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Immunology and Infection

Un nuevo método para determinar la actividad antibacteriana longitudinal de materiales liberadores de fármacos

Published: March 03, 2023
doi:
10.3791/64641
, ,
1Harris Orthopaedics Laboratory,Massachusetts General Hospital, 2Department of Orthopaedic Surgery,Harvard Medical School

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la eficacia antibacteriana de un polímero liberador de antibióticos para simular la aplicación clínica profiláctica mediante el uso de un ensayo de viabilidad microbiana luminiscente basado en ATP en tiempo real disponible comercialmente. Este método permite el monitoreo de la actividad longitudinal de los materiales liberadores de fármacos y puede adaptarse ampliamente para probar plataformas de administración de fármacos antimicrobianos.

Abstract

El polietileno de peso molecular ultra alto (UHMWPE) se usa ampliamente en artroplastias articulares totales como superficie de carga. Las infecciones articulares periprotésicas, la mayoría de las cuales ocurren poco después del reemplazo articular, constituyen casi el 25% del total de cirugías de revisión de rodilla, y la erradicación completa de la infección bacteriana plantea un desafío importante. Una forma prometedora de abordar este problema es garantizar la administración local sostenida de concentraciones de antibióticos suficientes para inhibir las bacterias para apoyar la profilaxis antibiótica sistémica de rutina. Hay una mayor investigación sobre el desarrollo de dispositivos locales eficientes de administración de medicamentos. Aunque los métodos de prueba antibacterianos establecidos para medicamentos se pueden usar para probar la eficacia antibacteriana de los materiales liberadores de fármacos, faltan en términos de proporcionar datos de eficacia antibacteriana longitudinales y en tiempo real que puedan correlacionarse con los perfiles de elución de los antibióticos de estos dispositivos. Aquí, informamos una metodología directa y versátil para determinar la eficacia antibacteriana de los implantes UHMWPE liberadores de antibióticos. Esta metodología se puede utilizar como una plataforma para evitar el cultivo bacteriano en cada punto de tiempo de un experimento largo y también se puede adaptar a otros dispositivos locales de administración de fármacos.

Introduction

La osteoartritis es una condición degenerativa significativa que afecta a 500 millones de adultos en todo el mundo1. El estándar de oro en el tratamiento de la artritis en etapa terminal es el reemplazo total de la articulación, que se proyecta que se realizará en más de 2 millones de pacientes anualmente solo en los Estados Unidos para 20302, con la demanda mundial también aumentando enormemente 3,4. El procedimiento implica el reemplazo de las superficies cartilaginosas articuladas de las juntas con materiales sintéticos de soporte de carga hechos de metal/cerámica y polietileno de peso molecular ultra alto reticulado (UHMWPE). Los reemplazos articulares totales mejoran significativamente la calidad de vida de los pacientes que padecen artritis5, pero una complicación significativa que pone en peligro el rendimiento de los implantes y la satisfacción de los pacientes es la infección articular periprotésica (PJI), que representa el 15%-25% de las cirugías de revisión6. Se cree que la causa de la infección en la mayoría de los casos es la contaminación microbiana del sitio del implante durante la cirugía7. La población contaminante se expande entonces en las superficies del implante y del tejido8. El sistema inmune del huésped se activa en respuesta, pero la tasa de crecimiento y la formación de biopelículas de los organismos contaminantes pueden permitirles evadir las células inmunes, lo que puede conducir a una tormenta de citoquinas y quimiocinas aumentada sin la erradicación de las bacterias 9,10,11. La infección profunda resultante del hueso pone en peligro la fijación y el rendimiento del implante, así como la salud del paciente12.

Staphylococcus aureus y estafilococos coagulasa negativos son los organismos causantes predominantes de PJI13. La gravedad de las infecciones estafilocócicas es alta debido a su mayor resistencia a los antibióticos, la formación de biopelículas y la capacidad de persistir como variantes de colonias pequeñas14,15,16. Las infecciones asociadas a implantes ocurren debido a la adhesión de microorganismos a la superficie del implante y al establecimiento de una matriz de biofilm compleja que permite a las bacterias evadir los factores inmunes nocivos del huésped y las concentraciones efectivas de antibióticos14,15,16. Los métodos de tratamiento convencionales incluyen combinaciones de antibióticos intravenosos y orales durante un período prolongado17. Un inconveniente importante de este enfoque es la baja biodisponibilidad del fármaco en el sitio de la infección y la dificultad de lograr concentraciones suficientes de antibióticos para erradicar las bacterias consistentemente durante el período de tratamiento, lo que a menudo resulta en malos resultados18. Para abordar estas deficiencias, se diseñó un implante UHMWPE liberador de fármacos localizado completamente funcional para garantizar una liberación sostenida de concentraciones efectivas de antibióticos en el espacio articular19. La elución local del implante liberador de fármacos se utiliza como una herramienta complementaria para prevenir el crecimiento y la colonización de cualquier bacteria restante después de la extracción del implante y el desbridamiento del tejido. Las pruebas antibacterianas in vitro de este UHMWPE liberador de antibióticos se pueden realizar incubando el material directamente con las bacterias y cuantificando las bacterias por el método de placa extendida20,21. Alternativamente, las alícuotas de medios eluyentes pueden ser probadas contra bacterias utilizando métodos tales como el método de difusión de disco de agar, los métodos de dilución de caldo y la prueba de muerte de tiempo22. Todos estos métodos se basan en la observación del crecimiento alrededor de 16-18 h después de la recolección de las alícuotas mediante el conteo de colonias y mediciones de turbidez. La elución de antibióticos de tales dispositivos puede cuantificarse longitudinalmente utilizando estos métodos in vitro; Sin embargo, para determinar el valor de traslación de estos perfiles de concentración, se necesita un método in vitro robusto en tiempo real para evaluar la actividad antibacteriana.

