薬物溶出物質の縦断抗菌活性を測定するための新しい方法

1. 試薬の調製 ミューラーヒントンブロス(MHB)調製:22 gの陽イオン調整MHBを1 Lの脱イオン水に溶解します。培地を121°C、15ポンドの圧力で20分間オートクレーブし、ボトルのキャップが緩いことを確認します。調製した滅菌液を使用時まで4°Cで保存する。 トリプシン大豆寒天(TSA)製剤:20 gのTSA粉末を500 mLの脱イオン水に溶解します。寒天混合物を121°C、15ポンドで20分間オートクレーブします。滅菌培地を55°Cの水浴に移し、溶融寒天の温度を下げます。冷やした寒天を滅菌ペトリ皿(~15mL)に注ぎ、固化させます。固化した寒天プレートは結露しないように逆さまに保管してください。 トリプシン大豆ブロス(TSB)製剤:15 gのTSB粉末を500 mLの脱イオン水に溶解します。ブロス混合物を121°C、15ポンドで20分間オートクレーブします。調製した滅菌液を使用時まで4°Cで保存する。 リン酸緩衝生理食塩水(PBS):オートクレーブは、滅菌使用前に121°Cおよび15ポンドで20分間1x PBSを市販購入しました。 微生物生存率アッセイ試薬の調製:アッセイの内容物を室温に平衡化します。10 mLのバッファーを凍結乾燥発光試薬粉末と混合し、調製した試薬を1 mLアリコートとして-20°Cで保存します。各時点の前に、光感受性試薬を解凍し、室温に戻します。 硫酸ゲンタマイシンストック溶液:硫酸ゲンタマイシン(GS)80 mgを1x PBSの10 mLに溶解します。薬液を徹底的にボルテックスし、8 mg/mL GSストック溶液を得ます。 塩酸バンコマイシン原液:塩酸バンコマイシン粉末10 mgを10 mLの脱イオン水に完全に溶解し、1 mg / mLストック溶液を得ます。 ホウ酸緩衝液:24.7 g(0.4 M)のホウ酸を900 mLの脱イオン水に溶解します。50%(w / v)水酸化ナトリウム溶液で溶液のpHを10.4に調整します。この工程にさらに、脱イオン水を加えて1Lにします。 O-プタルジアルデヒド試薬(OPA):0.2 gのOPAを1 mLのメタノールに溶解します。19 mLの0.4 Mホウ酸緩衝液(pH 10.4)をOPA溶液に加えます。OPA-ホウ酸混合物に0.4 mLの2-メルカプトエタノールを加えます。試薬バイアルをアルミホイルで覆い、調製後2〜3日まで使用するために4°Cで保存します。注意: 皮膚、目、衣服との接触を避けてください。OPAおよび2メルカプトエタノール試薬の取り扱いは、適切な個人用保護具を着用しながら、適切な排気換気を備えたヒュームフードの下でのみ実行する必要があります。.蒸気、ほこり、またはエアロゾルを吸い込まないでください。 2.バージンおよび薬物を装填したUHMWPEの調製 硫酸ゲンタマイシンおよび塩酸バンコマイシン粉末を篩(孔径75μm)で各2gふるいにかけ、真空オーブン(<0.1気圧)中で45°Cで18〜24時間脱水する。 メカニカルミキサーを使用して、脱水薬物をUHMWPE粉末と7%w / w(抗生物質1.12 g + UHMWPE14.88 g)で容器内で5分間ブレンドします。 アルミニウム青銅のカスタム金型(85 mm x 50 mm)をステンレス鋼のインサートプレートで180°Cに対流式オーブンで1時間予熱します。プレスのプラテンを170°Cに予熱します。 配合した粉末を金型に加え、10MPaで圧縮し、170°Cで10分間、続いて10MPaで45分間水冷サイクルを行った。 油圧プレスを使用して、成形されたUHMWPEブロック(~3.5 mm)をプレスから取り外します。 コンピューター化された数値制御(CNC)を使用してブロックの上面と底面をフライス加工し、表面の凹凸や汚染物質を取り除きます。 CNCを使用してブロックを3 mm x 5 mm x 20 mmのストリップにカットします。 研究の対照として記載されているのと同じ方法論を使用して、処女UHMWPE(抗生物質を追加せずに)を準備します。 補足図1:UHMWPEサンプルの成形に使用した金型の部品。 (A)ステンレス鋼インサートプレート;(b)金型キャビティ;(c)プランジャー;(D)バックプレート このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 3. 薬物溶出性UHMWPEの溶出速度の決定 ルアーロックと25Gニードルを備えた3 mLシリンジに3 mm x 5 mm x 20 mmのストリップを置きます。 シリンジに脱イオン水を満たし、シリンジを複数回反転させてストリップを洗浄します。 シリンジに2 mLの目盛りまでの脱イオン水を入れます。 シリンジセットアップを室温で100rpmのシェーカーに置きます。 各時点(6時間、1日、2日、3日、1週間)で、溶離液を2 mLバイアルに回収します。 各時点で、シリンジに脱イオン水を満たし、シリンジを反転させてストリップを洗浄します。溶液を廃棄し、2 mLの目盛りまでシリンジに脱イオン水を満たして、次の時点まで実験を続行します。 4.バンコマイシン濃度の決定 脱イオン水中のバンコマイシン濃度をピーク吸収波長280nmで分光光度的に検出します。 