JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Новый метод определения продольной антибактериальной активности материалов с лекарственным покрытием

Published: March 03, 2023
doi:
10.3791/64641
, ,
1Harris Orthopaedics Laboratory,Massachusetts General Hospital, 2Department of Orthopaedic Surgery,Harvard Medical School

Summary

Здесь мы представляем протокол для оценки антибактериальной эффективности полимера с антибиотическим покрытием для имитации профилактического клинического применения с использованием коммерчески доступного анализа жизнеспособности люминесцентных микроорганизмов на основе АТФ в реальном времени. Этот метод позволяет контролировать продольную активность материалов с лекарственным покрытием и может быть широко адаптирован для тестирования платформ доставки антимикробных лекарств.

Abstract

Сверхвысокомолекулярный полиэтилен (СВМПЭ) широко используется при тотальном эндопротезировании суставов в качестве несущей поверхности. Перипротезные инфекции суставов, большинство из которых возникают вскоре после замены сустава, составляют почти 25% от общего числа операций по ревизии коленного сустава, и полное искоренение бактериальной инфекции представляет собой серьезную проблему. Перспективным способом решения этой проблемы является обеспечение местной устойчивой доставки концентраций антибиотиков, достаточных для ингибирования бактерий для поддержки рутинной системной антибиотикопрофилактики. Расширяются исследования по разработке эффективных местных устройств доставки лекарств. Несмотря на то, что установленные методы антибактериального тестирования лекарств могут быть использованы для проверки антибактериальной эффективности материалов с лекарственным покрытием, они отсутствуют с точки зрения предоставления данных об антибактериальной эффективности в режиме реального времени и продольных данных, которые могут быть коррелированы с профилями элюирования антибиотиков из этих устройств. Здесь мы сообщаем о прямой и универсальной методологии определения антибактериальной эффективности имплантатов СВМПЭ с антибактериальным покрытием. Эта методология может быть использована в качестве платформы для предотвращения бактериального посева в каждый момент длительного эксперимента, а также может быть адаптирована к другим локальным устройствам доставки лекарств.

Introduction

Остеоартрит является серьезным дегенеративным заболеванием, от которого страдают 500 миллионов взрослых во всем мире1. Золотым стандартом лечения терминальной стадии артрита является полная замена суставов, которая, по прогнозам, будет выполняться более чем у 2 миллионов пациентов ежегодно только в Соединенных Штатах к 2030 году, при этом глобальный спрос также значительно увеличится 3,4. Процедура включает в себя замену шарнирных хрящевых поверхностей соединений несущими синтетическими материалами из металла/керамики и высокосшитого сверхвысокомолекулярного полиэтилена (СВМПЭ). Тотальная замена суставов значительно улучшает качество жизни пациентов, страдающих артритом5, но значительным осложнением, которое ставит под угрозу работоспособность имплантатов и удовлетворенность пациентов, является перипротезная инфекция суставов (PJI), на которую приходится 15-25% ревизионных операций6. Считается, что причиной инфекции в большинстве случаев является микробное загрязнение места имплантации во время операции7. Затем загрязняющая популяция расширяется на поверхности имплантата и тканей8. Иммунная система хозяина запускается в ответ, но скорость роста и образование биопленки загрязняющих организмов могут позволить им уклоняться от иммунных клеток, что может привести к усилению цитокинового и хемокинового шторма без уничтожения бактерий 9,10,11. Возникающая в результате глубокая инфекция кости ставит под угрозу фиксацию и работоспособность имплантата, а также здоровье пациента12.

Золотистый стафилококк и коагулазоотрицательные стафилококки являются преобладающими возбудителями PJI13. Тяжесть стафилококковых инфекций высока из-за их повышенной устойчивости к антибиотикам, образования биопленки и способности персистировать в виде вариантов небольших колоний14,15,16. Инфекции, связанные с имплантатом, возникают из-за адгезии микроорганизмов к поверхности имплантата и создания сложной матрицы биопленки, которая позволяет бактериям уклоняться от вредных иммунных факторов хозяина и эффективных концентраций антибиотиков14,15,16. Традиционные методы лечения включают внутривенные и пероральные комбинации антибиотиков в течение длительного периода17. Основным недостатком этого подхода является низкая биодоступность препарата в очаге инфекции и трудность достижения достаточных концентраций антибиотиков для последовательного уничтожения бактерий в течение периода лечения, что часто приводит к неблагоприятным результатам18. Для устранения этих недостатков был разработан полностью функциональный локализованный имплантат СВМПЭ с лекарственным покрытием, обеспечивающий устойчивое высвобождение эффективных концентраций антибиотиков в суставную щель19. Местное элюирование из имплантата с лекарственным покрытием используется в качестве дополнительного инструмента для предотвращения роста и колонизации любых бактерий, оставшихся после удаления имплантата и санации ткани. Антибактериальное тестирование in vitro этого СВМПЭ с антибиотическим покрытием может быть выполнено путем инкубации материала непосредственно с бактериями и количественного определения бактерий методомразбрасывания пластин 20,21. В качестве альтернативы, аликвоты элюентных сред могут быть испытаны против бактерий с использованием таких методов, как метод диффузии агарового диска, методы разбавления бульона и испытание на замедление22. Все эти методы основаны на наблюдении за ростом примерно через 16-18 часов после сбора аликвот с помощью подсчета колоний и измерения мутности. Элюирование антибиотиков из таких устройств может быть продольно количественно определено с использованием этих методов in vitro; Однако для определения трансляционного значения этих профилей концентрации необходим надежный метод in vitro в режиме реального времени для оценки антибактериальной активности.

Анализ микробной жизнеспособности, используемый в этом исследовании, был разработан для количественного определения жизнеспособных бактерий путем измерения люминесценции, соответствующей аденозинтрифосфату (АТФ), высвобождаемому из живой бактериальной клетки, с использованием технологии обнаружения на основе люциферина-люциферазы. АТФ, как энергетическая валюта живых клеток, служит прямым индикатором физиологически жизнеспособных клеток. Реагент осуществляет лизис клеток, который высвобождает молекулы АТФ из жизнеспособных клеток, которые затем обнаруживаются в виде люминесценции. Эта люминесценция имеет прямую корреляцию с долей жизнеспособных бактериальных клеток в образце23. Это простой, универсальный, быстрый, основанный на одном реагенте анализ в режиме реального времени, который может быть адаптирован к различным конструкциям и условиям анализа как с грамположительными, так и с грамотрицательными микроорганизмами. Здесь мы сообщаем о методе определения антибактериальной активности СВМПЭ с антибиотическим покрытием в режиме реального времени, инкубированного с лабораторными и клиническими штаммами S. aureus , с использованием модифицированного анализа замедленного уничтожения, основанного на анализе микробной жизнеспособности (например, BacTiter Glo). В то время как методология описана с конкретным материалом имплантата и конкретным ортопедическим применением, метод может обеспечить платформу для тестирования других устройств доставки с антибиотическим покрытием с клиническим применением.

