות גנומיות רצויות 8,9. Brocal et al. (2016) תיארו בעבר שיטה מבוססת ריצוף לסינון עריכות קו הנבט בדגי זברה זכרים בהזרקת F010. למרות שהיא שימושית לזיהוי האללים המוטנטים הנמצאים בקו הנבט, גישה זו עלולה להיות יקרה בתפוקה גבוהה וייתכן שלא תהיה נגישה לכל המעבדות. לעומת זאת, הפרוטוקול הנוכחי מציע אסטרטגיה נגישה וחסכונית מבוססת אלקטרופורזה לזיהוי עריכות קו הנבט. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון ובידוד מוטציות של קו הנבט באתרים ספציפיים באמצעות אלקטרופורזה של ג’ל אגרוז ברזולוציה גבוהה. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה דומה לזיהוי שילוב מוצלח של מבנה תורם המכיל עריכות ספציפיות. כמו תמיד, אם יש צורך בעריכות ספציפיות, ניתן לבצע אסטרטגיות מבוססות רצף במקביל לפרוטוקול המתואר להלן. למרות שפרוטוקול זה הוא ספציפי למערכת מודל דגי הזברה, עקרונות אלה צריכים להיות ניתנים להתאמה לכל מודל שבו איסוף הזרע הוא הליך שגרתי. יחד, אסטרטגיות אלה יאפשרו זיהוי של זכרים עם הזרקת F0 עם indels/edits germline שניתן לפתור על ג’ל לאחר תגובת שרשרת פולימראז סטנדרטית (PCR) ו / או הגבלת digest.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה לאפיון מהיר של עריכות גנום משוערות או מוטציות ממוקדות באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas על ידי ניתוח ממוקד של גנומי זרע זכריים F0. פרוטוקול זה צריך להיות מקובל על מודלים אחרים של בעלי חיים שבהם הזרע זמין לדגימה ללא המתת חסד. שיטה זו תגדיל את תפוקת הסינון לעריכות רצויות והיא שימ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לאנה הינדס מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון על מאמציה הראשוניים להשיג DNA גנומי זרע באיכות טובה בשיטת הזריקה החמה. עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס (R01AR072009 ל- R.S.G).
Materials
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
|
| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
|
| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
|
| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
|
| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
|
| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
- Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
- Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
- Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
- Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
- Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
- Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259 (2016).
- Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
