İlaç Salınımlı Malzemelerin Uzunlamasına Antibakteriyel Aktivitesini Belirlemek İçin Yeni Bir Yöntem

1. Reaktiflerin hazırlanması Mueller-Hinton suyu (MHB) preparatı: 22 g katyon ayarlı MHB’yi 1 L deiyonize suda çözün. Ortamı 20 dakika boyunca 121 ° C ve 15 lb basınçta otoklavlayın ve şişenin gevşek bir şekilde kapatıldığından emin olun. Hazırlanan steril suyu kullanıma kadar 4 °C’de saklayın. Triptik soya agar (TSA) preparatı: 20 g TSA tozunu 500 mL deiyonize suda çözün. Agar karışımını 121 ° C’de ve 15 lb’de 20 dakika boyunca otoklavlayın. Erimiş agarın sıcaklığını düşürmek için steril ortamı 55 ° C’lik bir su banyosuna aktarın. Soğutulmuş hazırlanmış agar’ı steril Petri kaplarına (~ 15 mL) dökün ve katılaşmasını sağlayın. Yoğuşmayı önlemek için katılaşmış agar plakalarını ters çevrilmiş olarak saklayın. Triptik soya suyu (TSB) preparatı: 15 g TSB tozunu 500 mL deiyonize suda çözün. Et suyu karışımını 121 ° C’de ve 15 lb’de 20 dakika boyunca otoklavlayın. Hazırlanan steril suyu kullanıma kadar 4 °C’de saklayın. Fosfat tamponlu salin (PBS): Otoklav, steril kullanımdan önce 121 ° C’de 1x PBS ve 20 dakika boyunca 15 lb ticari olarak satın alındı. Mikrobiyal canlılık testi reaktif preparatı: Tahlilin içeriğini oda sıcaklığına dengeleyin. 10 mL tamponu liyofilize ışıldayan reaktif tozu ile karıştırın ve hazırlanan reaktifi -20 ° C’de 1 mL alikot olarak saklayın. Her zaman noktasından önce, ışığa duyarlı reaktifi çözün ve oda sıcaklığına getirin. Gentamisin sülfat stok çözeltisi: 80 mg gentamisin sülfat (GS) 10 mL 1x PBS içinde çözülür. 8 mg/mL GS stok çözeltisi elde etmek için ilaç çözeltisini iyice vorteksleyin. Vankomisin hidroklorür stok çözeltisi: 1 mg / mL stok çözeltisi elde etmek için 10 mg vankomisin hidroklorür tozunu 10 mL deiyonize su içinde iyice çözün. Borik asit tampon çözeltisi: 24.7 g (0.4 M) borik asidi 900 mL deiyonize su içinde çözün. Çözeltinin pH’ını% 50 (w / v) sodyum hidroksit çözeltisi ile 10.4’e ayarlayın. Bu adıma ek olarak, 1 L’ye çıkarmak için deiyonize su ekleyin. O-ftaldialdehit reaktifi (OPA): 0.2 g OPA’yı 1 mL metanol içinde çözün. OPA çözeltisine 19 mL 0.4 M borik asit tamponu (pH 10.4) ekleyin. OPA-borik asit karışımına 0.4 mL 2-merkaptoetanol ekleyin. Reaktif şişesini alüminyum folyo ile örtün ve hazırlıktan sonra 2-3 güne kadar kullanmak üzere 4 ° C’de saklayın.DİKKAT: Cilt, göz ve giysilerle temastan kaçının. OPA ve 2 merkaptoetanol reaktiflerinin taşınması, uygun kişisel koruyucu ekipman giyilirken yalnızca uygun egzoz havalandırmasına sahip bir duman davlumbazının altında yapılmalıdır. Buharları, tozu veya aerosolleri solumaktan kaçının. 