El ensayo de viabilidad microbiana utilizado en este estudio se desarrolló para la cuantificación de bacterias viables mediante la medición de la luminiscencia correspondiente al trifosfato de adenosina (ATP) liberado de una célula bacteriana viva utilizando tecnología de detección basada en luciferina-luciferasa. El ATP, como moneda de energía de las células vivas, sirve como un indicador directo de las células fisiológicamente viables. El reactivo realiza la lisis celular, que libera moléculas de ATP de células viables que luego se detectan en forma de luminiscencia. Esta luminiscencia tiene una correlación directa con la proporción de células bacterianas viables dentro de la muestra23. Este es un ensayo en tiempo real, simple, versátil, rápido y basado en un solo reactivo que se puede adaptar a una variedad de diseños de ensayos y condiciones con microorganismos grampositivos y gramnegativos. Aquí informamos un método para determinar la actividad antibacteriana en tiempo real del UHMWPE liberador de antibióticos incubado con cepas clínicas y de laboratorio de S. aureus utilizando un ensayo modificado de muerte temporal basado en el ensayo de viabilidad microbiana (por ejemplo, BacTiter Glo). Si bien la metodología se describe con un material de implante específico y una aplicación ortopédica específica, el método puede proporcionar una plataforma para probar otros dispositivos de administración liberadores de antibióticos con aplicaciones clínicas.

