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Immunology and Infection

Un nuovo metodo per determinare l'attività antibatterica longitudinale dei materiali a rilascio di farmaco

Published: March 03, 2023
doi:
10.3791/64641
, ,
1Harris Orthopaedics Laboratory,Massachusetts General Hospital, 2Department of Orthopaedic Surgery,Harvard Medical School

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per valutare l’efficacia antibatterica di un polimero a rilascio di antibiotico per simulare l’applicazione clinica profilattica utilizzando un saggio di vitalità microbica luminescente basato su ATP in tempo reale disponibile in commercio. Questo metodo consente il monitoraggio dell’attività longitudinale dei materiali a rilascio di farmaco e può essere ampiamente adattato per testare piattaforme di somministrazione di farmaci antimicrobici.

Abstract

Il polietilene ad altissimo peso molecolare (UHMWPE) è ampiamente utilizzato nelle artroplastiche articolari totali come superficie portante. Le infezioni articolari periprotesiche, la maggior parte delle quali si verificano poco dopo la sostituzione dell’articolazione, costituiscono quasi il 25% degli interventi chirurgici totali di revisione del ginocchio e la completa eradicazione dell’infezione batterica rappresenta una sfida importante. Un modo promettente per affrontare questo problema è garantire la consegna locale sostenuta di concentrazioni di antibiotici sufficienti a inibire i batteri per supportare la profilassi antibiotica sistemica di routine. Vi è una maggiore ricerca sullo sviluppo di efficienti dispositivi locali per la somministrazione di farmaci. Sebbene i metodi di test antibatterici consolidati per i farmaci possano essere utilizzati per testare l’efficacia antibatterica dei materiali a rilascio di farmaco, mancano in termini di fornitura di dati di efficacia antibatterica longitudinale in tempo reale che possono essere correlati ai profili di eluizione degli antibiotici da questi dispositivi. Qui, riportiamo una metodologia diretta e versatile per determinare l’efficacia antibatterica degli impianti UHMWPE a rilascio di antibiotico. Questa metodologia può essere utilizzata come piattaforma per evitare la coltura batterica in ogni momento di un lungo esperimento e può anche essere adattata ad altri dispositivi locali di somministrazione di farmaci.

Introduction

L’osteoartrite è una condizione degenerativa significativa che affligge 500 milioni di adulti in tutto il mondo1. Il gold standard nel trattamento dell’artrite allo stadio terminale è la sostituzione totale dell’articolazione, che si prevede verrà eseguita in oltre 2 milioni di pazienti ogni anno solo negli Stati Uniti entro il 20302, con una domanda globale in aumento enorme 3,4. La procedura prevede la sostituzione delle superfici cartilaginee articolate delle articolazioni con materiali sintetici portanti in metallo/ceramica e polietilene ad altissimo peso molecolare reticolato (UHMWPE). Le protesi articolari totali migliorano significativamente la qualità della vita dei pazienti affetti da artrite5, ma una complicanza significativa che mette in pericolo le prestazioni degli impianti e la soddisfazione dei pazienti è l’infezione dell’articolazione periprotesica (PJI), che rappresenta il 15% -25% degli interventi chirurgici di revisione6. Si ritiene che la causa dell’infezione nella maggior parte dei casi sia la contaminazione microbica del sito implantare durante l’intervento chirurgico7. La popolazione contaminante si espande quindi sulle superfici implantari e tissutali8. Il sistema immunitario ospite viene attivato in risposta, ma il tasso di crescita e la formazione di biofilm degli organismi contaminanti possono consentire loro di eludere le cellule immunitarie, il che può portare a una tempesta di citochine e chemochine intensificata senza l’eradicazione dei batteri 9,10,11. La conseguente infezione profonda dell’osso mette a repentaglio la fissazione e le prestazioni dell’impianto, nonché la salute del paziente12.

Lo Staphylococcus aureus e gli stafilococchi coagulasi-negativi sono gli organismi causali predominanti di PJI13. La gravità delle infezioni da stafilococco è elevata a causa della loro maggiore resistenza agli antibiotici, della formazione di biofilm e della capacità di persistere come piccole varianti di colonia14,15,16. Le infezioni associate all’impianto si verificano a causa dell’adesione di microrganismi sulla superficie dell’impianto e della creazione di una complessa matrice di biofilm che consente ai batteri di eludere i fattori immunitari deleteri dell’ospite e le concentrazioni efficaci di antibiotici14,15,16. I metodi di trattamento convenzionali includono combinazioni di antibiotici per via endovenosa e orale per un periodo prolungato17. Uno dei principali svantaggi di questo approccio è la bassa biodisponibilità del farmaco nel sito di infezione e la difficoltà di raggiungere concentrazioni sufficienti di antibiotici per sradicare i batteri in modo coerente durante il periodo di trattamento, che spesso si traduce in scarsi risultati18. Per ovviare a queste carenze, è stato progettato un impianto UHMWPE localizzato a rilascio di farmaco completamente funzionale per garantire un rilascio prolungato di concentrazioni efficaci di antibiotici nello spazio articolare19. L’eluizione locale dall’impianto a rilascio di farmaco viene utilizzata come strumento complementare per prevenire la crescita e la colonizzazione di eventuali batteri rimasti dopo la rimozione dell’impianto e lo sbrigliamento del tessuto. I test antibatterici in vitro di questo UHMWPE a rilascio di antibiotico possono essere eseguiti incubando il materiale direttamente con i batteri e quantificando i batteri con il metodo della piastra di diffusione20,21. In alternativa, aliquote di mezzi eluenti possono essere testate contro i batteri usando metodi come il metodo di diffusione del disco di agar, i metodi di diluizione del brodo e il test time-kill22. Tutti questi metodi si basano sull’osservazione della crescita circa 16-18 ore dopo la raccolta delle aliquote mediante il conteggio delle colonie e le misurazioni della torbidità. L’eluizione di antibiotici da tali dispositivi può essere quantificata longitudinalmente utilizzando questi metodi in vitro; Tuttavia, per determinare il valore traslazionale di questi profili di concentrazione, è necessario un solido metodo in vitro in tempo reale per valutare l’attività antibatterica.

