Eine neuartige Methode zur Bestimmung der longitudinalen antibakteriellen Aktivität von wirkstofffreisetzenden Materialien
Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Bewertung der antibakteriellen Wirksamkeit eines antibiotikafreisetzenden Polymers vor, um eine prophylaktische klinische Anwendung unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen ATP-basierten lumineszierenden mikrobiellen Viabilitätstests in Echtzeit zu simulieren. Diese Methode ermöglicht die Überwachung der longitudinalen Aktivität von wirkstofffreisetzenden Materialien und kann weitgehend für die Erprobung antimikrobieller Wirkstoffverabreichungsplattformen angepasst werden.
Abstract
Ultrahochmolekulares Polyethylen (UHMWPE) wird häufig in der Totalendoprothetik von Gelenken als tragende Oberfläche verwendet. Periprothetische Gelenkinfektionen, von denen die meisten kurz nach dem Gelenkersatz auftreten, machen fast 25 % der gesamten Knierevisionsoperationen aus, und die vollständige Ausrottung bakterieller Infektionen stellt eine große Herausforderung dar. Ein vielversprechender Weg, dieses Problem anzugehen, besteht darin, die lokale anhaltende Abgabe von Antibiotikakonzentrationen sicherzustellen, die ausreichen, um die Bakterien zu hemmen und die routinemäßige systemische Antibiotikaprophylaxe zu unterstützen. Es wird zunehmend an der Entwicklung effizienter lokaler Geräte zur Verabreichung von Medikamenten geforscht. Obwohl etablierte antibakterielle Testmethoden für Arzneimittel verwendet werden können, um die antibakterielle Wirksamkeit von wirkstofffreisetzenden Materialien zu testen, fehlt es ihnen an Echtzeit- und Längsschnittdaten zur antibakteriellen Wirksamkeit, die mit den Elutionsprofilen von Antibiotika aus diesen Geräten korreliert werden können. Hier berichten wir über eine direkte und vielseitige Methodik zur Bestimmung der antibakteriellen Wirksamkeit von antibiotikafreisetzenden UHMWPE-Implantaten. Diese Methodik kann als Plattform verwendet werden, um Bakterienkulturen zu jedem Zeitpunkt eines langwierigen Experiments zu vermeiden, und kann auch an andere lokale Geräte zur Verabreichung von Medikamenten angepasst werden.
Introduction
Arthrose ist eine bedeutende degenerative Erkrankung, von der weltweit 500 Millionen Erwachsene betroffen sind1. Der Goldstandard bei der Behandlung von Arthritis im Endstadium ist der totale Gelenkersatz, der bis 2030 allein in den Vereinigten Staaten jährlich bei über 2 Millionen Patienten durchgeführt werden soll2, wobei auch die weltweite Nachfrage enorm steigt 3,4. Bei diesem Verfahren werden die Gelenkknorpelflächen der Gelenke durch tragende Kunststoffe aus Metall/Keramik und hochvernetztem ultrahochmolekularem Polyethylen (UHMWPE) ersetzt. Der totale Gelenkersatz verbessert die Lebensqualität von Patienten mit Arthritis erheblich5, aber eine erhebliche Komplikation, die die Leistungsfähigkeit der Implantate und die Zufriedenheit der Patienten gefährdet, ist die periprothetische Gelenkinfektion (PJI), die 15%-25% der Revisionsoperationen ausmacht6. Als Infektionsursache wird in den meisten Fällen die mikrobielle Kontamination des Implantatlagers während der Operation angenommen7. Die kontaminierende Population dehnt sich dann auf den Implantat- und Gewebeoberflächenaus 8. Das Immunsystem des Wirts wird als Reaktion darauf ausgelöst, aber die Wachstumsrate und die Biofilmbildung der kontaminierenden Organismen können es ihnen ermöglichen, den Immunzellen auszuweichen, was zu einem erhöhten Zytokinsturm und Chemokin führen kann, ohne dass die Bakterien ausgerottet werden 9,10,11. Die daraus resultierende tiefe Infektion des Knochens gefährdet die Fixierung und Leistungsfähigkeit des Implantats sowie die Gesundheit des Patienten12.
