Une nouvelle méthode pour déterminer l’activité antibactérienne longitudinale de matériaux à élution médicamenteuse

1. Préparation des réactifs Préparation de bouillon Mueller-Hinton (MHB) : Dissoudre 22 g de MHB ajusté aux cations dans 1 L d’eau désionisée. Autoclaver le média à 121 °C et 15 lb de pression pendant 20 min, en s’assurant que la bouteille est bien bouchée. Conserver le bouillon stérile préparé à 4 °C jusqu’à utilisation. Préparation de gélose tryptique au soja (TSA) : Dissoudre 20 g de poudre de TSA dans 500 mL d’eau désionisée. Autoclaver le mélange de gélose à 121 °C et 15 lb pendant 20 min. Transférer le milieu stérile dans un bain-marie à 55 °C pour abaisser la température de la gélose fondue. Verser la gélose préparée refroidie sur des boîtes de Petri stériles (~15 mL) et laisser se solidifier. Entreposer les plaques de gélose solidifiées inversées pour éviter la condensation. Préparation tryptique de bouillon de soya (BST) : Dissoudre 15 g de poudre de BST dans 500 mL d’eau désionisée. Autoclaver le mélange de bouillon à 121 °C et 15 lb pendant 20 min. Conserver le bouillon stérile préparé à 4 °C jusqu’à utilisation. Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) : Autoclave acheté commercialement 1x PBS à 121 °C et 15 lb pendant 20 minutes avant utilisation stérile. Préparation du réactif de dosage de viabilité microbienne : Équilibrer le contenu de l’essai à température ambiante. Mélanger 10 mL de tampon avec la poudre de réactif luminescent lyophilisé et conserver le réactif préparé à −20 °C sous forme d’aliquotes de 1 mL. Avant chaque point temporel, décongelez le réactif photosensible et amenez-le à température ambiante. Solution mère de sulfate de gentamicine : Dissoudre 80 mg de sulfate de gentamicine (GS) dans 10 mL de 1x PBS. Vortex la solution médicamenteuse à fond pour obtenir une solution mère de 8 mg/mL de GS. Solution mère de chlorhydrate de vancomycine : Dissoudre soigneusement 10 mg de poudre de chlorhydrate de vancomycine dans 10 mL d’eau désionisée pour obtenir une solution mère de 1 mg/mL. Solution tampon d’acide borique : Dissoudre 24,7 g (0,4 M) d’acide borique dans 900 mL d’eau désionisée. Ajuster le pH de la solution à 10,4 avec une solution d’hydroxyde de sodium à 50 % (p/v). Suite à cette étape, ajoutez de l’eau désionisée pour obtenir 1 L. Réactif O-pthaldialdéhyde (OPA) : Dissoudre 0,2 g d’OPA dans 1 mL de méthanol. Ajouter 19 mL de tampon d’acide borique 0,4 M (pH 10,4) à la solution d’OPA. Ajouter 0,4 mL de 2-mercaptoéthanol au mélange OPA-acide borique. Couvrir le flacon de réactif dans une feuille d’aluminium et conserver à 4 °C pour une utilisation jusqu’à 2-3 jours après la préparation.ATTENTION : Évitez tout contact avec la peau, les yeux et les vêtements. La manipulation de l’OPA et des 2 réactifs au mercaptoéthanol ne doit être effectuée que sous une hotte munie d’une ventilation par aspiration appropriée, tout en portant un équipement de protection individuelle approprié. Évitez de respirer les vapeurs, la poussière ou les aérosols. 2. Préparation de l’UHMWPE vierge et chargé de médicaments Tamiser 2 g de sulfate de gentamicine et de poudre de chlorhydrate de vancomycine avec un tamis (taille des pores de 75 μm) et déshydrater à 45 °C dans une étuve à vide (<0,1 atm) pendant 18-24 h. Mélanger le médicament déshydraté avec la poudre UHMWPE à 7% p/p (1,12 g d’antibiotique + 14,88 g d’UHMWPE) dans un récipient à l’aide d’un mélangeur mécanique pendant 5 min. Préchauffez un moule sur mesure en bronze d’aluminium (85 mm x 50 mm) avec des plaques d’insertion en acier inoxydable à 180 °C dans un four à convection pendant 1 h. Préchauffer les plaques de la presse à 170 °C. Ajouter la poudre mélangée dans le moule et comprimer à 10 MPa, 170 °C pendant 10 min, suivi d’un cycle de refroidissement par eau de 45 min à 10 MPa. Retirez le bloc UHMWPE moulé (~3,5 mm) de la presse à l’aide d’une presse hydraulique. Fraisez les surfaces supérieure et inférieure du bloc à l’aide d’une commande numérique informatisée (CNC) pour éliminer les irrégularités de surface et les contaminants. Coupez le bloc en bandes de 3 mm x 5 mm x 20 mm à l’aide de la CNC. Préparer l’UHMWPE vierge (sans ajout d’antibiotiques) en utilisant la même méthodologie que celle décrite comme témoin pour l’étude. Figure supplémentaire 1 : Parties du moule utilisées pour mouler les échantillons UHMWPE. A) Plaque d’insertion en acier inoxydable; (B) cavité de moisissure; (C) piston; (D) plaque arrière Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. 