Il saggio di vitalità microbica utilizzato in questo studio è stato sviluppato per la quantificazione di batteri vitali misurando la luminescenza corrispondente all’adenosina trifosfato (ATP) rilasciata da una cellula batterica viva utilizzando la tecnologia di rilevamento basata sulla luciferina-luciferasi. L’ATP, come valuta energetica delle cellule viventi, funge da indicatore diretto delle cellule fisiologicamente vitali. Il reagente esegue la lisi cellulare, che rilascia molecole di ATP da cellule vitali che vengono poi rilevate sotto forma di luminescenza. Questa luminescenza ha una correlazione diretta con la proporzione di cellule batteriche vitali all’interno del campione23. Si tratta di un test in tempo reale, semplice, versatile, veloce, basato su un singolo reagente che può essere adattato in una varietà di progetti di test e condizioni con microrganismi gram-positivi e gram-negativi. Qui riportiamo un metodo per determinare l’attività antibatterica in tempo reale di UHMWPE a rilascio di antibiotico incubato con ceppi clinici e di laboratorio di S. aureus utilizzando un saggio time-kill modificato basato sul saggio di vitalità microbica (ad esempio, BacTiter Glo). Mentre la metodologia è descritta con un materiale implantare specifico e una specifica applicazione ortopedica, il metodo può fornire una piattaforma per testare altri dispositivi di somministrazione a rilascio di antibiotico con applicazioni cliniche.

