فحص الحيوانات المنوية للعزل السريع لتعديلات الخط الجرثومي في الزرد
Summary
أحدثت تقنيات كريسبر-كاس ثورة في مجال تحرير الجينوم. ومع ذلك ، فإن العثور على تعديل الخط الجرثومي المطلوب وعزله لا يزال يمثل عنق الزجاجة الرئيسي. لذلك ، يصف هذا البروتوكول طريقة قوية لفحص الحيوانات المنوية لأسماك الزرد المحقونة ب F0 CRISPR بسرعة لإجراء تعديلات على الخط الجرثومي باستخدام تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية وهضم التقييد والرحلان الكهربائي الهلامي.
Abstract
أحدث ظهور تقنيات CRISPR-Cas nuclease المستهدفة ثورة في القدرة على إجراء تحرير دقيق للجينوم في كل من أنظمة النماذج الراسخة والناشئة. تستخدم أنظمة تحرير الجينوم CRISPR-Cas الحمض النووي الريبي الإرشادي الاصطناعي (sgRNA) لاستهداف نوكلياز داخلي مرتبط ب CRISPR (Cas) إلى مواقع الحمض النووي الجينومية المحددة ، حيث يولد Cas endonuclease كسرا مزدوجا. يؤدي إصلاح فواصل الخيوط المزدوجة بواسطة آليات معرضة للخطأ الجوهري إلى عمليات الإدراج و / أو الحذف ، مما يؤدي إلى تعطيل الموضع. بدلا من ذلك ، يمكن أن يؤدي إدراج متبرعين بالحمض النووي المزدوج أو قليل النيوكليوتيدات أحادية الشريط من الحمض النووي في هذه العملية إلى إدراج تعديلات دقيقة للجينوم تتراوح من تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة إلى العلامات المناعية الصغيرة أو حتى تركيبات البروتين الفلوري الكبيرة. ومع ذلك ، يمكن أن يكون عنق الزجاجة الرئيسي في هذا الإجراء هو العثور على التعديل المطلوب في الخط الجرثومي وعزله. يحدد هذا البروتوكول طريقة قوية لفحص وعزل طفرات الخط الجرثومي في مواقع محددة في Danio rerio (الزرد). ومع ذلك ، قد تكون هذه المبادئ قابلة للتكيف في أي نموذج حيث يمكن جمع الحيوانات المنوية في الجسم الحي .
Introduction
يعد نظام CRISPR (التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام) / Cas أداة قوية لإجراء طفرات خاصة بالموقع وتحرير الجينوم الدقيق في نظام نموذج Danio rerio (الزرد)1،2،3،4. يتكون Cas-ribonucleoprotein (RNP) من مكونين رئيسيين: Cas endonuclease (عادة Cas9 أو Cas12a) و RNA دليل اصطناعي خاص بالموقع (sgRNA) 5. معا ، يولد Cas-RNP استراحة مزدوجة تقطعت بهم السبل (DSB) في الموضع المطلوب الذي يمكن إصلاحه بواسطة إحدى آليتي الإصلاح الجوهريتين. آلية إصلاح الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) عرضة للخطأ وغالبا ما تؤدي إلى مجموعة متنوعة من عمليات الإدراج أو الحذف (indels) حول DSB. يمكن أن تكون هذه الإندل ضارة إذا أدخلت طفرة في إزاحة الإطار أو توقفا سابقا لأوانه في تسلسل البروتين الناتج. بدلا من ذلك ، تستخدم آلية الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) نموذجا مانحا مع مناطق التماثل المحيطة بموقع DSB لإصلاح الضرر. يمكن للباحثين الاستفادة من نظام HDR لتوليد تعديلات جينومية دقيقة. على وجه التحديد ، يمكنهم المشاركة في حقن بنية مانحة مزدوجة الحمض النووي التي تقطعت بها السبل والتي تحتوي على التعديلات المطلوبة بالإضافة إلى مناطق التماثل التي تحيط بموقع DSB في الجينوم. وقد أدى الاقتصاد المتزايد في الحجم لمكونات كريسبر المنتجة تجاريا إلى تقليل الحواجز التي تحول دون فحص مواقع متعددة وإقامة جهود واسعة النطاق لتحرير الجينوم بدقة. ومع ذلك ، في النماذج الحيوانية التي تتكاثر جنسيا ، يتمثل عنق الزجاجة الرئيسي في تحديد وعزل الحيوانات الطافرة المستقرة للخط الجرثومي.