UV 96ウェルプレートに100 μLの1 mg/mLストック溶液を加え、100 μLの脱イオン水を使用して段階希釈して、6段階の既知の濃度(1 mg/mL〜0.03125 mg/mL)を得ることにより、既知の濃度範囲の標準を準備します。 100 μLの溶離液をUVクリアな96ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーを使用して280 nmでの濃度を測定します。 対応する吸光度値に対して既知の薬物濃度をプロットすることにより、検量線を生成します。溶離液中の未知薬物濃度は、検量線によって生成された一次方程式を使用して計算されます。 濃度に溶離液容量(~1.7 mL)を掛けて、薬物量を決定します。 前のすべての時点からの薬物放出を合計することにより、ある時点での累積薬物放出(mg)を計算します。 薬物放出をストリップの表面積(3.5cm 2)に正規化して、インプラントの平方センチメートル(cm2)あたりの累積薬物放出を決定します。 5. OPAタグ付け法によるゲンタマイシン濃度の測定 27 OPAアッセイを実行するためのGS標準溶液を調製します。1 mLの80 μg/mL GS溶液を遠沈管に移します。 さらに5本の遠心チューブに500 μLのPBSを加えます。 これらのチューブで段階希釈を行い、80 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、および2.5 μg/mLのGS濃度を取得します。これらは、アッセイのキャリブレーションソリューションとして機能します。 透明な96ウェルプレートで、80 μLのPBSをウェルA-1に、80 μLのキャリブレーション溶液をウェルA-2からA-7に昇順濃度で加えます。これは、アッセイの内部キャリブレーションとして機能します。 各サンプル80 μLを3連の空のウェルに追加し、同じ96ウェルプレートで分析します。ウェルプレートあたりのサンプル数を<50に制限して、サンプルにOPA溶液を添加するタイミングがすべてのサンプルでほぼ同じになるようにし、蒸発を回避します。 すべての標準物質とサンプル溶液にOPA試薬を追加します。ヒュームフード内で、25 mLの試薬リザーバーにメタノールを充填します。 8 mLのメタノールと1 mLの調製したOPA溶液を2番目の試薬リザーバーに追加します(セクション1.8)。上下にピペッティングして溶液を完全に混合します。 マルチチャンネル100 μLマイクロピペットを使用して、最初のリザーバーから96ウェルプレート内のすべてのサンプル含有ウェルに48 μLのメタノールを追加します。 このステップにさらに、2番目のリザーバーからの72 μLの希釈OPA溶液を96ウェルプレートのすべてのサンプル含有ウェルに追加します。ウェルプレートを室温で10分間インキュベートします。 10分間インキュベーションした直後にマイクロプレートリーダーを用いて蛍光強度(励起340 nm、発光455 nm)を測定した。 GSの濃度がわかっている溶液の強度測定値を使用して検量線をプロットします。直線を追加して最適適合を決定し、対応する方程式を生成します。 既知の薬物濃度を対応する吸光度値に対してプロットすることによって生成された検量線から溶離液中の薬物濃度を計算します。 濃度に溶離液容量(~1.7 mL)を掛けて、薬物質量を計算します。 前のすべての時点からの薬物放出を合計することにより、ある時点での累積薬物放出(mg)を決定します。 薬物放出をストリップの表面積(3.5cm 2)に正規化して、インプラントの平方センチメートル(cm2)あたりの累積薬物放出を決定します。 6.バクテリアの準備 注:この研究では、次の 黄色ブドウ球菌 株が使用されました:タイプ株12600、臨床株L1101およびL1163(ロードアイランド大学のケリーラプラント博士から入手)。これらの株の感受性プロファイルを 表1に示す。 細菌株 ゲンタマイシンマイク バンコマイシンMIC ATCC 12600 ≤1 μg/mL (センシティブ) ≤0.5 μg/mL (センシティブ) L1101 (臨床株) ≥16 μg/mL (耐性) 8 μg/mL (中間体) L1163 (臨床株) ≤1 μg/mL (センシティブ) 8 μg/mL (中間体) 表1:対照および臨床 黄色ブドウ球菌 株の抗生物質感受性プロファイル。 注意: 細菌培養と懸濁液の取り扱いを含むすべての手順は、クラスII、タイプA2バイオセーフティキャビネット内のBSL-2ラボスペースで実行されました。 細菌ストックを-80°CからTSAプレートに解凍して、 黄色ブドウ球菌の増殖を促進します。プレートを35°Cで一晩静置インキュベートします。 一晩増殖させた寒天平板培養物から2〜3コロニーを1 mLの滅菌TSBに移し、35°Cで一晩静置インキュベートします。 100 μLの細菌を透明な96ウェルプレートに移し、600 nmの吸光度を測定することにより濁度を分光光度測定します。 発光アッセイを使用して生菌数を決定する前に、滅菌MHBを使用して細菌を10,000倍に希釈します。 