Protocol

1. Приготовление реагентов Приготовление бульона Мюллера-Хинтона (MHB): Растворите 22 г MHB с отрегулированной катионами в 1 л деионизированной воды. Автоклавируйте среду при температуре 121 °C и давлении 15 фунтов в течение 20 минут, убедившись, что бутылка неплотно закрыта. Приготовленный стерильный бульон хранить при температуре 4 °C до использования. Приготовление триптического соевого агара (TSA): растворите 20 г порошка TSA в 500 мл деионизированной воды. Автоклавируйте агаровую смесь при температуре 121 °C и 15 фунтов в течение 20 минут. Перенесите стерильную среду на водяную баню с температурой 55 °C, чтобы снизить температуру расплавленного агара. Остывший приготовленный агар вылейте на стерильные чашки Петри (~ 15 мл) и дайте ему застыть. Храните затвердевшие агаровые пластины перевернутыми, чтобы избежать образования конденсата. Приготовление триптического соевого бульона (БСЭ): растворите 15 г порошка БСЭ в 500 мл деионизированной воды. Автоклавируйте бульонную смесь при температуре 121 °C и 15 фунтов в течение 20 минут. Приготовленный стерильный бульон хранить при температуре 4 °C до использования. Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS): Автоклав коммерчески приобрел 1x PBS при 121 ° C и 15 фунтов в течение 20 минут перед стерильным использованием. Приготовление реагента для анализа микробной жизнеспособности: Уравновесьте содержимое анализа до комнатной температуры. Смешайте 10 мл буфера с порошком лиофилизированного люминесцентного реагента и храните приготовленный реагент при -20 ° C в виде аликвот объемом 1 мл. Перед каждым моментом времени размораживайте светочувствительный реагент и доводите его до комнатной температуры. Исходный раствор гентамицина сульфата: растворите 80 мг гентамицина сульфата (GS) в 10 мл 1x PBS. Тщательно встряхните раствор препарата, чтобы получить исходный раствор GS 8 мг / мл. Исходный раствор гидрохлорида ванкомицина: тщательно растворите 10 мг порошка гидрохлорида ванкомицина в 10 мл деионизированной воды, чтобы получить исходный раствор 1 мг / мл. Буферный раствор борной кислоты: растворите 24,7 г (0,4 М) борной кислоты в 900 мл деионизированной воды. Отрегулируйте рН раствора до 10,4 с помощью 50% (мас./об.) раствора гидроксида натрия. В дополнение к этому шагу добавьте деионизированную воду, чтобы она достигла 1 л. Реагент O-пталдиальдегида (OPA): растворите 0,2 г OPA в 1 мл метанола. Добавьте 19 мл 0,4 М буфера борной кислоты (рН 10,4) в раствор OPA. Добавьте 0,4 мл 2-меркаптоэтанола в смесь OPA-борной кислоты. Накройте флакон с реагентом алюминиевой фольгой и храните при температуре 4 ° C для использования до 2-3 дней после приготовления.ВНИМАНИЕ: Избегайте контакта с кожей, глазами и одеждой. Обращение с реагентами OPA и 2 меркаптоэтанола должно выполняться только под вытяжным шкафом с соответствующей вытяжной вентиляцией при ношении надлежащих средств индивидуальной защиты. Избегайте вдыхания паров, пыли или аэрозолей. 2. Приготовление первичных и лекарственных препаратов СВМПЭ Просеивают по 2 г порошков гентамицина сульфата и ванкомицина гидрохлорида с помощью сита (размер пор 75 мкм) и обезвоживают при 45 °C в вакуумной печи (<0,1 атм) в течение 18-24 ч. Смешайте обезвоженный препарат с порошком СВМПЭ в количестве 7% по массе (1,12 г антибиотика + 14,88 г СВМПЭ) в контейнере с помощью механического миксера в течение 5 мин. Разогрейте изготовленную на заказ форму из алюминиевой бронзы (85 мм x 50 мм) со вставными пластинами из нержавеющей стали до 180 °C в конвекционной печи в течение 1 часа. Разогрейте плиты пресса до 170 °C. Добавьте смешанный порошок в форму и сожмите при давлении 10 МПа, 170 °C в течение 10 минут, после чего следует 45-минутный цикл водяного охлаждения при 10 МПа. Извлеките формованный блок СВМПЭ (~3,5 мм) из пресса с помощью гидравлического пресса. Фрезеруйте верхнюю и нижнюю поверхности блока с помощью компьютеризированного числового программного управления (ЧПУ), чтобы удалить любые неровности поверхности и загрязнения. Разрежьте блок на полосы размером 3 мм x 5 мм x 20 мм с помощью ЧПУ. Приготовьте первичный СВМПЭ (без добавления антибиотиков), используя ту же методологию, которая описана в качестве контроля для исследования. Дополнительный рисунок 1: Части пресс-формы, используемые для формования образцов СВМПЭ. (A) Пластина для вставки из нержавеющей стали; (B) полость пресс-формы; с) плунжер; (D) задняя панель Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 3. Определение кинетики элюирования СВМПЭ с лекарственным покрытием Поместите полоску размером 3 мм x 5 мм x 20 мм в шприц объемом 3 мл с замком Люера и иглой 25 G. Промойте полоску, наполнив шприц деионизированной водой и несколько раз перевернув шприц. Наполните шприц деионизированной водой до градуировки 2 мл. Поместите шприц на шейкер при 100 об/мин при комнатной температуре. В каждый момент времени (6 ч, 1 день, 2 дня, 3 дня, 1 неделя) собирайте элюент во флакон объемом 2 мл. В каждый момент времени промывайте полоску, наполняя шприц деионизированной водой и переворачивая шприц. Откажитесь от раствора и наполните шприц деионизированной водой до градуировки 2 мл, чтобы продолжить эксперимент до следующего момента. 