Staphylococcus aureus und Koagulase-negative Staphylokokken sind die vorherrschenden Erreger von PJI13. Der Schweregrad der Staphylokokkeninfektionen ist aufgrund ihrer erhöhten Resistenz gegen Antibiotika, der Biofilmbildung und der Fähigkeit, als kleine Kolonievarianten zu persistieren, hoch14,15,16. Implantatassoziierte Infektionen entstehen durch die Adhäsion von Mikroorganismen auf der Oberfläche des Implantats und die Bildung einer komplexen Biofilmmatrix, die es den Bakterien ermöglicht, schädlichen Immunfaktoren des Wirts und wirksamen Antibiotikakonzentrationen auszuweichen14,15,16. Konventionelle Behandlungsmethoden umfassen intravenöse und orale Antibiotikakombinationen über einen längeren Zeitraum17. Ein großer Nachteil dieses Ansatzes ist die geringe Bioverfügbarkeit des Arzneimittels an der Infektionsstelle und die Schwierigkeit, ausreichende Antibiotikakonzentrationen zu erreichen, um die Bakterien über den Behandlungszeitraum konsistent zu eliminieren, was häufig zu schlechten Ergebnissen führt18. Um diese Unzulänglichkeiten zu beheben, wurde ein voll funktionsfähiges, lokalisiertes, medikamentenfreisetzendes UHMWPE-Implantat entwickelt, das eine anhaltende Freisetzung wirksamer Antibiotikakonzentrationen in den Gelenkraum gewährleistet19. Die lokale Elution des medikamentenfreisetzenden Implantats wird als komplementäres Instrument verwendet, um das Wachstum und die Besiedlung von Bakterien zu verhindern, die nach der Entfernung des Implantats und dem Debridement des Gewebes verbleiben. In-vitro-antibakterielle Tests dieses antibiotikafreisetzenden UHMWPE können durchgeführt werden, indem das Material direkt mit den Bakterien inkubiert und die Bakterien durch die Spread-Plate-Methode quantifiziertwerden 20,21. Alternativ können Aliquote von Eluentenmedien gegen Bakterien getestet werden, wobei Methoden wie die Agarscheiben-Diffusionsmethode, Bouillon-Verdünnungsmethoden und Time-Kill-Testsverwendet werden 22. Alle diese Methoden beruhen auf einer Wachstumsbeobachtung ca. 16-18 h nach der Entnahme der Aliquots mittels Koloniezählung und Trübungsmessungen. Die Elution von Antibiotika aus solchen Geräten kann mit diesen In-vitro-Methoden longitudinal quantifiziert werden; Um jedoch den translationalen Wert dieser Konzentrationsprofile zu bestimmen, ist eine robuste Echtzeit-In-vitro-Methode zur Beurteilung der antibakteriellen Aktivität erforderlich.
Der in dieser Studie verwendete mikrobielle Viabilitätstest wurde für die Quantifizierung lebensfähiger Bakterien entwickelt, indem die Lumineszenz gemessen wird, die Adenosintriphosphat (ATP) entspricht, das aus einer lebenden Bakterienzelle freigesetzt wird, wobei eine Luciferin-Luciferase-basierte Nachweistechnologie verwendet wird. ATP, als Energiewährung lebender Zellen, dient als direkter Indikator für physiologisch lebensfähige Zellen. Das Reagenz führt eine Zelllyse durch, bei der ATP-Moleküle aus lebensfähigen Zellen freigesetzt werden, die dann in Form von Lumineszenz nachgewiesen werden. Diese Lumineszenz steht in direktem Zusammenhang mit dem Anteil lebensfähiger Bakterienzellen innerhalb der Probe23. Dabei handelt es sich um einen einfachen, vielseitigen, schnellen, auf Einzelreagenzien basierenden Echtzeit-Assay, der an eine Vielzahl von Assay-Designs und -Bedingungen mit grampositiven und gramnegativen Mikroorganismen angepasst werden kann. Hier berichten wir über eine Methode zur Bestimmung der antibakteriellen Aktivität von antibiotikafreisetzendem UHMWPE, das mit Labor- und