Protocol

1. Preparazione dei reagenti Preparazione del brodo Mueller-Hinton (MHB): sciogliere 22 g di MHB cationico in 1 L di acqua deionizzata. Autoclavare il fluido a 121 °C e 15 libbre di pressione per 20 minuti, assicurandosi che la bottiglia sia coperta liberamente. Conservare il brodo sterile preparato a 4 °C fino all’uso. Preparazione triptica di agar di soia (TSA): sciogliere 20 g di polvere TSA in 500 ml di acqua deionizzata. Autoclavare la miscela di agar a 121 °C e 15 lb per 20 min. Trasferire il mezzo sterile a bagnomaria a 55 °C per abbassare la temperatura dell’agar fuso. Versare l’agar preparato raffreddato su piastre di Petri sterili (~ 15 ml) e lasciarlo solidificare. Conservare le piastre di agar solidificate invertite per evitare la condensa. Preparazione triptica del brodo di soia (TSB): sciogliere 15 g di polvere di TSB in 500 ml di acqua deionizzata. Autoclavare la miscela di brodo a 121 °C e 15 lb per 20 min. Conservare il brodo sterile preparato a 4 °C fino all’uso. Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): Autoclave acquistata commercialmente 1x PBS a 121 °C e 15 lb per 20 minuti prima dell’uso sterile. Preparazione del reagente del saggio di vitalità microbica: equilibrare il contenuto del saggio a temperatura ambiente. Mescolare 10 mL di tampone con la polvere di reagente luminescente liofilizzata e conservare il reattivo preparato a -20 °C come aliquote da 1 ml. Prima di ogni punto temporale, scongelare il reagente sensibile alla luce e portarlo a temperatura ambiente. Soluzione madre di gentamicina solfato: sciogliere 80 mg di gentamicina solfato (GS) in 10 ml di 1x PBS. Vortice accuratamente la soluzione del farmaco per ottenere una soluzione madre di GS da 8 mg/ml. Soluzione madre di vancomicina cloridrato: sciogliere accuratamente 10 mg di polvere di vancomicina cloridrato in 10 ml di acqua deionizzata per ottenere una soluzione madre da 1 mg/ml. Soluzione tampone di acido borico: sciogliere 24,7 g (0,4 M) di acido borico in 900 ml di acqua deionizzata. Regolare il pH della soluzione a 10,4 con una soluzione di idrossido di sodio al 50% (p/v). Oltre a questo passaggio, aggiungere acqua deionizzata per arrivare a 1 L. Reagente di O-pthaldialdeide (OPA): sciogliere 0,2 g di OPA in 1 mL di metanolo. Aggiungere 19 mL di tampone acido borico 0,4 M (pH 10,4) alla soluzione OPA. Aggiungere 0,4 ml di 2-mercaptoetanolo alla miscela di acido OPA-borico. Coprire il flaconcino del reagente in un foglio di alluminio e conservare a 4 °C per l’uso fino a 2-3 giorni dopo la preparazione.ATTENZIONE: Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e gli indumenti. La manipolazione dell’OPA e dei 2 reagenti di mercaptoetanolo deve essere effettuata solo sotto una cappa aspirante con adeguata ventilazione di scarico indossando adeguati dispositivi di protezione individuale. Evitare di respirare vapori, polvere o aerosol. 2. Preparazione di UHMWPE vergine e caricato con farmaci Setacciare 2 g ciascuno di polveri di gentamicina solfato e vancomicina cloridrato con un setaccio (dimensione dei pori 75 μm) e disidratare a 45 °C in forno sottovuoto (<0,1 atm) per 18-24 ore. Miscelare il farmaco disidratato con polvere UHMWPE al 7% p/p (1,12 g di antibiotico + 14,88 g di UHMWPE) in un contenitore utilizzando un miscelatore meccanico per 5 minuti. Preriscaldare uno stampo personalizzato in bronzo alluminio (85 mm x 50 mm) con piastre di inserimento in acciaio inox a 180 °C in forno a convezione per 1 h. Preriscaldare le piastre della pressa a 170 °C. Aggiungere la polvere miscelata allo stampo e comprimere a 10 MPa, 170 °C per 10 minuti, quindi un ciclo di raffreddamento ad acqua di 45 minuti a 10 MPa. Rimuovere il blocco UHMWPE stampato (~ 3,5 mm) dalla pressa utilizzando una pressa idraulica. Fresare le superfici superiore e inferiore del blocco utilizzando un controllo numerico computerizzato (CNC) per rimuovere eventuali irregolarità superficiali e contaminanti. Tagliare il blocco in strisce da 3 x 5 mm x 20 mm utilizzando il CNC. Preparare UHMWPE vergine (senza l’aggiunta di antibiotici) utilizzando la stessa metodologia descritta come controllo per lo studio. Figura supplementare 1: Parti dello stampo utilizzate per lo stampaggio dei campioni UHMWPE. (A) Piastra di inserimento in acciaio inossidabile; (B) cavità dello stampo; c) stantuffo; (D) piastra posteriore Fare clic qui per scaricare questo file. 3. Determinazione della cinetica di eluizione dell’UHMWPE a rilascio di farmaco Inserire una striscia di 3 mm x 5 mm x 20 mm in una siringa da 3 mL con un lucchetto Luer e un ago da 25 G. Lavare la striscia riempiendo la siringa con acqua deionizzata e capovolgendo la siringa più volte. Riempire la siringa con acqua deionizzata fino alla graduazione di 2 ml. Posizionare la siringa su uno shaker a 100 giri/min a temperatura ambiente. Ad ogni punto temporale (6 ore, 1 giorno, 2 giorni, 3 giorni, 1 settimana), raccogliere l’eluente in un flaconcino da 2 ml. In ogni momento, lavare la striscia riempiendo la siringa con acqua deionizzata e capovolgendo la siringa. Eliminare la soluzione e riempire la siringa con acqua deionizzata fino alla graduazione di 2 mL per continuare l’esperimento fino al punto temporale successivo. 4. Determinazione della concentrazione di vancomicina Rilevare spettrofotometricamente la concentrazione di vancomicina in acqua deionizzata ad una lunghezza d’onda di assorbimento di picco di 280 nm. Preparare standard di intervallo di concentrazione noti aggiungendo 100 μL di soluzione madre da 1 mg/mL alla piastra UV a 96 pozzetti e diluendo in serie utilizzando 100 μL di acqua deionizzata per ottenere sei livelli di concentrazioni note (da 1 mg/ml a 0,03125 mg/ml). Trasferire 100 μL degli eluenti in piastre a 96 pozzetti trasparenti UV e determinare la concentrazione a 280 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Generare una curva di calibrazione tracciando le concentrazioni note del farmaco rispetto ai corrispondenti valori di assorbanza. Calcolare la concentrazione sconosciuta del farmaco nell’eluente utilizzando l’equazione lineare generata dalla curva di calibrazione. Determinare la massa del farmaco moltiplicando la concentrazione per il volume dell’eluente (~ 1,7 ml). Calcolare il rilascio cumulativo del farmaco (mg) in un punto temporale sommando il rilascio del farmaco da tutti i punti temporali precedenti. Normalizzare il rilascio del farmaco nella superficie della striscia (3,5 cm 2) per determinare il rilascio cumulativo del farmaco per centimetro quadrato (cm2) dell’impianto. 5. Determinazione della concentrazione di gentamicina mediante il metodo di marcatura OPA 27 Preparare soluzioni standard GS per eseguire il test OPA.Trasferire 1 mL della soluzione di 80 μg/mL GS in una provetta da centrifuga. Aggiungere 500 μL di PBS ad altre cinque provette da centrifuga. Eseguire una diluizione seriale con questi tubi per ottenere concentrazioni di GS di 80 μg/mL, 40 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL e 2,5 μg/mL. Questi servono come soluzioni di calibrazione per il test. In una piastra trasparente a 96 pozzetti, aggiungere 80 μL di PBS al pozzetto A-1 e 80 μL delle soluzioni di calibrazione ai pozzetti da A-2 ad A-7 in concentrazione crescente. Questo serve come calibrazione interna per il test. Aggiungere 80 μL di ciascun campione ai pozzetti vuoti in triplice copia da analizzare nella stessa piastra a 96 pozzetti. Limitare il numero di campioni per piastra del pozzetto a <50 in modo che i tempi di aggiunta della soluzione OPA ai campioni siano approssimativamente gli stessi per tutti i campioni e per evitare l'evaporazione. Aggiungi il reagente OPA a tutti gli standard e le soluzioni campione.In una cappa aspirante, riempire un serbatoio di reagente da 25 mL con metanolo. Aggiungere 8 mL di metanolo e 1 mL della soluzione OPA preparata in un secondo serbatoio di reagente (paragrafo 1.8). Mescolare accuratamente la soluzione pipettando su e giù. Con una micropipetta multicanale da 100 μL, aggiungere 48 μL di metanolo dal primo serbatoio a tutti i pozzetti