4. Определение концентрации ванкомицина Спектрофотометрически обнаруживают концентрацию ванкомицина в деионизированной воде при пиковой длине волны поглощения 280 нм. Подготовьте стандарты известного диапазона концентраций, добавив 100 мкл исходного раствора 1 мг/мл в УФ-96-луночную пластину и последовательно разбавляя с использованием 100 мкл деионизированной воды для получения шести уровней известных концентраций (от 1 мг/мл до 0,03125 мг/мл). Перенесите 100 мкл элюентов на 96-луночные пластины, очищающие от ультрафиолета, и определите концентрацию на длине волны 280 нм с помощью считывателя микропланшетов. Создайте калибровочную кривую, построив график известных концентраций лекарственного средства в соответствии с соответствующими значениями поглощения. Рассчитайте неизвестную концентрацию лекарственного средства в элюенте, используя линейное уравнение, сгенерированное калибровочной кривой. Определите массу препарата, умножив концентрацию на объем элюента (~1,7 мл). Рассчитайте кумулятивное высвобождение лекарственного средства (мг) в определенный момент времени, суммировав высвобождение лекарственного средства за все предыдущие моменты времени. Нормализуют высвобождение лекарственного средства на площадь поверхности полоски (3,5 см 2 ), чтобы определить кумулятивное высвобождение препарата на сантиметр в квадрате (см2 ) имплантата. 5. Определение концентрации гентамицина методом мечения OPA 27 Подготовьте стандартные растворы GS для проведения анализа OPA.Перенесите 1 мл раствора GS 80 мкг/мл в центрифужную пробирку. Добавьте 500 мкл PBS еще в пять центрифужных пробирок. Проведите последовательное разведение с помощью этих пробирок для получения концентраций GS 80 мкг/мл, 40 мкг/мл, 20 мкг/мл, 10 мкг/мл, 5 мкг/мл и 2,5 мкг/мл. Они служат калибровочными растворами для анализа. В прозрачную 96-луночную пластину добавьте 80 мкл PBS в лунку A-1 и 80 мкл калибровочных растворов в лунки A-2 – A-7 в возрастающей концентрации. Это служит внутренней калибровкой для анализа. Добавьте 80 мкл каждого образца в пустые лунки в трех экземплярах для анализа на той же 96-луночной пластине. Ограничьте количество проб на скважину до <50 таким образом, чтобы время добавления раствора OPA к образцам было примерно одинаковым для всех образцов и во избежание испарения. Добавьте реагент OPA во все стандарты и образцы растворов.В вытяжном шкафу заполните резервуар для реагентов объемом 25 мл метанолом. Добавьте 8 мл метанола и 1 мл приготовленного раствора OPA во второй резервуар с реагентом (раздел 1.8). Тщательно перемешайте раствор, пипеткой вверх и вниз. С помощью многоканальной микропипетки объемом 100 мкл добавьте 48 мкл метанола из первого резервуара во все пробосодержащие лунки в 96-луночной пластине. В дополнение к этому этапу добавьте 72 мкл разбавленного раствора OPA из второго резервуара во все пробосодержащие скважины в 96-луночной пластине. Выдерживайте в лунке 10 мин при комнатной температуре. Измерьте интенсивность флуоресценции (возбуждение 340 нм, излучение 455 нм) с помощью считывателя микропланшетов сразу после 10-минутной инкубации. Постройте градуировочную кривую, используя показания интенсивности для растворов с известными концентрациями ГС. Добавьте линейную линию, чтобы определить наилучшее соответствие, и сгенерируйте соответствующее уравнение. Рассчитайте концентрацию лекарственного средства в элюенте по калибровочным кривым, полученным путем построения графика зависимости известных концентраций лекарственного средства от соответствующих значений поглощения. Рассчитайте массу препарата, умножив концентрацию на объем элюента (~1,7 мл). Определите кумулятивное высвобождение лекарственного средства (мг) в определенный момент времени, суммировав высвобождение лекарственного средства за все предыдущие моменты времени. Нормализуют высвобождение лекарственного средства на площадь поверхности полоски (3,5 см 2 ), чтобы определить кумулятивное высвобождение препарата на сантиметр в квадрате (см2 ) имплантата. 6. Подготовка бактерий ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались следующие штаммы S. aureus : штамм типа 12600, клинические штаммы L1101 и L1163 (полученные от доктора Керри ЛаПланте в Университете Род-Айленда). Профили чувствительности этих штаммов представлены в таблице 1. Штаммы бактерий Гентамицин ВПК Ванкомицин МПК ATCC 12600 ≤1 мкг/мл (чувствительный) ≤0,5 мкг/мл (чувствительный) L1101 (клинический штамм) ≥16 мкг/мл (резистентный) 8 мкг/мл (промежуточный) L1163 (клинический штамм) ≤1 мкг/мл (чувствительный) 8 мкг/мл (промежуточный) Таблица 1: Профили чувствительности к антибиотикам контрольных и клинических штаммов S. aureus. ВНИМАНИЕ: Все этапы, связанные с обращением с бактериальными культурами и суспензиями, выполнялись в лабораторном помещении BSL-2 в шкафу биобезопасности класса II, типа A2. Разморозьте запасы бактерий при температуре -80 ° C на пластинах TSA, чтобы облегчить рост S. aureus. Статически инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 35 °C. Перенесите две-три колонии из выращенных в ночное время культур агаровых пластинок в 1 мл стерильного БСЭ и статически инкубируйте в течение ночи при 35 ° C. Перенесите 100 мкл бактерий на прозрачную 96-луночную пластину для спектрофотометрического измерения мутности путем определения поглощения при 600 нм. Разбавьте бактерии в 10 000 раз с помощью стерильного MHB, прежде чем определять количество жизнеспособных бактерий с помощью люминесцентного анализа. 