3. Détermination de la cinétique d’élution de l’UHMWPE à élution médicamenteuse Placez une bande de 3 mm x 5 mm x 20 mm dans une seringue de 3 ml munie d’un verrou Luer et d’une aiguille de 25 g. Lavez la bandelette en remplissant la seringue avec de l’eau désionisée et en inversant la seringue plusieurs fois. Remplissez la seringue avec de l’eau désionisée jusqu’à la graduation de 2 mL. Placez la seringue sur un agitateur à 100 tr/min à température ambiante. À chaque point temporel (6 h, 1 jour, 2 jours, 3 jours, 1 semaine), prélever l’éluant dans un flacon de 2 mL. À chaque point de temps, lavez la bandelette en remplissant la seringue d’eau désionisée et en retournant la seringue. Jeter la solution et remplir la seringue d’eau désionisée jusqu’à la graduation de 2 ml pour poursuivre l’expérience jusqu’au prochain point temporel. 4. Détermination de la concentration en vancomycine Détecter la concentration de vancomycine par spectrophotométrie dans l’eau désionisée à une longueur d’onde d’absorption maximale de 280 nm. Préparer des étalons de plage de concentration connus en ajoutant 100 μL de solution mère de 1 mg/mL à la plaque UV 96 puits et en diluant en série avec 100 μL d’eau désionisée pour obtenir six niveaux de concentrations connues (1 mg/mL à 0,03125 mg/mL). Transférer 100 μL des éluants sur des plaques à 96 puits claires aux UV et déterminer la concentration à 280 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Générer une courbe d’étalonnage en traçant les concentrations connues du médicament par rapport aux valeurs d’absorbance correspondantes. Calculer la concentration inconnue de médicament dans l’éluant à l’aide de l’équation linéaire générée par la courbe d’étalonnage. Déterminer la masse du médicament en multipliant la concentration par le volume d’éluant (~1,7 mL). Calculez la libération cumulative de médicament (mg) à un moment donné en additionnant la libération de médicament à partir de tous les points temporels précédents. Normaliser la libération du médicament à la surface de la bandelette (3,5 cm 2) pour déterminer la libération cumulative de médicament par centimètre carré (cm2) de l’implant. 5. Détermination de la concentration en gentamicine par la méthode d’étiquetage OPA 27 Préparer les solutions étalons GS pour effectuer le test OPA.Transvaser 1 mL de la solution GS à 80 μg/mL dans un tube à centrifuger. Ajouter 500 μL de PBS à cinq autres tubes à centrifuger. Effectuer une dilution en série avec ces tubes pour obtenir des concentrations de GS de 80 μg/mL, 40 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL et 2,5 μg/mL. Ceux-ci servent de solutions d’étalonnage pour le test. Dans une plaque transparente de 96 puits, ajouter 80 μL de PBS au puits A-1 et 80 μL des solutions d’étalonnage aux puits A-2 à A-7 en concentration croissante. Cela sert d’étalonnage interne pour le test. Ajouter 80 μL de chaque échantillon dans les puits vides en triple exemplaire pour être analysé dans la même plaque de 96 puits. Limiter le nombre d’échantillons par plaque de puits à 50 < de sorte que le moment de l’ajout de la solution d’OPA aux échantillons soit approximativement le même pour tous les échantillons et pour éviter l’évaporation. Ajouter le réactif OPA à toutes les normes et solutions d’échantillonnage.Dans une hotte, remplir un réservoir de réactif de 25 ml avec du méthanol. Ajouter 8 mL de méthanol et 1 mL de la solution d’OPA préparée dans un deuxième réservoir de réactif (section 1.8). Bien mélanger la solution en tuyautant de haut en bas. À l’aide d’une micropipette multicanal de 100 μL, ajouter 48 μL de méthanol du premier réservoir à tous les puits contenant des échantillons dans la plaque de 96 puits. À la suite