contenenti campioni nella piastra a 96 pozzetti. Oltre a questa fase, aggiungere 72 μL di soluzione OPA diluita dal secondo serbatoio a tutti i pozzetti contenenti campioni nella piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra del pozzo per 10 minuti a temperatura ambiente. Misurare l’intensità della fluorescenza (eccitazione di 340 nm, emissione di 455 nm) utilizzando un lettore di micropiastre immediatamente dopo l’incubazione di 10 minuti. Tracciare la curva di calibrazione utilizzando le letture di intensità per le soluzioni con concentrazioni note di GS. Aggiungi una linea lineare per determinare la soluzione migliore e genera l’equazione corrispondente. Calcolare la concentrazione del farmaco nell’eluente dalle curve di calibrazione generate tracciando le concentrazioni note del farmaco rispetto ai corrispondenti valori di assorbanza. Calcolare la massa del farmaco moltiplicando la concentrazione per il volume dell’eluente (~ 1,7 ml). Determinare il rilascio cumulativo del farmaco (mg) in un punto temporale sommando il rilascio del farmaco da tutti i punti temporali precedenti. Normalizzare il rilascio del farmaco nella superficie della striscia (3,5 cm 2) per determinare il rilascio cumulativo del farmaco per centimetro quadrato (cm2) dell’impianto. 6. Preparazione dei batteri NOTA: In questo studio sono stati utilizzati i seguenti ceppi di S. aureus : ceppo tipo 12600, ceppi clinici L1101 e L1163 (ottenuti dal Dr. Kerry LaPlante presso l’Università del Rhode Island). I profili di suscettibilità di questi ceppi sono presentati nella Tabella 1. Ceppi batterici Gentamicina MIC Vancomicina MIC ATCC 12600 ≤1 μg/mL (sensibile) ≤0,5 μg/mL (sensibile) L1101 (Ceppo clinico) ≥16 μg/mL (resistente) 8 μg/mL (intermedio) L1163 (Ceppo clinico) ≤1 μg/mL (sensibile) 8 μg/mL (intermedio) Tabella 1: Profili di suscettibilità agli antibiotici dei ceppi di controllo e clinici di S. aureus. ATTENZIONE: Tutte le fasi che coinvolgono la manipolazione di colture batteriche e sospensioni sono state eseguite in uno spazio di laboratorio BSL-2 all’interno di un armadio di biosicurezza di classe II, tipo A2. Scongelare gli stock batterici da -80 °C sulle piastre TSA per facilitare la crescita di S. aureus. Incubare staticamente le piastre durante la notte a 35 °C. Trasferire da due a tre colonie dalle colture di piastre di agar coltivate durante la notte in 1 ml di TSB sterile e incubare staticamente durante la notte a 35 °C. Trasferire 100 μL di batteri su una piastra trasparente a 96 pozzetti per misurare spettrofotometricamente la torbidità determinando l’assorbanza a 600 nm. Diluire i batteri 10.000 volte utilizzando MHB sterile prima di determinare il conteggio dei batteri vitali utilizzando il saggio luminescente. 7. Esecuzione del test di vitalità microbica in tempo reale Eseguire il test basato sulla luminescenza utilizzando piastre bianche opache a 96 pozzetti. Mescolare 100 μL di sospensioni batteriche diluite con 100 μL di reagente di analisi preparato nel paragrafo 1.5. Posizionare un coperchio coperto con un foglio di alluminio sulla piastra a 96 pozzetti preparata e incubare per 5 minuti con agitazione a 100 giri / min. Misurare immediatamente la luminescenza con un lettore di micropiastre utilizzando le seguenti impostazioni nel software Gen5 3.11.Fare clic su Nuovo per impostare un protocollo nella finestra Gestione attività . Selezionare Costar 96 bianco opaco nel menu a discesa per Tipo piastra. Fare clic su Leggi nel menu Seleziona passaggi > azioni . Fare clic su Luminescenza nella finestra Metodo di lettura. Mantenere le opzioni Endpoint/cinetica e Fibra di luminescenza selezionate rispettivamente in Tipo di lettura e Tipo ottica. Fare clic su OK. Mantenete le impostazioni nella finestra Passaggio lettura (guadagno = 135; tempo di integrazione = 1 secondo; altezza di lettura = 4,5 mm). Fare clic su OK. La finestra del layout del piatto sembra pronta per l’esecuzione. Selezionare la casella Usa coperchio nella finestra della piastra di carico e fare clic su OK. Posizionare la piastra a 96 pozzetti nella macchina per leggere i valori di luminescenza. 8. Generazione di una curva standard di luminescenza rispetto al conteggio vitale per ciascun ceppo batterico NOTA: Coltura ed enumerazione di tutti i ceppi di S. aureus secondo la metodologia descritta nella sezione 6. Preparare sospensioni batteriche diluite in serie per fungere da standard.Enumerare la sospensione batterica cresciuta durante la notte misurando spettrofotometricamente la torbidità. Centrifugare a 6.000 × g per 5 minuti per pellettare i batteri e risospendere il pellet in MHB sterile per regolare la concentrazione a 1 x 109 CFU / ml. Diluire 100 μL di sospensione pura utilizzando 900 μL di MHB ed eseguire una diluizione seriale 10 volte per raggiungere 1 x 101 CFU/mL. Eseguire il saggio di luminescenza sulle sospensioni batteriche preparate come descritto nel paragrafo 7. Utilizzare MHB sterile come controllo vuoto per l’esperimento e sottrarre il valore di luminescenza del bianco dai valori di luminescenza del campione di prova. Tracciate il log (CFU) rispetto al log (luminescenza) per generare una curva standard. Registrare l’equazione e il valore R2 . Determinare la CFU/mL corrispondente ai valori di luminescenza utilizzando l’equazione specifica del ceppo durante tutto lo studio. 9. Impostazione dello studio sull’attività antibatterica dipendente dal tempo Figura 1: Una rappresentazione schematica della configurazione sperimentale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Coltivare i batteri durante la notte in 1 ml di brodo TSB. Diluire la sospensione batterica cresciuta durante la notte a 105 CFU/mL in MHB sterile (sezione 6) e verificare la conta batterica vitale utilizzando le unità di luminescenza prima dell’inizio dell’esperimento (sezione 7). Introdurre le strisce UHMWPE vergini e UHMWPE caricate con farmaco (3 mm x 5 mm x 10 mm, metà delle dimensioni delle strisce preparate per gli studi di eluizione nella sezione 2) all’interno di una siringa da 3 ml. Aspirare MHB contenente 10 5 CFU/mL nella siringa attraverso l’ago collegato fino al segno di1,5 ml, che equivale a 1,35 mL di MHB (Figura 1: Fase 1). Posizionare la siringa su un incubatore agitatore (100 giri/min) a 37 °C fino ai punti temporali indicati di 6 ore, Giorno 1, Giorno 2, Giorno 3, Giorno 4, Giorno 5, Giorno 6 e Giorno 7 (Figura 1: Fase 2). In ogni punto temporale indicato, estrarre la configurazione della siringa ed eseguire un test di vitalità microbica in tempo reale secondo la sezione 7 su 100 μL di sospensione batterica (Figura 1: Fase 3-4). Determinare il conteggio dei batteri vitali per i punti temporali 6 h, Day 1, Day 2, Day 3 e Day 7. Determinare la CFU/mL dalle unità di luminescenza utilizzando la curva standard corrispondente. Verificare l’assenza di batteri vitali nei campioni che hanno mostrato valori di luminescenza inferiori al limite di rilevazione eseguendo il metodo della piastra di diffusione su piastre TSA e incubando a 35 °C durante la notte. Controlla la presenza di colonie il giorno successivo. Centrifugare la sospensione batterica rimanente a 10.000 × g per 10 minuti e aspirare delicatamente il mezzo esaurito. Per i tubi in cui i pellet non sono osservati visivamente a causa dell’attività antibatterica dei farmaci, lasciare 100 μL nel tubo per garantire che il pellet invisibile non venga disturbato (Figura 1: Fase 5). Risospendere i batteri pellettati nell’MHB fresco e prelevare la sospensione batterica nella stessa siringa attraverso l’ago collegato (Figura 1: Fase 6). 10. Quantificazione dei batteri aderenti sulla superficie UHMWPE Recuperare UHMWPE vergine e UHMWPE caricato con farmaci dalla configurazione della siringa dopo il completamento dello studio il giorno 7. Trasferire le superfici in tubi da 1,5 ml e risciacquare con 1 mL di PBS sterile (tre volte). Sonicare la superficie per 40 minuti in 1 mL di PBS sterile. Determinare la vitalità dei batteri aderenti eseguendo un saggio di luminescenza su 100 μL del campione sonicato, come descritto nella sezione 7.