7. Проведение анализа микробной жизнеспособности в режиме реального времени Проведите анализ на основе люминесценции, используя белые 96-луночные пластины с непрозрачным дном. Смешайте 100 мкл разбавленной бактериальной суспензии со 100 мкл анализирующего реагента, приготовленного в разделе 1.5. Накройте подготовленную пластину на 96 лунок крышкой, покрытой алюминиевой фольгой, и выдерживайте 5 минут при встряхивании при 100 об/мин. Немедленно измерьте свечение с помощью считывателя микропланшетов, используя следующие настройки в программном обеспечении Gen5 3.11.Нажмите кнопку Создать , чтобы настроить протокол в окне диспетчера задач . Выберите Costar 96 white непрозрачный в раскрывающемся меню для Plate Type (Тип пластины). Нажмите « Прочитать » в меню «Выбрать шаги > действия ». Нажмите « Люминесценция » в окне «Метод чтения ». Оставьте выбранными параметры « Конечная точка/кинетическое волокно» и «Люминесцентное волокно » в разделах «Тип считывания» и «Тип оптики» соответственно. Нажмите на кнопку ОК. Оставьте настройки в окне « Шаг чтения » (коэффициент усиления = 135; время интегрирования = 1 с; высота считывания = 4,5 мм). Нажмите на кнопку ОК. Появится окно макета пластины, готовое к запуску. Установите флажок «Использовать крышку» в окне загрузочной пластины и нажмите «ОК». Поместите пластину с 96 лунками в машину, чтобы считывать значения люминесценции. 8. Создание стандартной кривой зависимости люминесценции от жизнеспособности для каждого бактериального штамма ПРИМЕЧАНИЕ: Культивируйте и перечислите все штаммы S. aureus в соответствии с методологией, описанной в разделе 6. Приготовьте серийно разбавленные бактериальные суспензии, которые будут служить стандартами.Перечислите выращенную за ночь бактериальную суспензию путем спектрофотометрического измерения мутности. Центрифугу при 6000 × г в течение 5 минут для гранулирования бактерий и ресуспендирование гранул в стерильном MHB, чтобы отрегулировать концентрацию до 1 x 109 КОЕ / мл. Разбавьте 100 мкл чистой суспензии, используя 900 мкл MHB, и выполните 10-кратное последовательное разведение до достижения 1 x 101 КОЕ/мл. Проведите люминесцентный анализ на приготовленных бактериальных суспензиях, как описано в разделе 7. Используйте стерильный MHB в качестве пустого элемента управления для эксперимента и вычтите значение пустой люминесценции из значений люминесценции тестового образца. Постройте логарифм (КОЕ) на бревно (люминесценцию), чтобы создать стандартную кривую. Запишите уравнение и значение R2 . Определите КОЕ/мл, соответствующее значениям люминесценции, используя уравнение для конкретной деформации на протяжении всего исследования. 9. Установка исследования антибактериальной активности, зависящая от времени Рисунок 1: Схематическое изображение экспериментальной установки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Культивируйте бактерии в течение ночи в 1 мл бульона TSB. Разбавьте выращенную в течение ночи бактериальную суспензию до 105 КОЕ/мл в стерильном MHB (раздел 6) и проверьте жизнеспособное количество бактерий с помощью единиц люминесценции до начала эксперимента (раздел 7). Поместите первичные полоски СВМПЭ и СВМПЭ с лекарственным средством (3 мм x 5 мм x 10 мм, половина размера полосок, подготовленных для исследований элюирования в разделе 2) в шприц объемом 3 мл. Наберите MHB, содержащий 10 5 КОЕ/мл, в шприц через прикрепленную иглу до отметки1,5 мл, что эквивалентно 1,35 мл MHB (рис. 1: Шаг 1). Поместите установку шприца в встряхивающий инкубатор (100 об/мин) при температуре 37 °C до указанных моментов времени: 6 часов, день 1, день 2, день 3, день 4, день 5, день 6 и день 7 (рис. 1: шаг 2). В каждый указанный момент времени вынимайте шприц и выполняйте анализ микробной жизнеспособности в режиме реального времени в соответствии с разделом 7 на 100 мкл бактериальной суспензии (рис. 1: Шаг 3-4). Определите количество жизнеспособных бактерий в течение 6 часов, 1-го, 2-го, 3-го и 7-го дней. Определите КОЕ/мл по единицам люминесценции, используя соответствующую стандартную кривую. Проверьте отсутствие жизнеспособных бактерий в образцах, которые показали значения люминесценции ниже предела обнаружения, выполнив метод разбрасывания пластин на планшетах TSA и инкубируя при 35 ° C в течение ночи. Проверьте наличие колоний на следующий день. Центрифугируйте оставшуюся бактериальную суспензию при дозе 10 000 × г в течение 10 мин и осторожно аспирируйте отработанную среду. Для пробирок, в которых гранулы визуально не наблюдаются из-за антибактериальной активности лекарств, оставьте 100 мкл в пробирке, чтобы убедиться, что невидимые гранулы не нарушаются (рис. 1: Шаг 5). Ресуспендируйте гранулированные бактерии в свежем MHB и втяните бактериальную суспензию в ту же установку шприца через прикрепленную иглу (рис. 1: шаг 6). 10. Количественное определение адгезивных бактерий на поверхности СВМПЭ Извлеките первичный СВМПЭ и поверхности СВМПЭ, нагруженные лекарственными средствами, из установки шприца после завершения исследования на 7-й день. Перенесите поверхности в пробирки объемом 1,5 мл и промойте 1 мл стерильного PBS (три раза). Обработайте поверхность ультразвуком в течение 40 мин в 1 мл стерильного PBS. Определите жизнеспособность адгезивных бактерий, выполнив анализ люминесценции на 100 мкл образца, обработанного ультразвуком, как описано в разделе 7.