Protocol

1. Preparación de los reactivos Preparación del caldo Mueller-Hinton (MHB): Disuelva 22 g de MHB ajustado a cationes en 1 L de agua desionizada. Autoclave el medio a 121 °C y 15 lb de presión durante 20 min, asegurándose de que la botella esté suelta. Conservar el caldo estéril preparado a 4 °C hasta su uso. Preparación de agar tríptico de soja (TSA): Disuelva 20 g de polvo de TSA en 500 ml de agua desionizada. Autoclave la mezcla de agar a 121 °C y 15 lb durante 20 min. Transfiera el medio estéril a un baño de agua a 55 °C para bajar la temperatura del agar fundido. Vierta el agar preparado enfriado en placas de Petri estériles (~ 15 ml) y deje que se solidifique. Guarde las placas de agar solidificado invertidas para evitar la condensación. Preparación de caldo de soja tríptico (TSB): Disuelva 15 g de polvo de TSB en 500 ml de agua desionizada. Autoclave la mezcla de caldo a 121 °C y 15 lb durante 20 min. Conservar el caldo estéril preparado a 4 °C hasta su uso. Solución salina tamponada con fosfato (PBS): Autoclave compró comercialmente 1x PBS a 121 °C y 15 lb durante 20 minutos antes de su uso estéril. Preparación del reactivo del ensayo de viabilidad microbiana: equilibre el contenido del ensayo a temperatura ambiente. Mezclar 10 ml de tampón con el polvo reactivo luminiscente liofilizado y conservar el reactivo preparado a −20 °C como alícuotas de 1 ml. Antes de cada punto de tiempo, descongele el reactivo sensible a la luz y llévelo a temperatura ambiente. Solución madre de sulfato de gentamicina: Disuelva 80 mg de sulfato de gentamicina (GS) en 10 ml de 1x PBS. Vortex la solución farmacológica a fondo para obtener una solución madre de 8 mg/ml GS. Solución madre de clorhidrato de vancomicina: Disuelva 10 mg de polvo de clorhidrato de vancomicina completamente en 10 ml de agua desionizada para obtener una solución madre de 1 mg / ml. Solución tampón de ácido bórico: Disuelva 24,7 g (0,4 M) de ácido bórico en 900 ml de agua desionizada. Ajuste el pH de la solución a 10.4 con una solución de hidróxido de sodio al 50% (p/v). Además de este paso, agregue agua desionizada para llegar a 1 L. Reactivo O-ftaldaldehído (OPA): Disuelve 0,2 g de OPA en 1 mL de metanol. Añadir 19 ml de tampón ácido bórico 0,4 M (pH 10,4) a la solución de OPA. Agregue 0.4 ml de 2-mercaptoetanol a la mezcla de ácido bórico OPA. Cubrir el vial del reactivo con papel de aluminio y conservar a 4 °C para su uso hasta 2-3 días después de la preparación.PRECAUCIÓN: Evite el contacto con la piel, los ojos y la ropa. La manipulación de los reactivos OPA y 2 de mercaptoetanol debe realizarse únicamente bajo una campana extractora con ventilación por extracción adecuada, mientras se utiliza el equipo de protección personal adecuado. Evite inhalar los vapores, el polvo o los aerosoles. 2. Preparación de UHMWPE virgen y cargado de drogas Tamizar 2 g de sulfato de gentamicina y clorhidrato de vancomicina en polvo con un tamiz (tamaño de poro de 75 μm) y deshidratar a 45 °C en un horno de vacío (<0,1 atm) durante 18-24 h. Mezcle el medicamento deshidratado con polvo UHMWPE al 7% p/p (1,12 g de antibiótico + 14,88 g de UHMWPE) en un recipiente utilizando un mezclador mecánico durante 5 min. Precaliente un molde personalizado de bronce de aluminio (85 mm x 50 mm) con placas de inserción de acero inoxidable a 180 °C en un horno de convección durante 1 h. Precalentar las placas de la prensa a 170 °C. Agregue el polvo mezclado al molde y comprima a 10 MPa, 170 °C durante 10 min, seguido de un ciclo de enfriamiento por agua de 45 min a 10 MPa. Retire el bloque UHMWPE moldeado (~3,5 mm) de la prensa con una prensa hidráulica. Fresar las superficies superior e inferior del bloque utilizando un control numérico computarizado (CNC) para eliminar cualquier irregularidad superficial y contaminante. Corte el bloque en tiras de 3 mm x 5 mm x 20 mm utilizando el CNC. Preparar UHMWPE virgen (sin la adición de antibióticos) utilizando la misma metodología descrita como control para el estudio. Figura complementaria 1: Partes del molde utilizadas para moldear las muestras UHMWPE. (A) Placa de inserción de acero inoxidable; (B) cavidad del molde; (C) émbolo; (D) placa posterior Haga clic aquí para descargar este archivo. 3. Determinación de la cinética de elución del UHMWPE liberador de fármacos Coloque una tira de 3 mm x 5 mm x 20 mm en una jeringa de 3 ml con un bloqueo Luer y una aguja de 25 G. Lave la tira llenando la jeringa con agua desionizada e invirtiendo la jeringa varias veces. Llene la jeringa con agua desionizada hasta la graduación de 2 ml. Coloque la configuración de la jeringa en un agitador a 100 rpm a temperatura ambiente. En cada punto de tiempo (6 h, 1 día, 2 días, 3 días, 1 semana), recoger el eluyente en un vial de 2 ml. En cada momento, lave la tira llenando la jeringa con agua desionizada e invirtiendo la jeringa. Deseche la solución y llene la jeringa con agua desionizada hasta la graduación de 2 ml para continuar el experimento hasta el siguiente punto de tiempo. 4. Determinación de la concentración de vancomicina Detecte la concentración de vancomicina espectrofotométricamente en agua desionizada a una longitud de onda de absorción máxima de 280 nm. Preparar estándares de rango de concentración conocidos agregando 100 μL de solución madre de 1 mg/ml a la placa UV de 96 pocillos y diluyendo en serie usando 100 μL de agua desionizada para obtener seis niveles de concentraciones conocidas (1 mg/ml a 0,03125 mg/ml). Transfiera 100 μL de los eluyentes a placas de 96 pocillos transparentes a los rayos UV y determine la concentración a 280 nm utilizando un lector de microplacas. Genere una curva de calibración trazando las concentraciones conocidas del fármaco contra los valores de absorbancia correspondientes. Calcule la concentración desconocida del fármaco en el eluyente utilizando la ecuación lineal generada por la curva de calibración. Determine la masa del fármaco multiplicando la concentración por el volumen eluyente (~1,7 ml). Calcule la liberación acumulada del fármaco (mg) en un punto de tiempo sumando la liberación del fármaco de todos los puntos de tiempo anteriores. Normalizar la liberación del fármaco a la superficie de la tira (3,5 cm 2) para determinar la liberación acumulada del fármaco por centímetro cuadrado (cm2) del implante. 5. Determinación de la concentración de gentamicina mediante el método de marcado OPA 27 Preparar soluciones estándar GS para realizar el ensayo OPA.Transfiera 1 ml de la solución GS de 80 μg/ml a un tubo de centrífuga. Agregue 500 μL de PBS a cinco tubos de centrífuga más. Realice una dilución seriada con estos tubos para obtener concentraciones GS de 80 μg/mL, 40 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL y 2,5 μg/mL. Estos sirven como soluciones de calibración para el ensayo. En una placa transparente de 96 pocillos, añadir 80 μL de PBS al pocillo A-1 y 80 μL de las soluciones de calibración a los pocillos A-2 a A-7 en concentración ascendente. Esto sirve como una calibración interna para el ensayo. Añadir 80 μL de cada muestra a los pocillos vacíos por triplicado para analizarlos en la misma placa de 96 pocillos. Limite el número de muestras por placa de pocillo a <50, de modo que el momento de agregar la solución de OPA a las muestras sea aproximadamente el mismo para todas las muestras y para evitar la evaporación. Agregue el reactivo OPA a todos los estándares y soluciones de muestra.En una campana extractora, llene un depósito de reactivo de 25 ml con metanol. Añadir 8 ml de metanol y 1 ml de la solución de OPA preparada a un segundo depósito de reactivo (sección 1.8). Mezclar bien la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Con una micropipeta multicanal de 100 μL, añadir 48 μL de metanol del primer depósito a todos los pocillos que contienen muestras en la placa de 96 pocillos. Además de este paso, agregue 72 μL de solución diluida de OPA del segundo depósito a todos los pocillos que contienen muestras en la placa de 96 pocillos. Incubar la placa del pozo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Mida la intensidad de fluorescencia (excitación de 340 nm, emisión de 455 nm) utilizando un lector de microplacas inmediatamente después de la incubación de 10 minutos. Trazar la curva de calibración utilizando las lecturas de intensidad para las soluciones con concentraciones conocidas de GS. Agregue una línea lineal para determinar el mejor ajuste y genere la ecuación correspondiente. Calcule la concentración del fármaco en el eluyente a partir de las curvas de calibración generadas trazando las concentraciones conocidas del fármaco contra los valores de absorbancia correspondientes. Calcule la masa del fármaco multiplicando la concentración por el volumen eluyente (~1,7 ml). Determine la liberación acumulada del fármaco (mg) en un punto de tiempo sumando la liberación del fármaco de todos los puntos de tiempo anteriores. Normalizar la liberación del fármaco a la superficie de la tira (3,5 cm 2) para determinar la liberación acumulada del fármaco por centímetro cuadrado (cm2) del implante. 