klinischen Stämmen von S. aureus inkubiert wurde, unter Verwendung eines modifizierten Time-Kill-Assays, der auf dem mikrobiellen Viabilitätstest basiert (z. B. BacTiter Glo). Während die Methodik mit einem spezifischen Implantatmaterial und einer spezifischen orthopädischen Anwendung beschrieben wird, kann die Methode eine Plattform für die Erprobung anderer antibiotikafreisetzender Verabreichungsgeräte mit klinischen Anwendungen bieten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die lokalisierte, anhaltende Verabreichung von Antibiotika ist ein notwendiges Instrument bei der Behandlung periprothetischer Gelenkinfektionen. Systemische Antibiotika sind die primäre Strategie zur Ausrottung bakterieller Infektionen, und die lokale Elution wird als ergänzendes Instrument verwendet, um das Wachstum und die Besiedlung von Bakterien zu verhindern, die nach der Entfernung des Implantats und dem Debridement des Gewebes verbleiben. Das Ziel für die effektive Fläche unter der Kurve (Konzentration über einen bestimmten Zeitraum) für Antibiotika mit lokaler Verabreichung ist nicht gut verstanden. Die Elution von Antibiotika aus solchen Geräten kann in vitro longitudinal quantifiziert werden; Um jedoch den translationalen Wert dieser Konzentrationsprofile zu bestimmen, ist eine robuste In-vitro-Methode zur Beurteilung der antibakteriellen Aktivität erforderlich. In dieser Arbeit wird eine solche Echtzeitmethode beschrieben, um die antibakterielle Aktivität von medikamentenfreisetzendem UHMWPE zu bestimmen, das als Vorrichtung für die verzögerte Verabreichung bei Gelenkersatz verwendet werden soll.
Die Echtzeitüberwachung der bakteriellen Lebensfähigkeit ist ein entscheidender Parameter von Interesse, und konventionellen mikrobiologischen Methoden fehlt der Rahmen, um diesen spezifischen Aspekt der Studie zu berücksichtigen. Der in dieser Studie verwendete mikrobielle Viabilitätstest wurde für die Quantifizierung lebensfähiger Bakterien durch Messung der Lumineszenz entsprechend Adenosintriphosphat (ATP) entwickelt. Um die zeitabhängige Aktivität der aus den Implantatmaterialien eluierten Antibiotika direkt zu untersuchen, wurden drei verschiedene Stämme mit unterschiedlichen Antibiotikaempfindlichkeitsprofilen mit ihnen inkubiert. Die Begründung für die Verwendung von Labor- und klinischen Stämmen mit unterschiedlichen Resistenzen gegen Gentamicin und Vancomycin bestand darin, den Wirkungsbereich einer bestimmten Implantatformulierung zu verstehen. Darüber hinaus hängen die antibakterielle Aktivität und Wirksamkeit gegen diese unterschiedlichen Populationen vom Zeitpunkt der Verabreichung ab. Die Methode konzentriert sich auf die Durchführbarkeit einer Prophylaxe gegen diese Stämme, da >70% der periprothetischen Gelenkinfektionen durch die Kontamination der Wunde zum Zeitpunkt der Operation verursacht werden24.
Als Ausgangsinokulum für die Entwicklung dieser Methode wurde 1 x 105 KBE/ml verwendet. Für Tiermodelle wurden unterschiedliche kontaminierende Konzentrationen verwendet, obwohl nicht viel über die klinisch relevante Infektionslast für PJI bekannt ist. Tierinfektionsmodelle für PJI wurden routinemäßig mit 1 x 105 KBE etabliert, und ein ähnlicher Bereich wird häufig in standardisierten Methoden (CLSI) verwendet, um die antibakterielle Aktivität zu bestimmen25,26,27. Die Verwendung von 1 x 105 KBE/ml als anfängliche kontaminierende Konzentration ermöglichte es uns, sowohl die Wachstums- als auch die Eradikationsparameter gleichzeitig zu bewerten.