Representative Results

В соответствии с протоколом СВМПЭ формовали гентамицином и ванкомицином в соотношении 7% по массе и элюировали в деионизированную воду. Концентрацию препарата в элюенте из материала определяли через 6 ч, 1 день, 2 дня, 3 дня и 1 неделю. Высвобождение лекарственного средства из ванкомицина и гентамицин-нагруженного СВМПЭ продемонстрировало взрывное высвобождение через 6 ч с последующей устойчивой скоростью высвобождения с концентрацией высвобождения, превышающей минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) до 7 дней (рис. 2, таблица 2). Перед антибактериальным исследованием была построена стандартная кривая для корреляции единиц люминесценции с КОЕ/мл бактерий для каждого штамма S. aureus (ATCC 12600, L1101 и L1163). Соответствующие значения log (люминесценции) были нанесены на логарифм (КОЕ/мл) для создания стандартной кривой (рис. 3). Рассчитанные значения R2 составили 0,997, 0,996 и 0,994 для ATCC 12600, L1101 и L1163 соответственно, что указывает на сильное соответствие диапазону концентраций. Полученное уравнение впоследствии использовалось для расчета жизнеспособности бактерий во всех экспериментах. ATCC 12600 и L1101 продемонстрировали предел обнаружения в диапазоне 1 x 102-1 x 103 КОЕ/мл. С другой стороны, было показано, что предел обнаружения штамма L1163 составляет 1 x 104 КОЕ/мл. Анализ антибактериальной активности, зависящий от времени, проводили с использованием 1 x 105 КОЕ/мл в качестве исходного посева для 12600, L1163 и L1101, которые подвергались воздействию 7% материалов с лекарственным покрытием в течение 1 недели. В каждый момент времени (6 ч, 1 день, 2 дня, 3 дня, 1 неделя) среда обновлялась, и бактериальная популяция повторно суспендировалась. Воздействие бактерий на последующее высвобождение лекарств из материала продолжалось до следующего момента времени. СВМПЭ с 7% мас. ванкомицином и СВМПЭ с 7% мас. гентамицином продемонстрировали снижение >3log для восприимчивого ATCC 12600, начиная с 6 ч, и полная эрадикация (отсутствие роста колонии) наблюдалась в конце 3 дней (рис. 4A). Для чувствительного к гентамицину и промежуточного штамма ванкомицина L1163 оба материала с лекарственным покрытием вызывали снижение >3log через 6 часов, и полная эрадикация (отсутствие роста колоний) наблюдалась на 1-й день эксперимента (рис. 4B). Для гентамицин-резистентного и ванкомицин-промежуточного штамма L1101 элюирование гентамицина из СВМПЭ не влияло на бактериальную жизнеспособность L1101 (рис. 4C). Бактерии размножались, и популяция стабилизировалась в течение 6 часов в присутствии первичного СВМПЭ без элюирования антибиотиками. В присутствии СВМПЭ с гентамицинным покрытием популяция достигла аналогичного уровня роста на 2-й день. Напротив, элюирование ванкомицина из СВМПЭ значительно снижало жизнеспособность бактерий (>3log) через 6 часов, и полная потеря жизнеспособности (отсутствие роста колоний) была продемонстрирована к 4-му дню. На поверхностях СВМПЭ с гентамицинным и ванкомицинным покрытием не было обнаружено жизнеспособных адгезивных бактерий при воздействии восприимчивых и промежуточных резистентных штаммов после 7-го дня или полной эрадикации, в зависимости от того, что наступит раньше. Некоторые жизнеспособные бактерии (1 x 105 КОЕ/мл) присутствовали на СВМПЭ с гентамицинным покрытием, подвергшихся воздействию резистентного к гентамицину L1101. Аналогичным образом, приблизительно 1 x 10 5 КОЕ/мл жизнеспособных адгезивных бактерий были извлечены из контрольной первичной ПЭ (рис. 5). Рисунок 2: Зависящее от времени среднее высвобождение антибиотика из 7% масс-полосок СВМПЭ, нагруженных антибиотиками. Среднее высвобождение антибиотика между временными точками из одной полоски 7% гентамицина и ванкомицина, нагруженной СВМПЭ (3 мм, 3 x 5 мм, 3 x 10 мм, 3 ~ 2см2 площадь поверхности). МПК против контрольного штамма ATCC 12600 показан в виде пунктирной линии для гентамицина и сплошной линии для ванкомицина. Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение среднего значения от шести повторений (n = 6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Стандартная кривая люминесцентного анализа в реальном времени для всех штаммов S. aureus. Log (люминесценция) была построена на основе log (КОЕ/мл) для получения стандартных кривых для контроля, (A) ATCC 12600, и клинических штаммов, (B) L1101 и (C) L1163. На графиках указаны уравнения, описывающие линию наилучшего соответствия и соответствующие значения R2 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Жизнеспособность бактерий определяется с использованием люминесцентного анализа для 7% СВМПЭ с покрытием гентамицина и 7% по массе с покрытием ванкомицина. Показана зависящая от времени антибактериальная активность гентамицина и ванкомицина, элюированных из СВМПЭ, против контрольных штаммов (A) ATCC 12600 и клинических штаммов (B) L1163 и (C) L1101. Virgin 1020 PE послужил контролем для эксперимента. Желтая линия на графиках указывает на предел обнаружения соответствующего штамма S. aureus. Данные показаны как среднее ± стандартное отклонение (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Жизнеспособность адгезивных бактерий определяется с помощью люминесцентного анализа Glo для 7% СВМПЭ с покрытием гентамицина и 7% по массе СВМПЭ с покрытием ванкомицина против всех штаммов S. aureus. Гистограмма показывает, что адгезивные бактерии (КОЕ) были восстановлены на сантиметр в квадрате (см2) 7% СВМПЭ, нагруженных гентамицином, и 7%, нагруженных ванкомицином, в конце периода исследования для всех тестируемых штаммов. Столбцы показывают данные как среднее ± стандартное отклонение (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Временные точки Ванкомицин Гентамицин Пиковая концентрация (мкг/мл) Пиковая концентрация (мкг/мл) 0 – 6 ч 336 ±72 263 ±24 6 ч -1 день 57 ±18 16 ±2 1 день – 2 день 60 ±18 7 ±1 2 день – 3 день 23 ± 6 5 ± 0,4 3 день – 7 день 49 ±20 15 ± 1 Таблица 2: Пиковая концентрация лекарственного средства (мкг/мл) в разные моменты времени. Данные показаны как среднее ± стандартное отклонение (n = 6). Дополнительный рисунок 2: Затухание сигнала люминесценции в течение 10 минут после добавления анализирующего реагента в образец. Разница в сигнале в ±5% показана пунктирной линией Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Локализованное устойчивое введение антибиотиков является необходимым инструментом в лечении перипротезных инфекций суставов. Системные антибиотики являются основной стратегией в искоренении бактериальной инфекции, а местное элюирование используется в качестве дополнительного инструмента для предотвращения роста и колонизации любых бактерий, оставшихся после удаления имплантата и санации ткани. Цель эффективной области под кривой (концентрация в течение периода) для антибиотиков при местном введении не совсем понятна. Элюирование антибиотиков из таких устройств может быть количественно продольно количественно определено in vitro; Однако для определения трансляционного значения этих профилей концентрации необходим надежный метод in vitro для оценки антибактериальной активности. В этой статье описан один из таких методов в режиме реального времени для определения антибактериальной активности СВМПЭ с лекарственным покрытием, который будет использоваться в качестве устройства устойчивой доставки при замене суставов.