6. Preparación de bacterias NOTA: En este estudio se utilizaron las siguientes cepas de S. aureus: cepa tipo 12600, cepas clínicas L1101 y L1163 (obtenidas del Dr. Kerry LaPlante de la Universidad de Rhode Island). Los perfiles de susceptibilidad de estas cepas se presentan en la Tabla 1. Cepas bacterianas Ctamicina gentamicina MIC de vancomicina ATCC 12600 ≤1 μg/ml (sensible) ≤0,5 μg/ml (sensible) L1101 (Cepa clínica) ≥16 μg/ml (resistente) 8 μg/ml (intermedio) L1163 (Cepa clínica) ≤1 μg/ml (sensible) 8 μg/ml (intermedio) Tabla 1: Perfiles de susceptibilidad a antibióticos de cepas de S. aureus control y clínicas. PRECAUCIÓN: Todos los pasos que involucran el manejo de cultivos bacterianos y suspensiones se realizaron en un espacio de laboratorio BSL-2 dentro de un gabinete de bioseguridad Clase II, Tipo A2. Descongele las cepas bacterianas de -80 °C en placas de TSA para facilitar el crecimiento de S. aureus. Incubar estáticamente las placas durante la noche a 35 °C. Transfiera de dos a tres colonias de los cultivos en placa de agar cultivados durante la noche a 1 ml de TSB estéril e incube estáticamente durante la noche a 35 °C. Transfiera 100 μL de bacterias a una placa transparente de 96 pocillos para medir espectrofotométricamente la turbidez determinando la absorbancia a 600 nm. Diluir las bacterias 10.000x usando MHB estéril antes de determinar el recuento de bacterias viables usando el ensayo luminiscente. 7. Realización del ensayo de viabilidad microbiana en tiempo real Realice el ensayo basado en luminiscencia utilizando placas blancas de fondo opaco de 96 pocillos. Mezclar 100 μL de suspensiones bacterianas diluidas con 100 μL de reactivo de ensayo preparado en la sección 1.5. Coloque una tapa cubierta con papel de aluminio sobre la placa preparada de 96 pocillos e incube durante 5 minutos con agitación de 100 rpm. Mida la luminiscencia inmediatamente con un lector de microplacas utilizando los siguientes ajustes en el software Gen5 3.11.Haga clic en Nuevo para configurar un protocolo en la ventana Administrador de tareas . Seleccione Costar 96 blanco opaco en el menú desplegable para Tipo de placa. Haga clic en Leer en el menú Seleccionar pasos > acciones . Haga clic en Luminiscencia dentro de la ventana Método de lectura. Mantenga las opciones Endpoint/cinética y Luminiscencia de fibra seleccionadas en Tipo de lectura y Tipo de óptica, respectivamente. Haga clic en Aceptar. Mantenga la configuración en la ventana Paso de lectura (ganancia = 135; tiempo de integración = 1 seg; altura de lectura = 4,5 mm). Haga clic en Aceptar. La ventana de diseño de placa aparece lista para la ejecución. Marque la casilla Usar tapa en la ventana de la placa de carga y haga clic en Aceptar. Coloque la placa de 96 pocillos en la máquina para leer los valores de luminiscencia. 8. Generar una curva estándar de luminiscencia versus recuento viable para cada cepa bacteriana NOTA: Cultivar y enumerar todas las cepas de S. aureus según la metodología descrita en la sección 6. Prepare suspensiones bacterianas diluidas en serie para que sirvan como estándares.Enumerar la suspensión bacteriana cultivada durante la noche midiendo espectrofotométricamente la turbidez. Centrifugar a 6.000 × g durante 5 minutos para granular las bacterias, y resuspender el pellet en MHB estéril para ajustar la concentración a 1 x 109 UFC/ml. Diluir 100 μL de suspensión limpia utilizando 900 μL de MHB, y realizar una dilución en serie de 10 veces para alcanzar 1 x 101 UFC/ml. Realizar el ensayo de luminiscencia en las suspensiones bacterianas preparadas como se describe en la sección 7. Utilice MHB estéril como control en blanco para el experimento y reste el valor de luminiscencia en blanco de los valores de luminiscencia de la muestra de prueba. Trazar el registro (UFC) contra el registro (luminiscencia) para generar una curva estándar. Registre la ecuación y el valor de R2 . Determine la UFC/ml correspondiente a los valores de luminiscencia utilizando la ecuación específica de la deformación a lo largo del estudio. 9. Configuración del estudio de actividad antibacteriana dependiente del tiempo Figura 1: Una representación esquemática de la configuración experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Cultive las bacterias durante la noche en 1 ml de caldo TSB. Diluir la suspensión bacteriana cultivada durante la noche a 105 UFC/ml en MHB estéril (sección 6) y verificar el recuento bacteriano viable utilizando las unidades de luminiscencia antes del inicio del experimento (sección 7). Colocar las tiras UHMWPE vírgenes y UHMWPE cargadas con fármaco (3 mm x 5 mm x 10 mm, la mitad de la dimensión de las tiras preparadas para los estudios de elución en la sección 2) dentro de una jeringa de 3 ml. Extraiga MHB que contenga 10 5 UFC/ml en la jeringa a través de la aguja conectada hasta la marca de1,5 ml, que es equivalente a 1,35 ml de MHB (Figura 1: Paso 1). Coloque la configuración de la jeringa en una incubadora de agitación (100 rpm) a 37 °C hasta los puntos de tiempo indicados de 6 h, Día 1, Día 2, Día 3, Día 4, Día 5, Día 6 y Día 7 (Figura 1: Paso 2). En cada punto de tiempo indicado, saque la configuración de la jeringa y realice un ensayo de viabilidad microbiana en tiempo real de acuerdo con la sección 7 en 100 μL de suspensión bacteriana (Figura 1: Paso 3-4). Determine el recuento de bacterias viables para los puntos de tiempo de 6 h, Día 1, Día 2, Día 3 y Día 7. Determine la UFC/ml a partir de las unidades de luminiscencia utilizando la curva estándar correspondiente. Verificar la ausencia de bacterias viables en las muestras que mostraron valores de luminiscencia por debajo del límite de detección realizando el método de placa extendida en placas TSA e incubando a 35 °C durante la noche. Compruebe la presencia de colonias al día siguiente. Centrifugar la suspensión bacteriana restante a 10.000 × g durante 10 minutos y aspirar suavemente el medio gastado. Para tubos en los que los gránulos no se observan visualmente debido a la actividad antibacteriana de los medicamentos, deje 100 μL en el tubo para asegurarse de que el pellet invisible no se altere (Figura 1: Paso 5). Vuelva a suspender las bacterias peletizadas en MHB fresco y retire la suspensión bacteriana en la misma configuración de jeringa a través de la aguja conectada (Figura 1: Paso 6). 10. Cuantificación de bacterias adherentes en la superficie UHMWPE Recupere las superficies UHMWPE virgen y UHMWPE cargadas con medicamentos de la configuración de la jeringa después de completar el estudio el día 7. Transfiera las superficies a tubos de 1.5 ml y enjuague con 1 ml de PBS estéril (tres veces). Sonicar la superficie durante 40 min en 1 ml de PBS estéril. Determinar la viabilidad de las bacterias adherentes mediante la realización de un ensayo de luminiscencia en 100 μL de la muestra sonicada, como se describe en la sección 7.