Representative Results

Seguendo il protocollo, UHMWPE è stato modellato con gentamicina e vancomicina al 7% p/p ed eluito in acqua deionizzata. La concentrazione del farmaco nell’eluente dal materiale è stata determinata a 6 ore, 1 giorno, 2 giorni, 3 giorni e 1 settimana. Il rilascio del farmaco da vancomicina e UHMWPE caricato con gentamicina ha dimostrato un rilascio burst a 6 ore seguito da un tasso di rilascio costante con una concentrazione di rilascio superiore alla concentrazione inibitoria minima (MIC) fino a 7 giorni (Figura 2, Tabella 2). Prima dello studio antibatterico, è stata generata una curva standard per correlare le unità di luminescenza alla CFU/mL dei batteri per ciascun ceppo di S. aureus (ATCC 12600, L1101 e L1163). I corrispondenti valori di log (luminescenza) sono stati tracciati rispetto al log (CFU/mL) per generare una curva standard (Figura 3). I valori R2 calcolati erano 0,997, 0,996 e 0,994 per ATCC 12600, L1101 e L1163, rispettivamente, indicando un forte adattamento per l’intervallo di concentrazione. L’equazione derivata è stata successivamente utilizzata per calcolare la vitalità batterica in tutti gli esperimenti. ATCC 12600 e L1101 hanno dimostrato un limite di rilevamento entro un intervallo di 1 x 102-1 x 103 CFU/mL. D’altra parte, il limite di rilevazione per il ceppo L1163 è stato dimostrato essere 1 x 104 CFU/mL. Il test dell’attività antibatterica dipendente dal tempo è stato eseguito utilizzando 1 x 105 CFU / mL come inoculo iniziale per 12600, L1163 e L1101, che sono stati esposti al 7% di materiali a rilascio di farmaco p/p per un periodo di 1 settimana. Ad ogni punto temporale (6 ore, 1 giorno, 2 giorni, 3 giorni, 1 settimana), il mezzo è stato rinfrescato e la popolazione batterica è stata nuovamente sospesa. L’esposizione dei batteri al successivo rilascio di farmaci dal materiale è stata continuata fino al punto temporale successivo. UHMWPE con vancomicina 7% p/p e UHMWPE con gentamicina 7% p/p hanno dimostrato una riduzione >3log per ATCC 12600 suscettibile a partire da 6 ore e l’eradicazione completa (nessuna crescita della colonia) è stata osservata alla fine di 3 giorni (Figura 4A). Per il ceppo L1163 sensibile alla gentamicina e alla vancomicina, entrambi i materiali a rilascio di farmaco hanno causato una riduzione di >3log a 6 ore e l’eradicazione completa (nessuna crescita della colonia) è stata osservata il giorno 1 dell’esperimento (Figura 4B). Per il ceppo L1101 resistente alla gentamicina e alla vancomicina, l’eluizione della gentamicina da UHMWPE non ha influenzato la vitalità batterica di L1101 (Figura 4C). I batteri proliferarono e la popolazione si stabilizzò entro 6 ore in presenza di UHMWPE vergine senza eluizione antibiotica. In presenza di UHMWPE a rilascio di gentamicina, la popolazione ha raggiunto un livello di crescita simile il giorno 2. Al contrario, l’eluizione della vancomicina da UHMWPE ha ridotto significativamente la vitalità batterica (>3log) a 6 ore e la completa perdita di vitalità (nessuna crescita della colonia) è stata dimostrata entro il giorno 4. Le superfici dell’UHMWPE a rilascio di gentamicina e vancomicina non hanno mostrato batteri aderenti vitali quando esposti a ceppi sensibili e resistenti agli intermedi dopo il giorno 7 o la completa eradicazione, a seconda di quale evento si è verificato per primo. Alcuni batteri vitali (1 x 105 CFU/ml) erano presenti su UHMWPE a rilascio di gentamicina esposto a L1101 resistente alla gentamicina. Allo stesso modo, circa 1 x 10 5 CFU / mL di batteri aderenti vitali sono stati recuperati dal PE vergine di controllo (Figura 5). Figura 2: Rilascio medio di antibiotico dipendente dal tempo dal 7% p/p di striscia UHMWPE caricata con antibiotico. Il rilascio medio di antibiotico tra i punti temporali da una striscia di gentamicina e UHMWPE caricata con vancomicina al 7% (3 mm 3 x 5 mm 3 x 10 mm3 ~ 2 cm 2 superficie). Il MIC contro il ceppo di controllo ATCC 12600 è mostrato come una linea tratteggiata per gentamicina e una linea continua per vancomicina. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media da sei repliche (n = 6). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Curva standard di saggio luminescente in tempo reale per tutti i ceppi di S. aureus. Il log (luminescenza) è stato tracciato rispetto al log (CFU/mL) per generare curve standard per il controllo, (A) ATCC 12600 e ceppi clinici, (B) L1101 e (C) L1163. Le equazioni che descrivono la linea di migliore adattamento e i corrispondenti valori R2 sono indicati sui grafici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4: Vitalità batterica determinata utilizzando un saggio luminescente per il 7% p/p di UHMWPE a rilascio di gentamicina e il 7% p/p di UHMWPE a rilascio di vancomicina. Viene mostrata l’attività antibatterica tempo-dipendente di gentamicina e vancomicina eluita da UHMWPE contro ceppi di controllo, (A) ATCC 12600, e ceppi clinici, (B) L1163 e (C) L1101. Virgin 1020 PE è servito come controllo per l’esperimento. La linea gialla nei grafici indica il limite di rilevamento per il rispettivo ceppo di S. aureus. I dati sono indicati come media ± deviazione standard (n = 3). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 5: Vitalità dei batteri aderenti determinata utilizzando il saggio luminescente Glo test per il 7% p/p di UHMWPE a rilascio di gentamicina e il 7% p/p di UHMWPE a rilascio di vancomicina contro tutti i ceppi di S. aureus. Il grafico a barre indica batteri aderenti (CFU) recuperati per centimetro quadrato (cm2) di UHMWPE caricato con gentamicina al 7% e UHMWPE caricato con vancomicina al 7% alla fine del periodo di studio per tutti i ceppi testati. Le barre mostrano i dati come media ± deviazione standard (n = 3). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Punti temporali Vancomycin Gentamicina Concentrazione di picco (μg/ml) Concentrazione di picco (μg/ml) 0 – 6 h 336 ± 72 263 ± 24 6 h -1 giorno 57 ± 18 16 ± 2 1 giorno – 2 giorni 60 ± 18 7 ± 1 2 giorni – 3 giorni 23 ± 6 5 ± 0,4 3 giorni – 7 giorni 49 ± 20 15 ± 1 Tabella 2: Concentrazione di picco del farmaco (μg/ml) in diversi punti temporali. I dati sono mostrati come media ± deviazione standard (n = 6). Figura supplementare 2: Decadimento del segnale di luminescenza per un periodo di 10 minuti dall’aggiunta del reagente di analisi al campione. Una differenza del ±5% nel segnale viene mostrata come una linea tratteggiata Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