Мониторинг жизнеспособности бактерий в режиме реального времени является важнейшим параметром, представляющим интерес, и традиционные микробиологические методы не имеют рамок для размещения этого конкретного аспекта исследования. Анализ микробной жизнеспособности, используемый в этом исследовании, был разработан для количественного определения жизнеспособных бактерий путем измерения люминесценции, соответствующей аденозинтрифосфату (АТФ). Чтобы непосредственно исследовать зависящую от времени активность антибиотиков, элюированных из материалов имплантатов, с ними инкубировали три разных штамма с различными профилями чувствительности к антибиотикам. Обоснование использования лабораторных и клинических штаммов с различной резистентностью к гентамицину и ванкомицину заключалось в понимании диапазона активности данной формы имплантата. Кроме того, антибактериальная активность и эффективность против этих различных групп населения зависят от времени введения. Метод фокусируется на возможности профилактики против этих штаммов, основанной на >70% перипротезных инфекций суставов, вызванных загрязнением раны во время операции24.

В качестве стартового посева для разработки этого метода использовали 1 x 105 КОЕ/мл. Различные концентрации загрязнения использовались для животных моделей, хотя мало что известно о клинически значимой инфекционной нагрузке для PJI. Модели инфекций животных для PJI были обычно созданы с использованием 1 x 105 КОЕ, и аналогичный диапазон широко используется в стандартизированных методах (CLSI) для определения антибактериальной активности25,26,27. Использование 1 x 105 КОЕ/мл в качестве исходной концентрации, загрязняющей концентрации, позволило нам одновременно оценить параметры роста и эрадикации.

Обычно значения MIC определяются для постоянной концентрации антибиотика для определенного количества бактерий, и они не демонстрируют скорость антибактериального действия. Из-за этого аспекта значения MIC не обеспечивают количественной дифференциации для описания профиля антимикробной активности28. Данные текущего метода подчеркивают преимущество оценки штаммозависимой кинетики уничтожения антибиотиков, а не использования MIC для принятия решений о дозировке. Используя этот метод, можно было дифференцировать как степень, так и скорость, с которой материалы имплантатов влияли на различные штаммы. Гентамицин, элюированный из полосок имплантационного материала, был эффективен в уничтожении L1163 за 1 день и в уничтожении ATCC 12600 через 2-3 дня, но он был неэффективен в уничтожении L1101 (рис. 4). В дополнение к ожидаемому отсутствию активности элюирования гентамицина в отношении L1101 (MIC >32 мкг/мл) из-за присущей ему резистентности к гентамицину (рис. 4C), при воздействии ванкомицина наблюдалась персистенция субпопуляций, к которым L1101 проявляет промежуточную резистентность. Напротив, L1163 был окончательно ликвидирован в присутствии СВМПЭ с ванкомицином, несмотря на то, что он проявлял аналогичную промежуточную резистентность к ванкомицину, что и L1101 (для обоих штаммов наблюдался МПК 8 мкг / мл).

Наблюдения о том, что скорость активности гентамицина против 12600 и L1163, которые чувствительны к гентамицину с одинаковыми значениями MIC (MIC 1 мкг / мл наблюдался для обоих штаммов), была различной, а также что степень активности ванкомицина против промежуточно-резистентных L1101 и L1163 была разной (рис. 4A, B), поддержал гипотезу о том, что этот метод реального времени в присутствии элюирующего материала может дифференцировать продольные различия в активности.

В дополнение к трансляционной ценности результатов в интерпретации того, насколько эффективной может быть данная элюированная концентрация против этих бактерий, существует несколько экспериментальных методологических преимуществ. (1) Концентрация бактерий определяется мгновенно в данный момент времени, в отличие от обычных методов, в которых бактерии инкубируются в бульоне или на агаре в течение 18-24 часов для определения жизнеспособности. Этот период роста может дать бактериям дополнительное время для восстановления после антибиотического стресса, что приводит к дополнительному возможному источнику ошибок / изменчивости. (2) Среда постоянно заменяется при сохранении бактерий, что больше напоминает условия in vivo , чем статические условия. (3) Этот анализ по своей сути включает кинетику высвобождения лекарственного средства из имплантата, что позволяет лучше прогнозировать производительность. (4) Метод был разработан с использованием общедоступных расходных материалов без необходимости использования какого-либо специального или дорогостоящего оборудования.

Надежные методы тестирования in vitro для оценки приложений доставки лекарств необходимы, прежде чем переходить к исследованиям на животных и клиническим испытаниям in vivo. Этот анализ может быть модифицирован и адаптирован для размещения различных подходов и платформ доставки лекарств, таких как частицы, гели, пленки и другие материалы с лекарственным покрытием, для определения эффективности эрадикации бактерий в моделируемой установке in vitro. Модификации могут быть выполнены для установки образца путем изменения в подходящей среде in vitro, которая, как было показано, влияет на активность нескольких антибиотиков29,30.

Этот метод также способствует определению жизнеспособных адгезивных бактерий, что является многообещающим, поскольку традиционные методы определения минимальной концентрации эрадикации биопленки отнимают много времени и дают противоречивые результаты. Тем не менее, метод должен быть тщательно протестирован на биопленках, чтобы разработать надежную и надежную методологию для определения его чувствительности. Люминесцентный метод на основе АТФ может быть достаточно чувствительным для обнаружения жизнеспособных форм бактерий в биопленках, включая персистенты, которые могут быть обнаружены или не обнаружены на агаровой пластине в виде видимых колоний. Взятые вместе, эта универсальная платформа может включать соответствующие параметры для записи наблюдений в режиме реального времени за антибактериальной и антибиопленочной активностью интересующих лекарств.

Эффективность этого метода определяется следующими аспектами:

Предварительно определенные характеристики элюирования и размер образца
Профиль элюирования материала, элюирующего антибиотик, может быть идентифицирован в отдельном эксперименте до этого измерения антибактериальной активности, так что количество материала, необходимого для активного проведения эксперимента в течение оговоренного времени, может быть определено.

Определение контейнера и объема
Важно разработать установку, в которой объем среды эксперимента может вместить всю площадь поверхности одного и того же материала и обеспечить достаточный объем для беспрепятственного высвобождения лекарственного средства с поверхности, нагруженной лекарственным средством. Используемая установка была основана на предыдущих экспериментах, обеспечивая условия «идеального поглотителя» для этих гидрофильных препаратов, так что их диффузии не препятствуют ограничения растворимости.