Representative Results

Siguiendo el protocolo, UHMWPE se moldeó con gentamicina y vancomicina al 7% p/p y se eluyó en agua desionizada. La concentración del fármaco en el eluyente del material se determinó a las 6 h, 1 día, 2 días, 3 días y 1 semana. La liberación del fármaco de la UHMWPE cargada con vancomicina y gentamicina demostró una liberación de ráfaga a las 6 h seguida de una tasa de liberación constante con una concentración de liberación mayor que la concentración inhibitoria mínima (CMI) hasta los 7 días (Figura 2, Tabla 2). Antes del estudio antibacteriano, se generó una curva estándar para correlacionar las unidades de luminiscencia con la UFC/ml de las bacterias para cada cepa de S. aureus (ATCC 12600, L1101 y L1163). Los valores logarítmicos correspondientes (luminiscencia) se trazaron contra el log (UFC/ml) para generar una curva estándar (Figura 3). Los valores deR2 calculados fueron 0,997, 0,996 y 0,994 para ATCC 12600, L1101 y L1163, respectivamente, lo que indica un fuerte ajuste para el rango de concentración. La ecuación derivada se utilizó posteriormente para calcular la viabilidad bacteriana en todos los experimentos. ATCC 12600 y L1101 demostraron un límite de detección dentro de un rango de 1 x 102-1 x 103 UFC/ml. Por otro lado, se demostró que el límite de detección para la cepa L1163 era 1 x 104 UFC/ml. El ensayo de actividad antibacteriana dependiente del tiempo se realizó utilizando 1 x 105 UFC/ml como inóculo inicial para 12600, L1163 y L1101, que fueron expuestos al 7% p/p de materiales liberadores de fármacos durante un período de 1 semana. En cada punto de tiempo (6 h, 1 día, 2 días, 3 días, 1 semana), el medio se actualizó y la población bacteriana se volvió a suspender. La exposición de la bacteria a la posterior liberación de fármacos del material se continuó hasta el siguiente punto de tiempo. UHMWPE con 7% p/p de vancomicina y UHMWPE con 7% p/p de gentamicina demostraron una reducción de >3log para ATCC 12600 susceptible a partir de las 6 h, y se observó una erradicación completa (sin crecimiento de colonias) al final de 3 días (Figura 4A). Para la cepa L1163 susceptible a la gentamicina y la vencomicina-intermedia, ambos materiales liberadores de fármacos causaron una reducción >3log a las 6 h, y la erradicación completa (sin crecimiento de colonias) se observó el día 1 del experimento (Figura 4B). Para la cepa L1101 resistente a la gentamicina y a la vancomicina, la elución de gentamicina de UHMWPE no afectó la viabilidad bacteriana de L1101 (Figura 4C). Las bacterias proliferaron y la población se estabilizó en 6 h en presencia de UHMWPE virgen sin elución antibiótica. En presencia de UHMWPE liberador de gentamicina, la población alcanzó un nivel de crecimiento similar el día 2. Por el contrario, la elución de vancomicina de UHMWPE redujo significativamente la viabilidad bacteriana (>3log) a las 6 h, y la pérdida de viabilidad completa (sin crecimiento de colonias) se demostró en el día 4. Las superficies de UHMWPE liberadores de gentamicina y liberadores de vancomicina no mostraron bacterias adherentes viables cuando se expusieron a cepas susceptibles y resistentes a intermediarios después del día 7 o la erradicación completa, lo que ocurra primero. Algunas bacterias viables (1 x 105 UFC/ml) estaban presentes en UHMWPE liberador de gentamicina expuesto a L1101 resistente a la gentamicina. Del mismo modo, se recuperaron aproximadamente 1 x 10 5 UFC/ml de bacterias adherentes viables de la EP virgen control (Figura 5). Figura 2: Liberación promedio de antibióticos dependiente del tiempo del 7% p/p de la tira UHMWPE cargada con antibióticos. La liberación promedio de antibióticos entre puntos de tiempo de una tira UHMWPE cargada con gentamicina y vancomicina al 7% (3 mm 3 x 5 mm 3 x 10 mm3 ~ 2 cm 2 área de superficie). El CMI contra la cepa de control ATCC 12600 se muestra como una línea punteada para gentamicina y una línea continua para vancomicina. Las barras de error representan la desviación estándar de la media de seis réplicas (n = 6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Curva estándar del ensayo luminiscente en tiempo real para todas las cepas de S. aureus. El log (luminiscencia) se trazó contra log (UFC/mL) para generar curvas estándar para control, (A) ATCC 12600, y cepas clínicas, (B) L1101 y (C) L1163. Las ecuaciones que describen la línea de mejor ajuste y los valores correspondientes de R2 se indican en las gráficas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Viabilidad bacteriana determinada mediante un ensayo luminiscente para UHMWPE liberador de gentamicina al 7% p/p y UHMWPE liberador de vancomicina al 7% p/p. Se muestra la actividad antibacteriana dependiente del tiempo de gentamicina y vancomicina eluida de UHMWPE contra cepas control, (A) ATCC 12600, y cepas clínicas, (B) L1163 y (C) L1101. Virgin 1020 PE sirvió como control para el experimento. La línea amarilla en los gráficos indica el límite de detección para la cepa respectiva de S. aureus. Los datos se muestran como media ± desviación estándar (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Viabilidad bacteriana adherente determinada mediante el ensayo luminiscente Glo para UHMWPE liberador de gentamicina al 7% p/p y UHMWPE liberador de vancomicina al 7% p/p contra todas las cepas de S. aureus. El gráfico de barras indica bacterias adherentes (UFC) recuperadas por centímetro cuadrado (cm2) de UHMWPE cargadas con gentamicina al 7% y cargadas con vancomicina al final del período de estudio para todas las cepas probadas. Las barras muestran los datos como media ± desviación estándar (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Puntos de tiempo Vancomicina Gentamicina Concentración máxima (μg/mL) Concentración máxima (μg/mL) 0 – 6 h 336 ± 72 263 ± 24 6 h -1 día 57 ± 18 16 ± 2 1 día – 2 días 60 ± 18 7 ± 1 2 días – 3 días 23 ± 6 5 ± 0,4 3 días – 7 días 49 ± 20 15 ± 1 Tabla 2: Concentración máxima del fármaco (μg/mL) en diferentes puntos temporales. Los datos se muestran como media ± desviación estándar (n = 6). Figura complementaria 2: Decaimiento de la señal de luminiscencia durante un período de 10 min desde la adición del reactivo de ensayo a la muestra. Una diferencia del ±5% en la señal se muestra como una línea punteada Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