2. Bakire ve ilaç yüklü UHMWPE hazırlanması Gentamisin sülfat ve vankomisin hidroklorür tozlarının her birini bir elek (75 μm gözenek boyutu) ile 2 g eleyin ve 18-24 saat boyunca vakumlu fırında (<0.1 atm) 45 ° C'de dehidrat edin. Susuz bırakılmış ilacı, 5 dakika boyunca mekanik bir karıştırıcı kullanarak bir kapta% 7 w / w (1.12 g antibiyotik + 14.88 g UHMWPE) UHMWPE tozu ile karıştırın. Paslanmaz çelik kesici uç plakalı alüminyum bronz özel bir kalıbı (85 mm x 50 mm) konveksiyonlu fırında 1 saat boyunca 180 ° C’ye ısıtın. Presin plakalarını önceden 170 ° C’ye ısıtın. Harmanlanmış tozu kalıba ekleyin ve 10 MPa, 170 ° C’de 10 dakika sıkıştırın, ardından 10 MPa’da 45 dakikalık bir su soğutma döngüsü izleyin. Kalıplanmış UHMWPE bloğunu (~3,5 mm) bir hidrolik pres kullanarak presten çıkarın. Yüzey düzensizliklerini ve kirleticileri gidermek için bilgisayarlı bir sayısal kontrol (CNC) kullanarak bloğun üst ve alt yüzeylerini frezeleleyin. CNC kullanarak bloğu 3 mm x 5 mm x 20 mm şeritler halinde kesin. Bakire UHMWPE (antibiyotik ilavesi olmadan), çalışma için bir kontrol olarak tanımlandığı gibi aynı metodolojiyi kullanarak hazırlayın. Ek Şekil 1: UHMWPE numunelerinin kalıplanmasında kullanılan kalıbın parçaları. (A) Paslanmaz çelik kesici uç plakası; (B) kalıp boşluğu; (C) piston; (D) arka plaka Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. 3. İlaç salınımlı UHMWPE’nin elüsyon kinetiğinin belirlenmesi 3 mm x 5 mm x 20 mm’lik bir şeridi, Luer kilidi ve 25 G iğnesi olan 3 mL’lik bir şırıngaya yerleştirin. Şırıngayı deiyonize suyla doldurarak ve şırıngayı birkaç kez ters çevirerek şeridi yıkayın. Şırıngayı 2 mL mezuniyete kadar deiyonize suyla doldurun. Şırınga düzeneğini oda sıcaklığında 100 rpm’de bir çalkalayıcıya yerleştirin. Her zaman noktasında (6 saat, 1 gün, 2 gün, 3 gün, 1 hafta), elüenti 2 mL’lik bir şişede toplayın. Her zaman noktasında, şırıngayı deiyonize suyla doldurarak ve şırıngayı ters çevirerek şeridi yıkayın. Çözeltiyi atın ve bir sonraki zaman noktasına kadar deneye devam etmek için şırıngayı 2 mL mezuniyete kadar deiyonize suyla doldurun. 4. Vankomisin konsantrasyonunun belirlenmesi Vankomisin konsantrasyonunu deiyonize suda spektrofotometrik olarak 280 nm’lik bir tepe absorpsiyon dalga boyunda tespit edin. UV 96 kuyucuklu plakaya 100 μL 1 mg/mL stok çözeltisi ekleyerek ve altı seviye bilinen konsantrasyon (1 mg/mL ila 0,03125 mg/mL) elde etmek için 100 μL deiyonize su kullanarak seri olarak seyrelterek bilinen konsantrasyon aralığı standartlarını hazırlayın. Elüentlerin 100 μL’sini UV berraklığında 96 delikli plakalara aktarın ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak konsantrasyonu 280 nm’de belirleyin. Bilinen ilaç konsantrasyonlarını karşılık gelen absorbans değerlerine göre çizerek bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Kalibrasyon eğrisi tarafından oluşturulan doğrusal denklemi kullanarak elüentteki bilinmeyen ilaç konsantrasyonunu hesaplayın. Konsantrasyonu elüent hacmi (~ 1.7 mL) ile çarparak ilaç kütlesini belirleyin. İlaç salınımını önceki tüm zaman noktalarından toplayarak bir zaman noktasında kümülatif ilaç salınımını (mg) hesaplayın. İmplantın santimetre karesi (cm2) başına kümülatif ilaç salınımını belirlemek için ilaç salınımını şeridin yüzey alanına (3,5cm2) normalleştirin. 