Характеристики питательных сред
Выбор питательных сред должен быть исследован для обеспечения стабильности и оптимальной эффективности выбранного лекарственного средства (лекарств)29. Катионно-скорректированный бульон Мюллера Хинтона (CAMHB), который широко используется в методе разведения бульона, использовался для определения МПК известных антибиотиков. Среда обеспечивает оптимальную активность лекарственного средства без вмешательства накопления токсических вторичных метаболитов31. Реагент для анализа был протестирован и признан стабильным в различных типах сред, в том числе с компонентамисыворотки 23,28. Хотя значения относительных единиц люминесценции могут варьироваться в разных средах, было продемонстрировано, что компоненты среды не мешают анализу32,33. Экспериментальный объем был дополнительно оптимизирован до 1,5 мл, что близко к объему синовиальной жидкости, присутствующему в пространстве коленного сустававзрослого человека 34.

Температурная стабильность для анализа
Обработка и добавление люминесцентного реагента в анализ должны выполняться последовательно во всех экспериментах. Изменения температуры изменяют чувствительность анализа, поэтому важно инкубировать реагент при комнатной температуре в течение 2 часов, прежде чем добавлять его к бактериям23.

Время инкубации реагента
Свечение от реагента со временем затухает. Люминесцентный сигнал имеет период полураспада более 30 минут, который в значительной степени зависит от среды и типа бактерии, используемой в эксперименте23. Кроме того, любые различия во времени инкубации (т.е. время между добавлением реагента к бактериям и считыванием люминесценции) приведут к противоречивым показаниям для одной и той же концентрации бактерий. Разница в 5% наблюдалась в люминесцентном сигнале при приеме в течение 1 минуты после 5-минутного времени инкубации в соответствии с инструкциями производителя (дополнительный рисунок 2). Принимая во внимание эти данные, показания люминесценции регистрировались в течение 1 мин на протяжении всего исследования, чтобы потери сигнала составляли не более 5%. Кроме того, важно ограничить количество образцов на пластине, чтобы уменьшить погрешность, возникающую из-за затухания люминесценции из первой лунки в последнюю.

Поддержание бактериальной популяции на протяжении всего исследования
В этом методе была предпринята попытка смоделировать клиренс лекарственного средства и оборот синовиального объема путем непрерывного отделения отработанной среды от бактериальной популяции в каждый момент времени с использованием высокоскоростного центрифугирования при 10 000 x g в течение 10 мин35. Этот критический этап обеспечивает осаждение всех жизнеспособных и нежизнеспособных бактериальных клеток. В дополнение к этому, осажденные бактерии равномерно восстанавливаются в свежем MHB и переносятся в шприцевую установку, облегчая полный перенос пораженной микробной популяции обратно в экспериментальную установку. Воспроизводимость и надежность этого метода в значительной степени зависят от моделирования длительного воздействия антибиотиков на микробную популяцию, полученную из исходного инокулята.

Ключевым ограничением этого метода является то, что это полустатический анализ, который неточно имитирует период полувыведения лекарства и непрерывный синовиальный оборот. Однако постоянная замена среды частично компенсирует это ограничение. Чувствительность анализа микробной жизнеспособности зависела от штамма и варьировалась от 1 x 102-1 x 104 КОЕ/мл, что ограничивает возможности обнаружения. Кроме того, для каждого организма необходимо построить стандартную кривую, поскольку тип штамма влияет на чувствительность и эффективность люминесцентного реагента. Компоненты среды могут влиять как на динамику роста бактерий, так и на активность используемого лекарственного соединения, что требует дальнейшего изучения.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа частично финансировалась грантом Национального института здравоохранения No AR077023 (R01) и ортопедической лабораторией Харриса. Авторы благодарят доктора Керри Лапланте и ее команду из Университета Род-Айленда за предоставление клинических штаммов L1101 и L1163.