La somministrazione localizzata e sostenuta di antibiotici è uno strumento necessario nella gestione delle infezioni articolari periprotesiche. Gli antibiotici sistemici sono la strategia primaria per sradicare l’infezione batterica e l’eluizione locale viene utilizzata come strumento complementare per prevenire la crescita e la colonizzazione di eventuali batteri rimasti dopo la rimozione dell’impianto e lo sbrigliamento del tessuto. L’obiettivo per l’area efficace sotto la curva (concentrazione su un periodo) per gli antibiotici con somministrazione locale non è ben compreso. L’eluizione di antibiotici da tali dispositivi può essere quantificata longitudinalmente in vitro; Tuttavia, per determinare il valore traslazionale di questi profili di concentrazione, è necessario un solido metodo in vitro per valutare l’attività antibatterica. In questo articolo, viene descritto uno di questi metodi in tempo reale per determinare l’attività antibatterica dell’UHMWPE a rilascio di farmaco da utilizzare come dispositivo di consegna sostenuta nelle sostituzioni articolari.

Il monitoraggio in tempo reale della vitalità batterica è un parametro cruciale di interesse e i metodi microbiologici convenzionali mancano del quadro per accogliere questo aspetto specifico dello studio. Il saggio di vitalità microbica utilizzato in questo studio è stato sviluppato per la quantificazione di batteri vitali misurando la luminescenza corrispondente all’adenosina trifosfato (ATP). Per studiare direttamente l’attività dipendente dal tempo degli antibiotici eluiti dai materiali implantari, sono stati incubati con essi tre diversi ceppi con distinti profili di suscettibilità agli antibiotici. Il razionale per l’utilizzo di ceppi clinici e di laboratorio con diverse resistenze alla gentamicina e alla vancomicina era quello di comprendere la gamma di attività per una data formulazione implantare. Inoltre, l’attività antibatterica e l’efficacia contro queste popolazioni distinte dipendono dai tempi di somministrazione. Il metodo si concentra sulla fattibilità della profilassi contro questi ceppi basata sul >70% delle infezioni articolari periprotesiche causate dalla contaminazione della ferita al momento dell’intervento chirurgico24.

Come inoculo iniziale per sviluppare questo metodo, è stato utilizzato 1 x 105 CFU/mL. Diverse concentrazioni contaminanti sono state utilizzate per i modelli animali, sebbene non si sappia molto sul carico di infezione clinicamente rilevante per la PJI. I modelli di infezione animale per PJI sono stati stabiliti di routine utilizzando 1 x 105 CFU, e un intervallo simile è ampiamente utilizzato nei metodi standardizzati (CLSI) per determinare l’attività antibatterica25,26,27. L’utilizzo di 1 x 105 CFU/mL come concentrazione contaminante iniziale ci ha permesso di valutare contemporaneamente sia i parametri di crescita che quelli di eradicazione.