5. OPA etiketleme yöntemi ile gentamisin konsantrasyonunun belirlenmesi 27 OPA testini gerçekleştirmek için GS standart çözümleri hazırlayın.80 μg/mL GS çözeltisinin 1 mL’sini bir santrifüj tüpüne aktarın. Beş santrifüj tüpüne daha 500 μL PBS ekleyin. 80 μg/mL, 40 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL ve 2,5 μg/mL GS konsantrasyonları elde etmek için bu tüplerle seri seyreltme gerçekleştirin. Bunlar tahlil için kalibrasyon çözeltileri olarak hizmet eder. Net bir 96 delikli plakada, artan konsantrasyonda A-1 kuyusuna 80 μL PBS ve A-2 ila A-7 kuyularına 80 μL kalibrasyon çözeltisi ekleyin. Bu, tahlil için dahili bir kalibrasyon görevi görür. Aynı 96 delikli plakada analiz edilmek üzere üçlü olarak boş kuyucuklara her numuneden 80 μL ekleyin. Kuyu plakası başına numune sayısını <50 ile sınırlandırın, böylece numunelere OPA çözeltisinin eklenmesinin zamanlaması tüm numuneler için yaklaşık olarak aynıdır ve buharlaşmayı önler. OPA reaktifini tüm standartlara ve numune çözeltilerine ekleyin.Bir duman davlumbazında, 25 mL’lik bir reaktif haznesini metanol ile doldurun. İkinci bir reaktif rezervuarına 8 mL metanol ve hazırlanan OPA çözeltisinden 1 mL ekleyin (bölüm 1.8). Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Çok kanallı 100 μL mikropipet ile, 96 delikli plakadaki numune içeren tüm kuyucuklara ilk hazneden 48 μL metanol ekleyin. Bu adıma ek olarak, ikinci rezervuardan 96 delikli plakadaki tüm numune içeren kuyucuklara 72 μL seyreltilmiş OPA çözeltisi ekleyin. Kuyu plakasını oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 10 dakikalık inkübasyondan hemen sonra bir mikroplaka okuyucu kullanarak floresan yoğunluğunu (340 nm uyarım, 455 nm emisyon) ölçün. Bilinen GS konsantrasyonlarına sahip çözeltiler için yoğunluk okumalarını kullanarak kalibrasyon eğrisini çizin. En uygun olanı belirlemek ve karşılık gelen denklemi oluşturmak için doğrusal bir çizgi ekleyin. Elüentteki ilaç konsantrasyonunu, bilinen ilaç konsantrasyonlarını karşılık gelen absorbans değerlerine göre çizerek oluşturulan kalibrasyon eğrilerinden hesaplayın. Konsantrasyonu elüent hacmi (~ 1.7 mL) ile çarparak ilaç kütlesini hesaplayın. İlaç salınımını önceki tüm zaman noktalarından toplayarak bir zaman noktasında kümülatif ilaç salınımını (mg) belirleyin. İmplantın santimetre karesi (cm2) başına kümülatif ilaç salınımını belirlemek için ilaç salınımını şeridin yüzey alanına (3,5cm2) normalleştirin. 