La administración sostenida localizada de antibióticos es una herramienta necesaria en el tratamiento de las infecciones articulares periprotésicas. Los antibióticos sistémicos son la estrategia primaria para erradicar la infección bacteriana, y la elución local se utiliza como una herramienta complementaria para prevenir el crecimiento y la colonización de cualquier bacteria restante después de la extracción del implante y el desbridamiento del tejido. El objetivo para el área efectiva bajo la curva (concentración durante un período) para los antibióticos con administración local no se comprende bien. La elución de antibióticos de tales dispositivos puede cuantificarse longitudinalmente in vitro; Sin embargo, para determinar el valor de traslación de estos perfiles de concentración, se necesita un método in vitro robusto para evaluar la actividad antibacteriana. En este documento, se describe uno de estos métodos en tiempo real para determinar la actividad antibacteriana del UHMWPE liberador de fármacos que se utilizará como un dispositivo de administración sostenida en reemplazos articulares.

El monitoreo en tiempo real de la viabilidad bacteriana es un parámetro crucial de interés, y los métodos microbiológicos convencionales carecen del marco para acomodar este aspecto específico del estudio. El ensayo de viabilidad microbiana utilizado en este estudio se desarrolló para la cuantificación de bacterias viables mediante la medición de la luminiscencia correspondiente al trifosfato de adenosina (ATP). Para investigar directamente la actividad dependiente del tiempo de los antibióticos eluidos de los materiales del implante, se incubaron con ellos tres cepas diferentes con distintos perfiles de susceptibilidad a los antibióticos. La justificación para utilizar cepas clínicas y de laboratorio con resistencias variables a la gentamicina y la vancomicina fue comprender el rango de actividad para una formulación de implante dada. Además, la actividad antibacteriana y la eficacia contra estas poblaciones distintas dependen del momento de la administración. El método se centra en la viabilidad de la profilaxis contra estas cepas basándose en que el >70% de las infecciones articulares periprotésicas son causadas por la contaminación de la herida en el momento de la cirugía24.

Como inóculo de partida para desarrollar este método, se utilizó 1 x 105 UFC/mL. Se han utilizado diferentes concentraciones contaminantes para modelos animales, aunque no se sabe mucho sobre la carga de infección clínicamente relevante para PJI. Los modelos de infección animal para PJI se han establecido rutinariamente utilizando 1 x 105 UFC, y un rango similar es ampliamente utilizado en métodos estandarizados (CLSI) para determinar la actividad antibacteriana25,26,27. El uso de 1 x 105 UFC/ml como concentración contaminante inicial nos permitió evaluar los parámetros de crecimiento y erradicación al mismo tiempo.