de cette étape, ajouter 72 μL de solution d’OPA diluée du deuxième réservoir à tous les puits contenant des échantillons dans la plaque de 96 puits. Incuber la plaque de puits pendant 10 min à température ambiante. Mesurer l’intensité de fluorescence (excitation de 340 nm, émission de 455 nm) à l’aide d’un lecteur de microplaques immédiatement après l’incubation de 10 minutes. Tracer la courbe d’étalonnage en utilisant les lectures d’intensité pour les solutions avec des concentrations connues de GS. Ajoutez une ligne linéaire pour déterminer le meilleur ajustement et générer l’équation correspondante. Calculer la concentration du médicament dans l’éluant à partir des courbes d’étalonnage générées en traçant les concentrations connues du médicament par rapport aux valeurs d’absorbance correspondantes. Calculer la masse du médicament en multipliant la concentration par le volume d’éluant (~1,7 mL). Déterminez la libération cumulative de médicament (mg) à un moment donné en additionnant la libération de médicament à partir de tous les points temporels précédents. Normaliser la libération du médicament à la surface de la bandelette (3,5 cm 2) pour déterminer la libération cumulative de médicament par centimètre carré (cm2) de l’implant. 6. Préparation des bactéries REMARQUE : Les souches de S. aureus suivantes ont été utilisées dans cette étude : souche type 12600, souches cliniques L1101 et L1163 (obtenues du Dr Kerry LaPlante de l’Université du Rhode Island). Les profils de sensibilité de ces souches sont présentés dans le tableau 1. Souches bactériennes Gentamicine MIC CMI de vancomycine ATCC 12600 ≤1 μg/mL (sensible) ≤0,5 μg/mL (sensible) L1101 (souche clinique) ≥16 μg/mL (résistant) 8 μg/mL (intermédiaire) L1163 (souche clinique) ≤1 μg/mL (sensible) 8 μg/mL (intermédiaire) Tableau 1 : Profils de sensibilité aux antibiotiques des souches témoins et cliniques de S. aureus. ATTENTION : Toutes les étapes impliquant la manipulation de cultures bactériennes et de suspensions ont été effectuées dans un espace de laboratoire BSL-2 dans une enceinte de biosécurité de classe II, type A2. Décongeler les stocks bactériens de −80 °C sur des plaques de TSA pour faciliter la croissance de S. aureus. Incuber statiquement les plaques pendant une nuit à 35 °C. Transférer deux à trois colonies des cultures sur plaques de gélose cultivées pendant la nuit dans 1 mL de BST stérile, puis incuber statiquement pendant la nuit à 35 °C. Transférer 100 μL de bactéries dans une plaque transparente de 96 puits pour mesurer spectrophotométriquement la turbidité en déterminant l’absorbance à 600 nm. Diluer les bactéries 10 000x à l’aide de MHB stérile avant de déterminer le nombre de bactéries viables à l’aide du test luminescent. 7. Réalisation de l’essai de viabilité microbienne en temps réel Effectuez le test basé sur la luminescence à l’aide de plaques blanches opaques à fond opaque à 96 puits. Mélanger 100 μL de suspensions bactériennes diluées avec 100 μL de réactif d’essai préparé dans la section 1.5. Placez un couvercle recouvert de papier d’aluminium sur la plaque préparée à 96 puits et incuber pendant 5 minutes en secouant 100 tr/min. Mesurez immédiatement la luminescence avec un lecteur de microplaques en utilisant les paramètres suivants du logiciel Gen5 3.11.Cliquez sur Nouveau pour configurer un protocole dans la fenêtre Gestionnaire des tâches . Sélectionnez Costar 96 blanc opaque dans le menu déroulant pour Type de plaque. Cliquez sur Lire dans le menu Sélectionner les étapes > les actions . Cliquez sur Luminescence dans la fenêtre Méthode de lecture. Conservez les options Endpoint/kinetic et Luminescence fiber sélectionnées sous type de lecture et type d’optique, respectivement. Cliquez sur OK. Conservez les paramètres dans la fenêtre Étape de lecture (gain = 135 ; temps d’intégration = 1 seconde ; hauteur de lecture = 4,5 mm). Cliquez sur OK. La fenêtre de disposition des plaques apparaît prête pour l’exécution. Cochez la case Utiliser le couvercle dans la fenêtre de la plaque de chargement, puis cliquez sur OK. Placez la plaque de 96 puits dans la machine pour lire les valeurs de luminescence. 