Herkömmlicherweise werden MHK-Werte für eine konstante Antibiotikakonzentration für eine bestimmte Anzahl von Bakterien bestimmt und zeigen nicht die Rate der antibakteriellen Wirkung. Aufgrund dieses Aspekts bieten MHK-Werte keine quantitative Differenzierung zur Beschreibung des antimikrobiellen Aktivitätsprofils28. Die Daten der aktuellen Methode unterstreichen den Vorteil, die stammabhängige Abtötungskinetik von Antibiotika zu bewerten, anstatt das MHK zu verwenden, um Dosierungsentscheidungen zu treffen. Mit dieser Methode war es möglich, sowohl das Ausmaß als auch die Geschwindigkeit zu unterscheiden, mit der die Implantatmaterialien auf die verschiedenen Dehnungen einwirkten. Gentamicin, das aus den Implantatmaterialstreifen eluiert wurde, war wirksam bei der Eradikation von L1163 in 1 Tag und bei der Eradikation von ATCC 12600 in 2-3 Tagen, aber es war unwirksam bei der Eradikation von L1101 (Abbildung 4). Neben der zu erwartenden fehlenden Aktivität der Gentamicin-Elution gegen L1101 (MHK >32 μg/ml) aufgrund der inhärenten Gentamicin-Resistenz (Abbildung 4C) wurde die Persistenz von Subpopulationen beobachtet, wenn sie Vancomycin ausgesetzt waren, für das L1101 eine mittlere Resistenz aufweist. Im Gegensatz dazu wurde L1163 in Gegenwart von Vancomycin-freisetzendem UHMWPE definitiv eliminiert, obwohl es eine ähnliche mittlere Resistenz gegen Vancomycin wie L1101 aufwies (für beide Stämme wurde ein MHK von 8 μg/ml beobachtet).
Die Beobachtungen, dass die Aktivitätsrate von Gentamicin gegenüber 12600 und L1163, die bei ähnlichen MHK-Werten gentamicinempfindlich sind (für beide Stämme wurde eine MHK von 1 μg/ml beobachtet), unterschiedlich war, sowie dass das Ausmaß der Aktivität von Vancomycin gegen die intermediärresistenten L1101 und L1163 unterschiedlich war (Abbildung 4A,B) unterstützte die Hypothese, dass diese Echtzeitmethode in Gegenwart des eluierenden Materials longitudinale Unterschiede in der Aktivität differenzieren könnte.
Neben dem translationalen Wert der Ergebnisse bei der Interpretation, wie wirksam eine bestimmte eluierte Konzentration gegen diese Bakterien sein kann, gibt es mehrere experimentelle methodische Vorteile. (1) Die Bakterienkonzentration wird sofort zu einem bestimmten Zeitpunkt bestimmt, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, bei denen die Bakterien in Brühe oder auf Agar für 18-24 h inkubiert werden, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen. Diese Wachstumsphase kann den Bakterien zusätzliche Zeit geben, sich von Antibiotikastress zu erholen, was eine zusätzliche mögliche Fehlerquelle/Variabilität darstellt. (2) Das Medium wird kontinuierlich ausgetauscht, während die Bakterien erhalten bleiben, was eher In-vivo-Bedingungen als statischen Bedingungen ähnelt. (3) Dieser Assay beinhaltet von Natur aus die Wirkstofffreisetzungskinetik des Implantats, was eine bessere Leistungsvorhersage ermöglicht. (4) Das Verfahren wurde unter Verwendung allgemein verfügbarer Verbrauchsmaterialien entwickelt, ohne dass spezielle oder teure Maschinen erforderlich sind.
Robuste In-vitro-Testmethoden zur Bewertung von Arzneimittelverabreichungsanwendungen sind erforderlich, bevor In-vivo-Tierstudien und klinische Studien durchgeführt werden. Dieser Assay kann modifiziert und angepasst werden, um verschiedene Ansätze und Wirkstoffverabreichungsplattformen wie Partikel, Gele, Filme und andere wirkstofffreisetzende Materialien zu berücksichtigen, um die Effizienz der bakteriellen Eradikation in einem simulierten In-vitro-Aufbau zu bestimmen. Modifikationen für den Probenaufbau können durchgeführt werden, indem in eine geeignete In-vitro-Mediumumgebung gewechselt wird, die nachweislich die Aktivität mehrerer Antibiotika beeinflusst29,30.