Materials

 96 well plates – polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs Corning, NY, USA CLS3922-100EA
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich, Germany
ATCC 12600 American Type culture Collection, VA, USA
BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay Promega Corporation, USA G8231
BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) Becton-Dickinson, USA BD 211825 purchased from Fisher Scientific, USA
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL BD, USA 309657
BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G BD, USA 305122
BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) Becton-Dickinson, USA B12322 purchased from Fisher Scientific, USA
BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) Becton-Dickinson, USA DF0369-17-6 purchased from Fisher Scientific, USA
Boric Acid  Fisher Chemical, NJ, USA
Branson 1800 ultrasonic bath Emerson, MO, USA
Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid Fisher Scientific, USA 08-757-100D
Gentamicin Sulfate  Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China
Greiner UV-Star 96 well plates Sigma Aldrich, Germany M3812-40EA
Hydraulic press Carver, Inc. Wabash, IN, USA
L1101  Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island
L1163  Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island
LSE benchtop shaking incubator Corning, NY, USA
Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical Fisher Scientific, NJ, USA A454-1
Napco CO2 6000 Thermo Scientific, MA, USA
PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents Fisher Scientific, USA BP24384
Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) Sigma Aldrich, Germany P1378-5g
Plate reader (Synergy H1 Biotek, VT, USA
press Carver, Inc. Wabash, IN, USA
shaker Innova 2100 New Brunswick Scientific, NJ, USA
ShopBot D2418 ShopBot Tools, Inc., NC, USA
Sodium Hydroxide  Sigma Aldrich, Germany
Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water Fisher Scientific, USA 23-751628
UHMWPE GUR1020, Celanese, TX, USA
Vancomycin Hydrochloride  Fagron, The Netherlands 804148
WAB Turbula WAB Turbula, Switzerland
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, D. J., March, L., Chew, M. Osteoarthritis in 2020 and beyond: A Lancet Commission. Lancet. 396 (10264), 1711-1712 (2020).
  2. Sloan, M., Premkumar, A., Sheth, N. P. Projected volume of primary total joint arthroplasty in the U.S., 2014 to 2030. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 100 (17), 1455-1460 (2018).
  3. Gao, J., Xing, D., Dong, S., Lin, J. The primary total knee arthroplasty: A global analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 190 (2020).
  4. . UpToDate. Prosthetic joint infection: Treatment Available from: https://www.uptodate.com/contents/prosthetic-joint-infection-treatment (2022)
  5. Dapunt, U., Radzuweit-Mihaljevic, S., Lehner, B., Haensch, G. M., Ewerbeck, V. Bacterial infection and implant loosening in hip and knee arthroplasty: Evaluation of 209 cases. Materials. 9 (11), 871 (2016).
  6. Kamath, A. F., et al. Quantifying the burden of revision total joint arthroplasty for periprosthetic infection. The Journal of Arthroplasty. 30 (9), 1492-1497 (2015).
  7. Tande, A. J., Patel, R. Prosthetic joint infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (2), 302-345 (2014).
  8. Davidson, D. J., Spratt, D., Liddle, A. D. Implant materials and prosthetic joint infection: The battle with the biofilm. EFORT Open Reviews. 4 (11), 633-639 (2019).
  9. de Vor, L., Rooijakkers, S. H. M., van Strijp, J. A. G. Staphylococci evade the innate immune response by disarming neutrophils and forming biofilms. FEBS Letters. 594 (16), 2556-2569 (2020).
  10. Dapunt, U., Giese, T., Stegmaier, S., Moghaddam, A., Hänsch, G. M. The osteoblast as an inflammatory cell: Production of cytokines in response to bacteria and components of bacterial biofilms. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 243 (2016).
  11. González, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response. Pathogens and Disease. 76 (3), 023 (2018).
  12. Dapunt, U., Giese, T., Prior, B., Gaida, M. M., Hänsch, G. M. Infectious versus non-infectious loosening of implants: activation of T lymphocytes differentiates between the two entities. International Orthopaedics. 38 (6), 1291-1296 (2014).
  13. Tai, D. B. G., Patel, R., Abdel, M. P., Berbari, E. F., Tande, A. J. Microbiology of hip and knee periprosthetic joint infections: A database study. Clinical Microbiology and Infection. 28 (2), 255-259 (2022).
  14. Foster, T. J. Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Current status and future prospects. FEMS Microbiology Reviews. 41 (3), 430-449 (2017).
  15. Kranjec, C., et al. Staphylococcal biofilms: challenges and novel therapeutic perspectives. Antibiotics. 10 (2), 131 (2021).
  16. Kahl, B. C., Becker, K., Löffler, B. Clinical significance and pathogenesis of staphylococcal small colony variants in persistent infections. Clinical Microbiology Reviews. 29 (2), 401-427 (2016).
  17. Li, C., Renz, N., Trampuz, A. Management of periprosthetic joint infection. Hip & Pelvis. 30 (3), 138-146 (2018).
  18. Davis, J. S., et al. Predictors of treatment success after periprosthetic joint infection: 24-month follow up from a multicenter prospective observational cohort study of 653 patients. Open Forum Infectious Diseases. 9 (3), (2022).
  19. Suhardi, V. J., et al. A fully functional drug-eluting joint implant. Nature Biomedical Engineering. 1, 0080 (2017).
  20. Gil, D., Grindy, S., Muratoglu, O., Bedair, H., Oral, E. Antimicrobial effect of anesthetic-eluting ultra-high molecular weight polyethylene for post-arthroplasty antibacterial prophylaxis. Journal of Orthopaedic Research. 37 (4), 981-990 (2019).
  21. Robu, A., et al. Additives imparting antimicrobial properties to acrylic bone cements. Materials. 14 (22), 7031 (2021).
  22. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  23. BacTiter-Glo microbial cell viability assay instructions for use of products G8230, G8231, G8232 and G8233. <101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol. Promega Corporation Available from: https://www.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol/ (2022)
  24. Izakovicova, P., Borens, O., Trampuz, A. Periprosthetic joint infection: Current concepts and outlook. EFORT Open Reviews. 4 (7), 482-494 (2019).
  25. López-Torres, I. I., Sanz-Ruíz, P., Navarro-García, F., León-Román, V. E., Vaquero-Martín, J. Experimental reproduction of periprosthetic joint infection: Developing a representative animal model. The Knee. 27 (3), 1106-1112 (2020).
  26. Carli, A. v., et al. Quantification of peri-implant bacterial load and in vivo biofilm formation in an innovative, clinically representative mouse model of periprosthetic joint infection. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 99 (6), 25 (2017).
  27. Humphries, R. M., et al. CLSI Methods Development and Standardization Working Group best practices for evaluation of antimicrobial susceptibility tests. Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), 01934 (2018).
  28. Mueller, M., de la Peña, A., Derendorf, H. Issues in pharmacokinetics and pharmacodynamics of anti-infective agents: Kill curves versus MIC. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (2), 369-377 (2004).
  29. Wijesinghe, G., et al. Influence of laboratory culture media on in vitro growth, adhesion, and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Medical Principles and Practice. 28 (1), 28-35 (2019).
  30. Steixner, S. J. M., et al. Influence of nutrient media compared to human synovial fluid on the antibiotic susceptibility and biofilm gene expression of coagulase-negative Staphylococci In vitro. Antibiotics. 10 (7), 790 (2021).
  31. Sigma Aldrich. Mueller Hinton Broth (M-H Broth). Sigma Aldrich. , 70192 (2018).
  32. Thiriard, A., Raze, D., Locht, C. Development and standardization of a high-throughput Bordetella pertussis growth-inhibition assay. Frontiers in Microbiology. 11, 777 (2020).
  33. Clow, F., O’Hanlon, C. J., Christodoulides, M., Radcliff, F. J. Feasibility of using a luminescence-based method to determine serum bactericidal activity against Neisseria gonorrhoeae. Vaccines. 7 (4), 191 (2019).
  34. Kraus, V. B., Stabler, T. v., Kong, S. Y., Varju, G., McDaniel, G. Measurement of synovial fluid volume using urea. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (10), 1217-1220 (2007).
  35. Gonçalves, F. D. A., de Carvalho, C. C. C. R. Phenotypic modifications in Staphylococcus aureus cells exposed to high concentrations of vancomycin and teicoplanin. Frontiers in Microbiology. 7, 13 (2016).

Tags

Antibacterial ActivityDrug-eluting MaterialsPolymeric DevicePeriprosthetic Joint InfectionsReal-time Microbial Viability AssayColony Forming UnitsLongitudinal Antibacterial ActivityUHMWPEDrug-eluting DeviceAntibacterial Efficacy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sekar, A., Lekkala, S., Oral, E. A Novel Method to Determine the Longitudinal Antibacterial Activity of Drug-Eluting Materials. J. Vis. Exp. (193), e64641, doi:10.3791/64641 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image