Convencionalmente, los valores de CMI se determinan para una concentración constante de antibióticos para un número específico de bacterias, y no demuestran la tasa de acción antibacteriana. Debido a este aspecto, los valores de CMI no proporcionan una diferenciación cuantitativa para describir el perfil de actividad antimicrobiana28. Los datos del método actual enfatizan la ventaja de evaluar la cinética de eliminación dependiente de la cepa de los antibióticos en lugar de usar el CMI para tomar decisiones de dosificación. Usando este método, fue posible diferenciar tanto la extensión como la velocidad a la que los materiales del implante afectaron las diferentes cepas. La gentamicina eluyente de las tiras de material del implante fue efectiva para erradicar L1163 en 1 día y erradicar ATCC 12600 en 2-3 días, pero fue ineficaz para erradicar L1101 (Figura 4). Además de la esperada falta de actividad de la elución de gentamicina contra L1101 (CMI >32 μg/mL) debido a su resistencia inherente a la gentamicina (Figura 4C), se observó la persistencia de subpoblaciones cuando se expuso a vancomicina, para la cual L1101 exhibe resistencia intermedia. Por el contrario, L1163 se erradicó definitivamente en presencia de UHMWPE liberador de vancomicina a pesar de exhibir una resistencia intermedia similar a la vancomicina como L1101 (se ha observado una CMI de 8 μg/ml para ambas cepas).

Las observaciones de que la tasa de actividad de gentamicina contra 12600 y L1163, que son susceptibles a la gentamicina con valores de CMI similares (se ha observado una CMI de 1 μg/ml para ambas cepas), fue diferente, así como que el grado de actividad de la vancomicina contra L1101 y L1163 resistentes a intermedias fue diferente (Figura 4A, B), apoyó la hipótesis de que este método en tiempo real en presencia del material eluyente podría diferenciar las diferencias longitudinales en la actividad.

Además del valor traslacional de los resultados en la interpretación de cuán efectiva puede ser una concentración eluida dada contra estas bacterias, existen varias ventajas metodológicas experimentales. (1) La concentración bacteriana se determina instantáneamente en un momento dado, contrariamente a los métodos convencionales en los que las bacterias se incuban en caldo o en agar durante 18-24 h para determinar la viabilidad. Este período de crecimiento puede proporcionar tiempo adicional para que las bacterias se recuperen del estrés antibiótico, introduciendo una posible fuente adicional de error / variabilidad. (2) El medio se reemplaza continuamente mientras se retienen las bacterias, que se asemejan más a las condiciones in vivo que a las condiciones estáticas. (3) Este ensayo incluye inherentemente la cinética de liberación del fármaco del implante, lo que permite una mejor predicción del rendimiento. (4) El método se ha desarrollado utilizando consumibles comúnmente disponibles sin necesidad de ninguna maquinaria específica o costosa.

Se necesitan métodos sólidos de prueba in vitro para evaluar las aplicaciones de administración de fármacos antes de proceder a estudios in vivo en animales y ensayos clínicos. Este ensayo se puede modificar y adaptar para adaptarse a diversos enfoques y plataformas de administración de fármacos, como partículas, geles, películas y otros materiales liberadores de fármacos, para determinar la eficiencia de la erradicación bacteriana en una configuración in vitro simulada. Se pueden realizar modificaciones para la configuración de la muestra cambiando a un medio in vitro adecuado, que ha demostrado influir en la actividad de varios antibióticos29,30.

El método también facilita la determinación viable de bacterias adherentes, lo cual es prometedor, ya que los métodos convencionales para determinar la concentración mínima de erradicación de biopelículas requieren mucho tiempo y ofrecen resultados inconsistentes. Sin embargo, el método debe probarse rigurosamente en biopelículas para desarrollar una metodología confiable y robusta para determinar su sensibilidad. El método luminiscente basado en ATP podría ser lo suficientemente sensible como para detectar formas viables de bacterias en biopelículas, incluidos los persistentes, que pueden o no detectarse en una placa de agar como colonias visibles. En conjunto, esta plataforma versátil tiene el potencial de incorporar parámetros relevantes para registrar observaciones en tiempo real sobre la actividad antibacteriana y antibiopelícula de los medicamentos de interés.

La eficacia de este método se rige por los siguientes aspectos:

Características de elución predeterminadas y tamaño de la muestra
El perfil de elución del material liberador de antibióticos se puede identificar en un experimento separado antes de esta medición de la actividad antibacteriana, de modo que se pueda determinar la cantidad de material requerido para realizar activamente el experimento dentro de un tiempo estipulado.

Determinación de contenedores y volúmenes
Es importante diseñar una configuración en la que el volumen de medios del experimento pueda acomodar toda el área de superficie del mismo material y garantizar un volumen suficiente para la liberación sin obstrucciones del fármaco de la superficie cargada de fármaco. La configuración utilizada se basó en la experimentación previa, asegurando condiciones de “sumidero perfecto” para estos fármacos hidrófilos de tal manera que su difusión no se vea obstaculizada por limitaciones de solubilidad.