8. Génération d’une courbe standard de luminescence par rapport au comptage viable pour chaque souche bactérienne NOTE : Cultiver et énumérer toutes les souches de S. aureus selon la méthodologie décrite à la section 6. Préparer des suspensions bactériennes diluées en série pour servir d’étalons.Énumérer la suspension bactérienne cultivée pendant la nuit en mesurant spectrophotométriquement la turbidité. Centrifuger à 6 000 × g pendant 5 minutes pour granuler les bactéries, et remettre la pastille en suspension dans du MHB stérile pour ajuster la concentration à 1 x 109 UFC/mL. Diluer 100 μL de suspension pure en utilisant 900 μL de MHB et effectuer une dilution en série 10 fois pour atteindre 1 x 101 UFC/mL. Effectuer le test de luminescence sur les suspensions bactériennes préparées comme décrit à la rubrique 7. Utiliser le MHB stérile comme témoin à blanc pour l’expérience et soustraire la valeur de luminescence à blanc des valeurs de luminescence de l’échantillon d’essai. Tracez le log (CFU) par rapport au log (luminescence) pour générer une courbe standard. Notez l’équation et la valeur R2 . Déterminer l’UFC/mL correspondant aux valeurs de luminescence à l’aide de l’équation spécifique à la souche tout au long de l’étude. 9. Configuration de l’étude de l’activité antibactérienne dépendante du temps Figure 1 : Représentation schématique de la configuration expérimentale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Culture de la bactérie pendant la nuit dans 1 mL de bouillon de BST. Diluer la suspension bactérienne cultivée pendant la nuit à 105 UFC/mL dans du MHB stérile (section 6) et vérifier le nombre de bactéries viables à l’aide des unités de luminescence avant le début de l’expérience (section 7). Placer les bandelettes UHMWPE vierges et les bandelettes UHMWPE chargées de médicaments (3 mm x 5 mm x 10 mm, soit la moitié de la dimension des bandelettes préparées pour les études d’élution de la section 2) dans une seringue de 3 mL. Aspirer le MHB contenant 10 5 UFC/mL dans la seringue à l’aide de l’aiguille fixée jusqu’à la marque de1,5 mL, ce qui équivaut à 1,35 mL de MHB (Figure 1 : Étape 1). Placez la seringue sur un incubateur à agitation (100 tr/min) à 37 °C jusqu’aux points temporels indiqués de 6 h, Jour 1, Jour 2, Jour 3, Jour 4, Jour 5, Jour 6 et Jour 7 (Figure 1 : Étape 2). À chaque point temporel indiqué, retirez la configuration de la seringue et effectuez un test de viabilité microbienne en temps réel conformément à la section 7 sur 100 μL de suspension bactérienne (Figure 1 : Étape 3-4). Déterminez le nombre de bactéries viables pour les points temporels 6 h, Jour 1, Jour 2, Jour 3 et Jour 7. Déterminer l’UFC/mL à partir des unités de luminescence à l’aide de la courbe standard correspondante. Vérifier l’absence de bactéries viables dans les échantillons dont les valeurs de luminescence étaient inférieures à la limite de détection en appliquant la méthode de la plaque étalée sur des plaques TSA et en incubant à 35 °C pendant une nuit. Vérifiez la présence de colonies le lendemain. Centrifuger la suspension bactérienne restante à 10 000 × g pendant 10 min, puis aspirer doucement le milieu usé. Dans le cas des tubes dans lesquels les pastilles ne sont pas observées visuellement en raison de l’activité antibactérienne des médicaments, laisser 100 μL dans le tube pour vous assurer que la pastille invisible n’est pas dérangée (Figure 1 : Étape 5). Remettez en suspension les bactéries granulées dans du MHB frais et retirez la suspension bactérienne dans la même seringue à l’aide de l’aiguille fixée (Figure 1 : Étape 6). 10. Quantification des bactéries adhérentes sur la surface de l’UHMWPE Récupérez les surfaces vierges UHMWPE et UHMWPE chargées de médicaments de la seringue après la fin de l’étude le jour 7. Transférer les surfaces dans des tubes de 1,5 mL et rincer avec 1 mL de PBS stérile (trois fois). Sonicer la surface pendant 40 min dans 1 mL de PBS stérile. Déterminer la viabilité des bactéries adhérentes en effectuant un essai de luminescence sur 100 μL de l’échantillon soniqué, comme décrit à la section 7.