7. リアルタイム微生物生存率アッセイの実施 白色不透明底96ウェルプレートを用いて発光ベースのアッセイを行う。 100 μLの希釈細菌懸濁液を、セクション1.5で調製した100 μLのアッセイ試薬と混合します。 調製した96ウェルプレートの上にアルミホイルで覆われた蓋を置き、100rpmで振とうしながら5分間インキュベートする。 Gen5 3.11ソフトウェアの次の設定を使用して、マイクロプレートリーダーで発光をすぐに測定します。[ 新規 ] をクリックして、[ タスク マネージャー ] ウィンドウでプロトコルを設定します。 [プレートタイプ]のドロップダウンメニューで[Costar 96ホワイト不透明]を選択します。 「ステップ>アクションの選択」メニューの下にある「読み取り」をクリックします。 [読み取り方法]ウィンドウ内の発光をクリックします。エンドポイント/キネティックファイバーオプションと発光ファイバーオプションは、それぞれ読み取りタイプと光学タイプで選択し続けます。OKをクリックします。 [読み取りステップ]ウィンドウの設定を維持します(ゲイン= 135、積分時間= 1秒、読み取り高さ= 4.5 mm)。OKをクリックします。 プレートレイアウトウィンドウが実行の準備ができているように見えます。ロードプレートウィンドウの[蓋を使用]チェックボックスをオンにして、[ OK]をクリックします。 96ウェルプレートを機械に入れて、発光値を読み取ります。 8. 各細菌株の発光対生菌数標準曲線の生成 注:セクション6で説明されている方法論に従って、すべての 黄色ブドウ球菌 株を培養および列挙します。 標準物質として機能するように連続希釈された細菌懸濁液を調製する。濁度を分光光度測定することにより一晩増殖した細菌懸濁液を列挙する。 6,000 × g で5分間遠心分離して細菌をペレット化し、ペレットを滅菌MHBに再懸濁して濃度を1 x 109 CFU/mLに調整します。 900 μLのMHBを使用して100 μLのニート懸濁液を希釈し、10倍の段階希釈を実行して1 x 101 CFU/mLに到達します。 セクション7に記載されているように、調製された細菌懸濁液に対して発光アッセイを実行します。 実験のブランクコントロールとして滅菌MHBを使用し、試験サンプルの発光値からブランク発光値を差し引きます。 対数(CFU)を対数(発光)に対してプロットして、検量線を生成します。式とR2 値を記録します。 研究全体を通して、菌株固有の式を使用して発光値に対応するCFU/mLを決定します。 9.時間依存抗菌活性研究のセットアップ 図1:実験セットアップの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 1 mLのTSBブロスで細菌を一晩培養します。 一晩増殖した細菌懸濁液を滅菌MHBで105 CFU / mLに希釈し(セクション6)、実験開始前に発光ユニットを使用して生菌数を確認します(セクション7)。 バージンUHMWPEおよび薬物装填UHMWPEストリップ(3 mm x 5 mm x 10 mm、セクション2の溶出研究用に準備されたストリップの半分の寸法)を3 mLシリンジに入れます。 105 CFU / mLを含むMHBを、付属の針を通して1.5 mLマーク(MHBの1.35 mLに相当)までシリンジに引き込みます(図1:ステップ1)。 シリンジのセットアップを振とうインキュベーター(100 rpm)に置き、6時間、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、および7日目の指示された時点まで37°Cで行います(図1:ステップ2)。 指示された各時点で、シリンジのセットアップを取り出し、100 μLの細菌懸濁液についてセクション7に従ってリアルタイムの微生物生存率アッセイを実行します(図1:ステップ3-4)。 6時間、1日目、2日目、3日目、および7日目の時点で生菌数を決定します。対応する検量線を使用して、発光単位からCFU/mLを決定します。 TSAプレート上でスプレッドプレート法を実行し、35°Cで一晩インキュベートすることにより、検出限界以下の発光値を示したサンプルに生菌が存在しないことを確認します。翌日、コロニーの存在を確認します。 残りの細菌懸濁液を10,000 × g で10分間遠心分離し、使用済み培地を静かに吸引します。薬剤の抗菌作用によりペレットが目視で観察されないチューブの場合は、見えないペレットが乱れないように、チューブ内に100μLを残します(図1:ステップ5)。 ペレット化した細菌を新鮮なMHBに再懸濁し、付属の針を介して細菌懸濁液を同じシリンジセットアップに引き戻します(図1:ステップ6)。 10. UHMWPE表面の付着菌の定量 7日目の研究終了後、シリンジのセットアップからバージンUHMWPEおよび薬物負荷UHMWPE表面を取得します。 表面を1.5 mLチューブに移し、1 mLの滅菌PBSですすいでください(3回)。 1mLの滅菌PBSで40分間表面を超音波処理する。セクション7に記載されているように、超音波処理されたサンプルの100μLで発光アッセイを実行することによって、付着細菌の生存率を決定します。