Convenzionalmente, i valori di MIC sono determinati per una concentrazione costante di antibiotici per un numero specifico di batteri e non riescono a dimostrare il tasso di azione antibatterica. A causa di questo aspetto, i valori di MIC non forniscono una differenziazione quantitativa per descrivere il profilo di attività antimicrobica28. I dati del metodo attuale sottolineano il vantaggio di valutare la cinetica di uccisione degli antibiotici dipendente dal ceppo piuttosto che utilizzare il MIC per prendere decisioni di dosaggio. Utilizzando questo metodo, è stato possibile differenziare sia l’estensione che la velocità con cui i materiali implantari hanno influenzato i diversi ceppi. La gentamicina eluita dalle strisce di materiale implantare è risultata efficace nell’eradicazione di L1163 in 1 giorno e nell’eradicazione di ATCC 12600 in 2-3 giorni, ma è risultata inefficace nell’eradicazione di L1101 (Figura 4). Oltre alla prevista mancanza di attività dell’eluizione della gentamicina contro L1101 (MIC >32 μg/mL) a causa della sua intrinseca resistenza alla gentamicina (Figura 4C), la persistenza di sottopopolazioni è stata osservata quando esposte alla vancomicina, per la quale L1101 mostra una resistenza intermedia. Al contrario, L1163 è stato definitivamente debellato in presenza di UHMWPE a rilascio di vancomicina nonostante mostrasse una resistenza intermedia alla vancomicina simile a quella di L1101 (un MIC di 8 μg/mL è stato osservato per entrambi i ceppi).

Le osservazioni secondo cui il tasso di attività della gentamicina contro 12600 e L1163, che sono sensibili alla gentamicina con valori MIC simili (un MIC di 1μg/mL è stato osservato per entrambi i ceppi), era diverso, così come che l’entità dell’attività della vancomicina contro L1101 e L1163 resistenti agli intermedi era diversa (Figura 4A,B), ha sostenuto l’ipotesi che questo metodo in tempo reale in presenza del materiale eluinte potesse differenziare le differenze longitudinali nell’attività.

Oltre al valore traslazionale dei risultati nell’interpretare l’efficacia di una data concentrazione eluita contro questi batteri, ci sono diversi vantaggi metodologici sperimentali. (1) La concentrazione batterica viene determinata istantaneamente in un dato momento, contrariamente ai metodi convenzionali in cui i batteri vengono incubati in brodo o su agar per 18-24 ore per determinare la vitalità. Questo periodo di crescita può fornire ulteriore tempo ai batteri per riprendersi dallo stress antibiotico, introducendo un’ulteriore possibile fonte di errore / variabilità. (2) Il mezzo viene continuamente sostituito mantenendo i batteri, che assomigliano più da vicino alle condizioni in vivo che alle condizioni statiche. (3) Questo test include intrinsecamente la cinetica di rilascio del farmaco dall’impianto, che consente una migliore previsione delle prestazioni. (4) Il metodo è stato sviluppato utilizzando materiali di consumo comunemente disponibili senza la necessità di macchinari specifici o costosi.

Sono necessari solidi metodi di test in vitro per valutare le domande di somministrazione di farmaci prima di procedere a studi in vivo sugli animali e sperimentazioni cliniche. Questo test può essere modificato e adattato per adattarsi a vari approcci e piattaforme di somministrazione di farmaci come particelle, gel, film e altri materiali a rilascio di farmaco per determinare l’efficienza dell’eradicazione batterica in una configurazione simulata in vitro. Le modifiche possono essere eseguite per la configurazione del campione passando ad un ambiente di mezzo in vitro adatto, che ha dimostrato di influenzare l’attività di diversi antibiotici29,30.

Il metodo facilita anche la determinazione dei batteri aderenti vitali, che è promettente, poiché i metodi convenzionali per determinare la concentrazione minima di eradicazione del biofilm richiedono molto tempo e forniscono risultati incoerenti. Tuttavia, il metodo deve essere rigorosamente testato su biofilm per sviluppare una metodologia affidabile e robusta per determinarne la sensibilità. Il metodo luminescente basato su ATP potrebbe essere abbastanza sensibile da rilevare forme vitali di batteri nei biofilm, compresi i persistenti, che possono o meno essere rilevati su una piastra di agar come colonie visibili. Nel loro insieme, questa piattaforma versatile ha il potenziale per incorporare parametri rilevanti per registrare osservazioni in tempo reale sull’attività antibatterica e anti-biofilm dei farmaci di interesse.

L’efficacia di questo metodo è regolata dai seguenti aspetti:

Caratteristiche di eluizione predeterminate e dimensione del campione
Il profilo di eluizione del materiale a rilascio di antibiotico può essere identificato in un esperimento separato prima di questa misurazione dell’attività antibatterica in modo tale da poter determinare la quantità di materiale necessaria per condurre attivamente l’esperimento entro un tempo stabilito.

Determinazione del contenitore e del volume
È importante elaborare una configurazione in cui il volume del supporto dell’esperimento possa ospitare l’intera superficie dello stesso materiale e garantire un volume sufficiente per il rilascio senza ostacoli del farmaco dalla superficie caricata con il farmaco. La configurazione utilizzata si basava su precedenti sperimentazioni, garantendo condizioni di “affondamento perfette” per questi farmaci idrofili in modo tale che la loro diffusione non fosse ostacolata da limitazioni di solubilità.

