Dépistage des spermatozoïdes pour l’isolement rapide des modifications de la lignée germinale chez le poisson zèbre
Summary
Les technologies CRISPR-Cas ont révolutionné le domaine de l’édition du génome. Cependant, trouver et isoler la modification souhaitée de la lignée germinale reste un goulot d’étranglement majeur. Par conséquent, ce protocole décrit une méthode robuste pour dépister rapidement les spermatozoïdes de poisson-zèbre injectés par F0 CRISPR pour les modifications de la lignée germinale en utilisant des techniques standard de PCR, de digestion de restriction et d’électrophorèse sur gel.
Abstract
L’avènement des technologies de nucléase CRISPR-Cas ciblées a révolutionné la capacité d’effectuer une édition précise du génome dans les systèmes modèles établis et émergents. Les systèmes d’édition du génome CRISPR-Cas utilisent un ARN guide synthétique (sgRNA) pour cibler une endonucléase associée à CRISPR (Cas) sur des loci d’ADN génomique spécifiques, où l’endonucléase Cas génère une cassure double brin. La réparation des cassures double brin par des mécanismes intrinsèques sujets aux erreurs conduit à des insertions et/ou des délétions, perturbant le locus. Alternativement, l’inclusion de donneurs d’ADN double brin ou d’oligonucléotides d’ADN simple brin dans ce processus peut susciter l’inclusion de modifications précises du génome allant des polymorphismes mononucléotidiques aux petites étiquettes immunologiques ou même aux grandes constructions de protéines fluorescentes. Cependant, un goulot d’étranglement majeur dans cette procédure peut être de trouver et d’isoler la modification souhaitée dans la lignée germinale. Ce protocole décrit une méthode robuste pour le dépistage et l’isolement des mutations germinales à des loci spécifiques chez Danio rerio (poisson zèbre); Cependant, ces principes peuvent être adaptables dans n’importe quel modèle où la collecte de sperme in vivo est possible.
Introduction
Le système CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas est un outil puissant pour effectuer une mutagénèse spécifique aux loci et une édition précise du génome dans le système modèle Danio rerio (poisson zèbre) 1,2,3,4. La Cas-ribonucléoprotéine (RNP) est composée de deux composants principaux : une endonucléase Cas (communément Cas9 ou Cas12a) et un ARN guide synthétique spécifique au locus (ARNs)5. Ensemble, le Cas-RNP génère une rupture double brin (DSB) dans le locus désiré qui peut être réparée par l’un des deux mécanismes de réparation intrinsèques. Le mécanisme de réparation de l’assemblage d’extrémité non homologue (NHEJ) est sujet aux erreurs et entraîne souvent diverses insertions ou suppressions (indels) autour de l’ORD. Ces indels peuvent être délétères s’ils introduisent une mutation de décalage de trame ou un arrêt prématuré dans la séquence protéique résultante. Alternativement, le mécanisme de réparation dirigée par homologie (HDR) utilise un modèle de donneur avec des régions d’homologie entourant le site DSB pour réparer les dommages. Les chercheurs peuvent tirer parti du système HDR pour générer des modifications génomiques précises. Plus précisément, ils peuvent co-injecter une construction de donneur d’ADN double brin qui contient les modifications souhaitées ainsi que les régions d’homologie flanquant le site DSB dans le génome. L’économie d’échelle accrue pour ces composants CRISPR produits commercialement a considérablement réduit les obstacles au dépistage de plusieurs loci et à la mise en place d’efforts à plus grande échelle pour une édition précise du génome. Cependant, dans les modèles animaux à reproduction sexuée, un goulot d’étranglement majeur est l’identification et l’isolement des animaux mutants stables à la lignée germinale.