6. Bakteri preparatı NOT: Bu çalışmada aşağıdaki S. aureus suşları kullanılmıştır: tip suşu 12600, klinik suşlar L1101 ve L1163 (Rhode Island Üniversitesi’nden Dr. Kerry LaPlante’den alınmıştır). Bu suşların duyarlılık profilleri Tablo 1’de sunulmuştur. Bakteri suşları Gentamisin MIC Vankomisin MIC ATCC 12600 · ≤1 μg/mL (Hassas) ≤0,5 μg/mL (Hassas) L1101 (Klinik suş) ≥16 μg/mL (Dirençli) 8 μg/mL (Orta) L1163 (Klinik suş) ≤1 μg/mL (Hassas) 8 μg/mL (Orta) Tablo 1: Kontrol ve klinik S. aureus suşlarının antibiyotik duyarlılık profilleri. DİKKAT: Bakteri kültürlerinin ve süspansiyonlarının elleçlenmesini içeren tüm adımlar, Sınıf II, Tip A2 Biyogüvenlik Kabini içindeki bir BSL-2 laboratuvar alanında gerçekleştirilmiştir. S. aureus’un büyümesini kolaylaştırmak için bakteri stoklarını -80 ° C’den TSA plakalarına çözün. Plakaları gece boyunca 35 ° C’de statik olarak inkübe edin. Gece boyunca yetiştirilen agar plakası kültürlerinden iki ila üç koloniyi 1 mL steril TSB’ye aktarın ve 35 ° C’de gece boyunca statik olarak inkübe edin. 600 nm’de absorbansı belirleyerek bulanıklığı spektrofotometrik olarak ölçmek için 100 μL bakteriyi berrak bir 96 delikli plakaya aktarın. Lüminesan tahlili kullanarak canlı bakteri sayısını belirlemeden önce steril MHB kullanarak bakterileri 10.000 kat seyreltin. 7. Gerçek zamanlı mikrobiyal canlılık testinin yapılması Lüminesans bazlı tahlili beyaz opak tabanlı 96 delikli plakalar kullanarak gerçekleştirin. 100 μL seyreltilmiş bakteri süspansiyonlarını, bölüm 1.5’te hazırlanan 100 μL tahlil reaktifi ile karıştırın. Hazırlanan 96 delikli plakanın üzerine alüminyum folyo ile kaplı bir kapak yerleştirin ve 100 rpm çalkalayarak 5 dakika boyunca inkübe edin. Gen5 3.11 yazılımında aşağıdaki ayarları kullanarak bir mikro plaka okuyucu ile lüminesansı hemen ölçün.Görev Yöneticisi penceresinde bir protokol ayarlamak için Yeni’yi tıklatın. Plaka Tipi için açılır menüden Costar 96 beyaz opak’ı seçin. Adımları Seç > Eylemler menüsünün altındaki Oku’ya tıklayın. Read Method (Okuma Yöntemi) penceresinde Luminescence (Lüminesans) öğesine tıklayın. Okuma türü ve optik türü altında Uç nokta/kinetik ve Lüminesans fiber seçeneklerini seçili tutun. Tamam’a tıklayın. Okuma Adımı penceresinde ayarları koruyun (kazanç = 135; entegrasyon süresi = 1 sn; okuma yüksekliği = 4,5 mm). Tamam’a tıklayın. Plaka düzeni penceresi çalışmaya hazır görünür. Yükleme plakası penceresindeki Kapağı Kullan kutusunu işaretleyin ve Tamam’a tıklayın. Lüminesans değerlerini okumak için 96 delikli plakayı makineye yerleştirin. 8. Her bakteri suşu için canlı sayım standart eğrisine karşı bir lüminesans oluşturma NOT: Tüm S. aureus suşlarını bölüm 6’da açıklanan metodolojiye göre kültürleyin ve numaralandırın. Standart olarak kullanılmak üzere seri olarak seyreltilmiş bakteriyel süspansiyonlar hazırlayın.Bulanıklığı spektrofotometrik olarak ölçerek gece boyunca yetiştirilen bakteriyel süspansiyonu numaralandırın. Bakterileri pelet etmek için 5 dakika boyunca 6.000 × g’da santrifüj yapın ve konsantrasyonu 1 x 109 CFU / mL’ye ayarlamak için peleti steril MHB’de yeniden askıya alın. 900 μL MHB kullanarak 100 μL temiz süspansiyonu seyreltin ve 1 x 101 CFU /mL’ye ulaşmak için 10 kat seri seyreltme gerçekleştirin. Hazırlanan bakteriyel