Caratteristiche dei substrati di crescita
La selezione dei terreni di crescita deve essere studiata per garantire la stabilità e le prestazioni ottimali dei farmaci selezionati29. Il brodo di Mueller Hinton a regolazione cationica (CAMHB), ampiamente utilizzato nel metodo di diluizione del brodo, è stato utilizzato per determinare il MIC di antibiotici noti. Il mezzo consente un’attività ottimale del farmaco senza l’interferenza dell’accumulo di metaboliti secondari tossici31. Il reagente di analisi è stato testato e riportato stabile in diversi tipi di mezzi, compresi quelli con componenti sierici23,28. Sebbene i valori relativi delle unità di luminescenza possano variare tra i diversi mezzi, è stato dimostrato che i componenti del mezzo non interferiscono con il saggio32,33. Il volume sperimentale è stato ulteriormente ottimizzato a 1,5 ml, che è vicino al volume del liquido sinoviale presente in uno spazio articolare del ginocchio adulto34.

Stabilità della temperatura per il test
La manipolazione e l’aggiunta del reagente luminescente al test devono essere eseguite in modo coerente in tutti gli esperimenti. Le variazioni di temperatura alterano la sensibilità del test, quindi è importante incubare il reagente a temperatura ambiente per 2 ore prima di aggiungerlo ai batteri23.

Tempo di incubazione del reagente
La luminescenza del reagente decade con il tempo. Il segnale luminescente ha un’emivita di oltre 30 minuti, che dipende in gran parte dal mezzo e dal tipo di batterio utilizzato nell’esperimento23. Inoltre, eventuali differenze nel tempo di incubazione (cioè il tempo tra l’aggiunta del reagente ai batteri e la lettura della luminescenza) comporteranno letture incoerenti per la stessa concentrazione di batteri. Una differenza del 5% è stata osservata nel segnale luminescente se assunto entro 1 minuto dopo il tempo di incubazione di 5 minuti secondo le istruzioni del produttore (Figura supplementare 2). Tenendo conto di questi dati, le letture della luminescenza sono state registrate entro 1 minuto durante lo studio per garantire che la perdita di segnale non fosse superiore al 5%. Inoltre, è importante limitare il numero di campioni per piastra per ridurre l’errore introdotto a causa del decadimento della luminescenza dal primo all’ultimo pozzo.

Mantenimento della popolazione batterica durante tutto lo studio
Il metodo ha tentato di modellare la clearance del farmaco e il turnover del volume sinoviale separando continuamente il mezzo esaurito dalla popolazione batterica in ogni punto temporale utilizzando la centrifugazione ad alta velocità a 10.000 x g per 10 minutie 35. Questo passaggio critico garantisce la sedimentazione di tutte le cellule batteriche vitali e non vitali. Inoltre, i batteri sedimentati vengono uniformemente ricostituiti in MHB fresco e trasferiti alla configurazione della siringa, facilitando il completo trascinamento della popolazione microbica interessata alla configurazione sperimentale. La riproducibilità e l’affidabilità di questo metodo dipendono fortemente dalla simulazione dell’esposizione prolungata di antibiotici alla popolazione microbica derivata dall’inoculo iniziale.

Una limitazione chiave di questo metodo è che si tratta di un test semi-statico che non simula accuratamente l’emivita del farmaco e il continuo turnover sinoviale. Tuttavia, la sostituzione continua del mezzo compensa parzialmente questa limitazione. La sensibilità del test di vitalità microbica era dipendente dal ceppo, compresa tra 1 x 102-1 x 104 CFU / ml, il che limita la capacità di rilevamento. Inoltre, è necessario tracciare una curva standard per ciascun organismo poiché il tipo di ceppo contribuisce alla sensibilità e alle prestazioni del reagente luminescente. Sia la dinamica di crescita dei batteri che l’attività del composto farmaceutico utilizzato possono essere influenzate dai componenti del mezzo, che dovrebbero essere ulteriormente studiati.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato parzialmente dal National Institutes of Health Grant No. AR077023 (R01) e dall’Harris Orthopaedic Laboratory. Gli autori ringraziano la dottoressa Kerry Laplante e il suo team presso l’Università del Rhode Island per aver fornito i ceppi clinici L1101 e L1163.

Materials

 96 well plates – polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs Corning, NY, USA CLS3922-100EA
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich, Germany
ATCC 12600 American Type culture Collection, VA, USA
BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay Promega Corporation, USA G8231
BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) Becton-Dickinson, USA BD 211825 purchased from Fisher Scientific, USA
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL BD, USA 309657
BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G BD, USA 305122
BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) Becton-Dickinson, USA B12322 purchased from Fisher Scientific, USA
BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) Becton-Dickinson, USA DF0369-17-6 purchased from Fisher Scientific, USA
Boric Acid  Fisher Chemical, NJ, USA
Branson 1800 ultrasonic bath Emerson, MO, USA
Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid Fisher Scientific, USA 08-757-100D
Gentamicin Sulfate  Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China
Greiner UV-Star 96 well plates Sigma Aldrich, Germany M3812-40EA
Hydraulic press Carver, Inc. Wabash, IN, USA
L1101  Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island
L1163  Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island
LSE benchtop shaking incubator Corning, NY, USA
Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical Fisher Scientific, NJ, USA A454-1
Napco CO2 6000 Thermo Scientific, MA, USA
PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents Fisher Scientific, USA BP24384
Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) Sigma Aldrich, Germany P1378-5g
Plate reader (Synergy H1 Biotek, VT, USA
press Carver, Inc. Wabash, IN, USA
shaker Innova 2100 New Brunswick Scientific, NJ, USA
ShopBot D2418 ShopBot Tools, Inc., NC, USA
Sodium Hydroxide  Sigma Aldrich, Germany
Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water Fisher Scientific, USA 23-751628
UHMWPE GUR1020, Celanese, TX, USA
Vancomycin Hydrochloride  Fagron, The Netherlands 804148
WAB Turbula WAB Turbula, Switzerland
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References

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Sekar, A., Lekkala, S., Oral, E. A Novel Method to Determine the Longitudinal Antibacterial Activity of Drug-Eluting Materials. J. Vis. Exp. (193), e64641, doi:10.3791/64641 (2023).
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