Características de los medios de crecimiento
La selección de los medios de crecimiento debe investigarse para asegurar la estabilidad y el rendimiento óptimo del fármaco o fármacos seleccionados29. El caldo Mueller Hinton ajustado en cationes (CAMHB), que se usa ampliamente en el método de dilución del caldo, se utilizó para determinar la CMI de antibióticos conocidos. El medio permite una actividad óptima del fármaco sin la interferencia de la acumulación de metabolitos secundarios tóxicos31. El reactivo del ensayo ha sido probado y reportado estable en diferentes tipos de medios, incluyendo aquellos con componentes séricos23,28. Aunque los valores unitarios de luminiscencia relativa pueden variar entre diferentes medios, se ha demostrado que los componentes del medio no interfieren con el ensayo32,33. El volumen experimental se optimizó aún más a 1,5 mL, que está cerca del volumen de líquido sinovial presente en un espacio articular de rodilla adulto34.

Estabilidad de temperatura para el ensayo
La manipulación y adición del reactivo luminiscente al ensayo debe realizarse de manera consistente en todos los experimentos. Los cambios de temperatura alteran la sensibilidad del ensayo, por lo que es importante incubar el reactivo a temperatura ambiente durante 2 h antes de añadirlo a la bacteria23.

Tiempo de incubación del reactivo
La luminiscencia del reactivo decae con el tiempo. La señal luminiscente tiene una vida media de más de 30 minutos, que depende en gran medida del medio y del tipo de bacteria utilizada en el experimento23. Además, cualquier diferencia en el tiempo de incubación (es decir, el tiempo entre la adición del reactivo a la bacteria y la lectura de la luminiscencia) dará como resultado lecturas inconsistentes para la misma concentración de bacterias. Se observó una diferencia del 5% en la señal luminiscente cuando se tomó dentro de 1 minuto después del tiempo de incubación de 5 minutos de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura complementaria 2). Teniendo en cuenta estos datos, las lecturas de luminiscencia se registraron en 1 minuto durante todo el estudio para garantizar que la pérdida de señal no fuera superior al 5%. Además, es importante limitar el número de muestras por placa para reducir el error introducido debido a la desintegración de la luminiscencia desde el primer pozo hasta el último pozo.

Mantenimiento de la población bacteriana durante todo el estudio
El método intentó modelar el aclaramiento del fármaco y la rotación del volumen sinovial separando continuamente los medios gastados de la población bacteriana en cada punto de tiempo utilizando centrifugación de alta velocidad a 10,000 x g durante 10 min35. Este paso crítico asegura la sedimentación de todas las células bacterianas viables y no viables. Además de esto, las bacterias sedimentadas se reconstituyen uniformemente en MHB fresco y se transfieren a la configuración de la jeringa, lo que facilita el traslado completo de la población microbiana afectada a la configuración experimental. La reproducibilidad y fiabilidad de este método dependen en gran medida de la simulación de la exposición sostenida de antibióticos a la población microbiana derivada del inóculo inicial.

Una limitación clave de este método es que es un ensayo semiestático que no simula con precisión las vidas medias del fármaco y el recambio sinovial continuo. Sin embargo, el reemplazo continuo del medio compensa parcialmente esta limitación. La sensibilidad del ensayo de viabilidad microbiana fue dependiente de la cepa, variando de 1 x 102-1 x 104 UFC/ml, lo que limita la capacidad de detección. Además, es necesario trazar una curva estándar para cada organismo, ya que el tipo de cepa contribuye a la sensibilidad y el rendimiento del reactivo luminiscente. Tanto la dinámica de crecimiento de las bacterias como la actividad del compuesto farmacológico utilizado pueden verse afectadas por los componentes del medio, que deben investigarse más a fondo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado parcialmente por los Institutos Nacionales de Salud Grant No. AR077023 (R01) y por el Laboratorio Ortopédico Harris. Kerry Laplante y su equipo de la Universidad de Rhode Island por proporcionar las cepas clínicas L1101 y L1163.

Materials

 96 well plates – polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs Corning, NY, USA CLS3922-100EA
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich, Germany
ATCC 12600 American Type culture Collection, VA, USA
BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay Promega Corporation, USA G8231
BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) Becton-Dickinson, USA BD 211825 purchased from Fisher Scientific, USA
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL BD, USA 309657
BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G BD, USA 305122
BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) Becton-Dickinson, USA B12322 purchased from Fisher Scientific, USA
BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) Becton-Dickinson, USA DF0369-17-6 purchased from Fisher Scientific, USA
Boric Acid  Fisher Chemical, NJ, USA
Branson 1800 ultrasonic bath Emerson, MO, USA
Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid Fisher Scientific, USA 08-757-100D
Gentamicin Sulfate  Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China
Greiner UV-Star 96 well plates Sigma Aldrich, Germany M3812-40EA
Hydraulic press Carver, Inc. Wabash, IN, USA
L1101  Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island
L1163  Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island
LSE benchtop shaking incubator Corning, NY, USA
Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical Fisher Scientific, NJ, USA A454-1
Napco CO2 6000 Thermo Scientific, MA, USA
PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents Fisher Scientific, USA BP24384
Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) Sigma Aldrich, Germany P1378-5g
Plate reader (Synergy H1 Biotek, VT, USA
press Carver, Inc. Wabash, IN, USA
shaker Innova 2100 New Brunswick Scientific, NJ, USA
ShopBot D2418 ShopBot Tools, Inc., NC, USA
Sodium Hydroxide  Sigma Aldrich, Germany
Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water Fisher Scientific, USA 23-751628
UHMWPE GUR1020, Celanese, TX, USA
Vancomycin Hydrochloride  Fagron, The Netherlands 804148
WAB Turbula WAB Turbula, Switzerland
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Sekar, A., Lekkala, S., Oral, E. A Novel Method to Determine the Longitudinal Antibacterial Activity of Drug-Eluting Materials. J. Vis. Exp. (193), e64641, doi:10.3791/64641 (2023).
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