Le système modèle du poisson zèbre présente plusieurs qualités clés qui améliorent son utilisation dans les études génétiques inverses. Ils sont faciles à élever en grand nombre avec un équipement de base pour les logements aquatiques, et les femelles présentent une fécondité élevée toute l’année6. De plus, leur ponte externe et leur fécondation les rendent propices à la micro-injection de composants CRISPR/Cas. Le Cas-RNP est couramment injecté dans des embryons de poisson-zèbre au stade unicellulaire pour générer des DSB / réparation qui sont, en théorie, hérités par toutes les cellules filles. Cependant, les génomes diploïdes nécessitent deux événements DSB/réparation pour mutagène les deux chromosomes homologues. De plus, bien que le Cas-RNP soit injecté au stade monocellulaire, le DSB/réparation peut ne pas se produire avant des points ultérieurs du développement. Ensemble, ces facteurs contribuent à la nature mosaïque des poissons injectés de F0. Une pratique courante consiste à croiser les poissons injectés par F0 et à dépister la descendance F1 pour détecter les indels / modifications spécifiques. Cependant, comme tous les poissons injectés par F0 ne possèdent pas de mutations germinales, cette pratique entraîne de nombreux croisements improductifs qui ne génèrent pas la modification souhaitée. Le dépistage de la lignée germinale F0 plutôt que du tissu somatique F1 augmente la probabilité d’isoler la modification de la lignée germinale souhaitée et réduit le nombre d’animaux requis dans ce processus.
Le sperme peut facilement être recueilli à partir de poisson-zèbre injecté par F0 sans avoir besoin d’euthanasie. Cette caractéristique permet la cryoconservation et la redérivation de stocks de spermatozoïdes congelés7 mais peut également être exploitée pour dépister, identifier et isoler rapidement les porteurs germinales des mutations génomiques souhaitées 8,9. Brocal et al. (2016) ont précédemment décrit une méthode basée sur le séquençage pour le dépistage des modifications de la lignée germinale chez le poisson-zèbre mâleinjecté F0 10. Bien qu’utile pour identifier les allèles mutés présents dans la lignée germinale, cette approche peut devenir coûteuse à haut débit et peut ne pas être accessible à tous les laboratoires. En revanche, le protocole actuel offre une stratégie accessible et rentable basée sur l’électrophorèse pour identifier les modifications de la lignée germinale. Plus précisément, ce protocole décrit une méthode robuste pour le dépistage et l’isolement des mutations germinales à des loci spécifiques en utilisant l’électrophorèse sur gel d’agarose à haute résolution. En outre, ce protocole décrit une stratégie similaire pour identifier l’intégration réussie d’un concept de donneur contenant des modifications spécifiques. Comme toujours, si des modifications spécifiques sont souhaitées, les stratégies basées sur le séquençage peuvent être exécutées en tandem avec le protocole décrit ci-dessous. Bien que ce protocole soit spécifique au système modèle du poisson zèbre, ces principes devraient être adaptables à tout modèle dans lequel la collecte de spermatozoïdes est une procédure de routine. Ensemble, ces stratégies permettront d’identifier les mâles injectés de F0 avec des indels / modifications germinales qui peuvent être résolus sur un gel après une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) standard et / ou un digestion de restriction.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une méthode pour caractériser rapidement des modifications présumées du génome ou des mutations ciblées à l’aide de la technologie CRISPR-Cas par analyse ciblée sur les génomes des spermatozoïdes masculins F0. Ce protocole devrait se prêter à d’autres modèles animaux où le sperme est facilement disponible pour l’échantillonnage sans euthanasie. Cette méthode augmentera le débit de criblage pour les modifications souhaitées et est particulièrement utile pour identifier les rar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Anna Hindes de la faculté de médecine de l’Université de Washington pour ses efforts initiaux dans l’obtention d’ADN génomique de sperme de bonne qualité en utilisant la méthode du coup chaud. Ce travail a été financé par l’Institut national de l’arthrite et des maladies musculo-squelettiques et cutanées des National Institutes of Health sous attribution (R01AR072009 à R.S.G.).
Materials
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
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| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
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| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
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| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
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| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
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| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
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