يظهر نظام نموذج الزرد العديد من الصفات الرئيسية التي تعزز استخدامه في الدراسات الجينية العكسية. من السهل تربيتها بأعداد كبيرة مع معدات الإسكان المائية الأساسية ، وتظهر الإناث خصوبة عالية على مدار السنة6. علاوة على ذلك ، فإن وضع البيض الخارجي والتسميد يجعلها قابلة للحقن الدقيق لمكونات CRISPR / Cas. عادة ما يتم حقن Cas-RNP في أجنة الزرد ذات المرحلة الواحدة لتوليد DSBs / إصلاح ، من الناحية النظرية ، موروثة من قبل جميع الخلايا الوليدة. ومع ذلك ، تتطلب الجينومات ثنائية الصيغة الصبغية حدثين DSB / إصلاح لإحداث طفرة في كلا الكروموسومين المتماثلين. علاوة على ذلك ، على الرغم من حقن Cas-RNP في مرحلة الخلية الواحدة ، فقد لا يحدث DSB / الإصلاح حتى نقاط لاحقة في التطوير. تساهم هذه العوامل معا في الطبيعة الفسيفسائية للأسماك المحقونة ب F0. من الممارسات الشائعة تهجين الأسماك المحقونة ب F0 وفحص ذرية F1 بحثا عن تعديلات indels / محددة. ومع ذلك ، نظرا لعدم امتلاك جميع الأسماك المحقونة ب F0 طفرات في الخط الجرثومي ، فإن هذه الممارسة تؤدي إلى العديد من التهجينات غير المنتجة التي لا تولد التعديل المطلوب. يزيد فحص الخط الجرثومي F0 بدلا من الأنسجة الجسدية F1 من احتمالية عزل تحرير الخط الجرثومي المطلوب ويقلل من عدد الحيوانات المطلوبة في هذه العملية.
يمكن بسهولة جمع الحيوانات المنوية من الزرد المحقون ب F0 دون الحاجة إلى القتل الرحيم. تسمح هذه الميزة بالحفظ بالتبريد وإعادة اشتقاق مخزون الحيوانات المنوية المجمدة7 ولكن يمكن أيضا استغلالها لفحص وتحديد وعزل ناقلات الخط الجرثومي للطفرات الجينومية المرغوبة بسرعة 8,9. وصف Brocal et al. (2016) سابقا طريقة قائمة على التسلسل لفحص تعديلات الخط الجرثومي في ذكور الزرد 10 المحقونة بF0. على الرغم من أن هذا النهج مفيد لتحديد الأليلات الطافرة الموجودة في الخط الجرثومي ، إلا أنه يمكن أن يصبح مكلفا في الإنتاجية العالية وقد لا يكون متاحا لجميع المختبرات. في المقابل ، يقدم البروتوكول الحالي استراتيجية سهلة الاستخدام وفعالة من حيث التكلفة قائمة على الرحلان الكهربائي لتحديد تعديلات الخط الجرثومي. على وجه التحديد ، يحدد هذا البروتوكول طريقة قوية لفحص وعزل طفرات الخط الجرثومي في مواقع محددة باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز عالي الدقة. بالإضافة إلى ذلك ، يصف هذا البروتوكول استراتيجية مماثلة لتحديد التكامل الناجح لبنية مانحة تحتوي على تعديلات محددة. كما هو الحال دائما ، إذا كانت هناك حاجة إلى تعديلات محددة ، فيمكن تنفيذ الاستراتيجيات القائمة على التسلسل جنبا إلى جنب مع البروتوكول الموضح أدناه. على الرغم من أن هذا البروتوكول خاص بنظام نموذج الزرد ، إلا أن هذه المبادئ يجب أن تكون قابلة للتكيف مع أي نموذج يكون فيه جمع الحيوانات المنوية إجراء روتينيا. معا ، ستسمح هذه الاستراتيجيات بتحديد الذكور المحقونين ب F0 مع indels / edits الخط الجرثومي التي يمكن حلها على هلام بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي (PCR) و / أو هضم التقييد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة للتوصيف السريع لتعديلات الجينوم المفترضة أو الطفرات المستهدفة باستخدام تقنية CRISPR-Cas من خلال التحليل المركز على جينومات الحيوانات المنوية الذكرية F0. يجب أن يكون هذا البروتوكول قابلا للنماذج الحيوانية الأخرى حيث تكون الحيوانات المنوية متاحة بسهولة لأخذ العينات د?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر آنا هيندز في كلية الطب بجامعة واشنطن على جهودها الأولية في الحصول على الحمض النووي الجيني للحيوانات المنوية عالي الجودة باستخدام طريقة الطلقة الساخنة. تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض الجهاز العضلي الهيكلي والجلد التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب جائزة (R01AR072009 إلى R.S.G.).
Materials
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
|
| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
|
| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
|
| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
|
| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
|
| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
- Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
- Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
- Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
- Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
- Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
- Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259 (2016).
- Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