Die Methode ermöglicht auch die Bestimmung von praktikablen adhärenten Bakterien, was vielversprechend ist, da herkömmliche Methoden zur Bestimmung der minimalen Biofilm-Eradikationskonzentration zeitaufwändig sind und inkonsistente Ergebnisse liefern. Die Methode soll jedoch rigoros an Biofilmen getestet werden, um eine zuverlässige und robuste Methodik zur Bestimmung ihrer Sensitivität zu entwickeln. Die ATP-basierte Lumineszenzmethode könnte empfindlich genug sein, um lebensfähige Formen von Bakterien in Biofilmen einschließlich Persistern nachzuweisen, die auf einer Agarplatte als sichtbare Kolonien nachgewiesen werden können oder auch nicht. Zusammengenommen hat diese vielseitige Plattform das Potenzial, relevante Parameter zu integrieren, um Echtzeit-Beobachtungen über die antibakterielle und Anti-Biofilm-Aktivität von Medikamenten von Interesse aufzuzeichnen.
Die Wirksamkeit dieser Methode hängt von folgenden Aspekten ab:
Vorgegebene Elutionseigenschaften und Probengröße
Das Elutionsprofil des antibiotikafreisetzenden Materials kann in einem separaten Experiment vor dieser antibakteriellen Aktivitätsmessung identifiziert werden, so dass die Menge an Material, die für die aktive Durchführung des Experiments innerhalb einer vorgegebenen Zeit erforderlich ist, bestimmt werden kann.
Behälter- und Volumenbestimmung
Es ist wichtig, einen Aufbau zu entwickeln, bei dem das Medienvolumen des Experiments die gesamte Oberfläche desselben Materials aufnehmen kann und ein ausreichendes Volumen für die ungehinderte Freisetzung des Wirkstoffs von der wirkstoffbeladenen Oberfläche gewährleistet ist. Der verwendete Aufbau basierte auf früheren Experimenten, um “perfekte Senkenbedingungen” für diese hydrophilen Wirkstoffe zu gewährleisten, so dass ihre Diffusion nicht durch Löslichkeitsbeschränkungen behindert wird.
Eigenschaften von Nährmedien
Die Auswahl der Nährmedien sollte untersucht werden, um die Stabilität und die optimale Leistung des/der ausgewählten Arzneimittel(s) zu gewährleisten29. Kationenangepasste Mueller-Hinton-Bouillon (CAMHB), die in der Brühenverdünnungsmethode weit verbreitet ist, wurde verwendet, um die MHK bekannter Antibiotika zu bestimmen. Das Medium ermöglicht eine optimale Wirkstoffaktivität ohne die Interferenz der toxischen Sekundärmetabolitenakkumulation31. Das Assay-Reagenz wurde getestet und als stabil in verschiedenen Arten von Medien beschrieben, einschließlich solcher mit Serumkomponenten23,28. Obwohl die relativen Werte der Lumineszenzeinheit zwischen verschiedenen Medien variieren können, wurde gezeigt, dass die Komponenten des Mediums den Assaynicht beeinträchtigen 32,33. Das experimentelle Volumen wurde weiter auf 1,5 ml optimiert, was nahe am Volumen der Synovialflüssigkeit in einem erwachsenen Kniegelenksraumliegt 34.
Temperaturstabilität für den Assay
Die Handhabung und Zugabe des lumineszierenden Reagenzes zum Assay soll über alle Experimente hinweg einheitlich erfolgen. Temperaturänderungen verändern die Empfindlichkeit des Assays, daher ist es wichtig, das Reagenz 2 h lang bei Raumtemperatur zu inkubieren, bevor es zu den Bakterien gegeben wird23.
Inkubationszeit der Reagenzien
Die Lumineszenz des Reagenzes nimmt mit der Zeit ab. Das Lumineszenzsignal hat eine Halbwertszeit von über 30 min, die weitgehend vom Medium und der Art des im Experiment verwendeten Bakteriums abhängt23. Darüber hinaus führen Unterschiede in der Inkubationszeit (d. h. die Zeit zwischen der Zugabe des Reagenzes zu den Bakterien und dem Ablesen der Lumineszenz) zu inkonsistenten Messwerten für die gleiche Bakterienkonzentration. Es wurde ein Unterschied von 5 % im Lumineszenzsignal beobachtet, wenn es innerhalb von 1 Minute nach der Inkubationszeit von 5 Minuten gemäß den Anweisungen des Herstellers eingenommen wurde (ergänzende Abbildung 2). Unter Berücksichtigung dieser Daten wurden die Lumineszenzmesswerte während der gesamten Studie innerhalb von 1 Minute aufgezeichnet, um sicherzustellen, dass der Signalverlust nicht mehr als 5 % betrug. Darüber hinaus ist es wichtig, die Anzahl der Proben pro Platte zu begrenzen, um den Fehler zu reduzieren, der durch den Lumineszenzabfall von der ersten Vertiefung zur letzten Vertiefung entsteht.