süspansiyonlar üzerinde lüminesans testini bölüm 7’de açıklandığı gibi gerçekleştirin. Steril MHB’yi deney için boş bir kontrol olarak kullanın ve boş lüminesans değerini test numunesi lüminesans değerlerinden çıkarın. Standart bir eğri oluşturmak için günlüğü (CFU) kütüğe (lüminesans) karşı çizin. Denklemi ve R2 değerini kaydedin. Etüt boyunca gerinim spesifik denklemi kullanarak lüminesans değerlerine karşılık gelen CFU/mL’yi belirleyin. 9. Zamana bağlı antibakteriyel aktivite çalışması kurulumu Şekil 1: Deney düzeneğinin şematik bir gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Bakterileri 1 mL TSB suyunda bir gecede kültürleyin. Gece boyunca yetiştirilen bakteri süspansiyonunu steril MHB’de 105 CFU / mL’ye seyreltin (bölüm 6) ve deneyin başlamasından önce lüminesans birimlerini kullanarak canlı bakteri sayısını doğrulayın (bölüm 7). Bakire UHMWPE ve ilaç yüklü UHMWPE şeritlerini (3 mm x 5 mm x 10 mm, bölüm 2’deki elüsyon çalışmaları için hazırlanan şeritlerin yarısı kadar) 3 mL’lik bir şırınga içine yerleştirin. 105 CFU/mL içeren MHB’yi, 1,35 mL MHB’ye eşdeğer olan 1,5 mL işaretine kadar bağlı iğneden şırıngaya çekin (Şekil 1: Adım 1). Şırınga kurulumunu, 6 saat, Gün 1, Gün 2, Gün 3, Gün 4, Gün 5, Gün 6 ve Gün 7’nin belirtilen zaman noktalarına kadar 37 ° C’de bir sallama inkübatörüne (100 rpm) yerleştirin (Şekil 1: Adım 2). Belirtilen her zaman noktasında, şırınga kurulumunu çıkarın ve 100 μL bakteriyel süspansiyon üzerinde bölüm 7’ye göre gerçek zamanlı bir mikrobiyal canlılık testi yapın (Şekil 1: Adım 3-4). 6 saat, Gün 1, Gün 2, Gün 3 ve Gün 7 zaman noktaları için canlı bakteri sayısını belirleyin. İlgili standart eğriyi kullanarak lüminesans birimlerinden CFU/mL’yi belirleyin. TSA plakaları üzerinde yayılma plakası yöntemini uygulayarak ve gece boyunca 35 ° C’de inkübe ederek tespit sınırının altında lüminesans değerleri gösteren numunelerde canlı bakteri bulunmadığını doğrulayın. Ertesi gün kolonilerin varlığını kontrol edin. Kalan bakteriyel süspansiyonu 10 dakika boyunca 10.000 × g’da santrifüj edin ve harcanan ortamı nazikçe aspire edin. İlaçların antibakteriyel aktivitesi nedeniyle peletlerin görsel olarak gözlenmediği tüplerde, görünmeyen peletin rahatsız edilmemesini sağlamak için tüpün içinde 100 μL bırakın (Şekil 1: Adım 5). Peletlenmiş bakterileri taze MHB’de yeniden askıya alın ve bakteriyel süspansiyonu ekli iğne aracılığıyla aynı şırınga kurulumuna geri çekin (Şekil 1: Adım 6). 10. UHMWPE yüzeyindeki yapışkan bakterilerin miktarının belirlenmesi 7. Günde çalışmanın tamamlanmasından sonra şırınga kurulumundan bakire UHMWPE ve ilaç yüklü UHMWPE yüzeylerini alın. Yüzeyleri 1,5 mL tüplere aktarın ve 1 mL steril PBS ile durulayın (üç kez). Yüzeyi 40 mL steril PBS’de 1 dakika boyunca sonikleştirin. Bölüm 7’de açıklandığı gibi, sonikasyonlu numunenin 100 μL’si üzerinde bir lüminesans testi yaparak yapışkan bakteri canlılığını belirleyin.