Aufrechterhaltung der Bakterienpopulation während der gesamten Studie
Die Methode versuchte, die Wirkstoffclearance und den synovialen Volumenumsatz zu modellieren, indem das verbrauchte Medium zu jedem Zeitpunkt kontinuierlich von der Bakterienpopulation getrennt wurde, indem eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation bei 10.000 x g für 10 min35 verwendet wurde. Dieser kritische Schritt stellt die Sedimentation aller lebensfähigen und nicht lebensfähigen Bakterienzellen sicher. Darüber hinaus werden die sedimentierten Bakterien gleichmäßig in frischem MHB rekonstituiert und in den Spritzenaufbau übertragen, was die vollständige Übertragung der betroffenen mikrobiellen Population zurück in den Versuchsaufbau erleichtert. Die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit dieser Methode hängt stark von der Simulation der anhaltenden Exposition von Antibiotika gegenüber der mikrobiellen Population ab, die aus dem ursprünglichen Inokulum stammt.
Eine wesentliche Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass es sich um einen semistatischen Assay handelt, der die Halbwertszeiten des Arzneimittels und den kontinuierlichen Synovialumsatz nicht genau simuliert. Der kontinuierliche Austausch des Mediums kompensiert diese Einschränkung jedoch teilweise. Die Sensitivität des mikrobiellen Viabilitätstests war stammabhängig und reichte von 1 x 102-1 x 104 KBE/ml, was die Nachweisfähigkeit einschränkt. Darüber hinaus muss für jeden Organismus eine Standardkurve gezeichnet werden, da der Stammtyp zur Empfindlichkeit und Leistung des lumineszierenden Reagenzes beiträgt. Sowohl die Wachstumsdynamik der Bakterien als auch die Aktivität des verwendeten Wirkstoffs können durch die Mediumkomponenten beeinflusst werden, was weiter untersucht werden sollte.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch den National Institutes of Health Grant Nr. AR077023 (R01) und durch das Harris Orthopaedic Laboratory finanziert. Die Autoren danken Dr. Kerry Laplante und ihrem Team an der University of Rhode Island für die Bereitstellung der klinischen Stämme L1101 und L1163.
Materials
| 96 well plates – polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs | Corning, NY, USA | CLS3922-100EA | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich, Germany | ||
| ATCC 12600 | American Type culture Collection, VA, USA | ||
| BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay | Promega Corporation, USA | G8231 | |
| BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) | Becton-Dickinson, USA | BD 211825 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL | BD, USA | 309657 | |
| BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G | BD, USA | 305122 | |
| BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton-Dickinson, USA | B12322 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) | Becton-Dickinson, USA | DF0369-17-6 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| Boric Acid | Fisher Chemical, NJ, USA | ||
| Branson 1800 ultrasonic bath | Emerson, MO, USA | ||
| Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid | Fisher Scientific, USA | 08-757-100D | |
| Gentamicin Sulfate | Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China | ||
| Greiner UV-Star 96 well plates | Sigma Aldrich, Germany | M3812-40EA | |
| Hydraulic press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| L1101 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| L1163 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| LSE benchtop shaking incubator | Corning, NY, USA | ||
| Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical | Fisher Scientific, NJ, USA | A454-1 | |
| Napco CO2 6000 | Thermo Scientific, MA, USA | ||
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents | Fisher Scientific, USA | BP24384 | |
| Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) | Sigma Aldrich, Germany | P1378-5g | |
| Plate reader (Synergy H1 | Biotek, VT, USA | ||
| press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| shaker Innova 2100 | New Brunswick Scientific, NJ, USA | ||
| ShopBot D2418 | ShopBot Tools, Inc., NC, USA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich, Germany | ||
| Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water | Fisher Scientific, USA | 23-751628 | |
| UHMWPE | GUR1020, Celanese, TX, USA | ||
| Vancomycin Hydrochloride | Fagron, The Netherlands | 804148 | |
| WAB Turbula | WAB Turbula, Switzerland |
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