Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na corrente sanguínea, desempenhando um papel essencial durante a depuração de agentes patogênicos por diversos mecanismos, incluindo a liberação de grandes estruturas cromatina compostas de DNA e várias proteínas antibacterianas nucleares, citoplasmáticas e granulares ^1,2. O antecedente direto descrevendo esse papel antimicrobiano dos neutrófilos foi feito por Takei et ^al.3 em 1996. Esses autores relataram uma nova forma de morte diferente da apoptose e necroptose em neutrófilos, mostraram alterações morfológicas exibindo ruptura nuclear, seguidas de derramamento do nucleoplasma para o citoplasma, e um aumento na permeabilidade da membrana a partir de 3 h de incubação com acetato de miristato de forbol (PMA)^2,3. No entanto, foi somente em 2004 que o termo “armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs)” foi utilizado⁴.

A formação de NET tem sido observada em diversas condições, como infecções bacterianas, fúngicas⁵, virais⁶ e parasitárias, para neutralizar, matar e prevenir a disseminação microbiana⁷. Outros estudos mostram que também pode ocorrer em condições não patogênicas por estímulos estéreis, como citocinas, ácido úrico monossódico ou cristais de colesterol, autoanticorpos, imunocomplexos e plaquetas ativadas⁷. Lipopolissacarídeo (LPS), interleucina-8 (IL-8) e PMA estavam entre os primeiros estímulos in vitro descritos como indutores de NET, e o envolvimento in vivo da TNE em processos patogênicos foi demonstrado em dois modelos de inflamação aguda: disenteria experimental e apendicite humana espontânea⁴. O DNA é um componente essencial da NET. Sua estrutura e composição adequadas são necessárias para o sequestro e morte de microrganismos, fornecendo uma alta concentração local de moléculas antimicrobianas em direção aos micróbios capturados, como demonstrado por um breve tratamento com desoxirribonuclease (DNase) que desintegra TNEs e suas propriedades microbicidas4. Além do DNA, os TNEs compreendem proteínas aderentes, como histonas, elastase de neutrófilos (NE), catepsina G (GC), proteinase 3, lactoferrina, gelatinase, mieloperoxidase (MPO) e peptídeos antimicrobianos (AMPs), como o peptídeo pró-inflamatório catiônico catelicidina LL-37, entre outros ^8,9. Tais agregados podem formar roscas maiores com diâmetros de até 50 nm. Esses fatores podem perturbar os fatores de virulência microbiana ou a integridade da membrana celular do patógeno; além disso, os AMPs podem estabilizar o DNA derivado da TNE contra a degradação por nucleases bacterianas¹⁰.

Os mecanismos específicos que regulam a formação da NET ainda não foram completamente esclarecidos. A via mais bem caracterizada que leva à liberação de NET é através da sinalização ERK, que leva à ativação da NADPH oxidase e à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), bem como ao aumento do cálcio intracelular que desencadeia a ativação da via MPO. Este, por sua vez, transforma o peróxido de hidrogênio em ácido hipocloroso, ativando o NE por oxidação^11,12. O NE é responsável por degradar os filamentos de actina do citoesqueleto para bloquear a fagocitose e translocá-los para o núcleo para processamento por clivagem proteolítica e desaminação por PAD4 que impulsionam a dessensibilização das fibras cromatinas, que se associam a proteínas granulográficas e citoplasmáticas, e são então liberadas extracelularmente⁷. Essas proteases incluem aquelas liberadas do complexo azurossomo dos grânulos azurófilos e outras proteases, como a catepsina G¹³.

Dependendo das alterações morfológicas nos neutrófilos, os TNEs são classificados em dois tipos: formação de TNE suicida ou lítica levando à morte celular⁴ e formação de TNE vital ou não lítica produzida por células viáveis mediadas por uma liberação vesicular de DNA nuclear ou mitocondrial, com remanescente de citoplasto anucleado com capacidade fagocítica^14,15. Geralmente, TNEs compostos de DNA mitocondrial apresentam morfologia de fibra alongada¹⁴, enquanto aqueles estruturados de DNA nuclear têm aparência de nuvem³. No entanto, não se sabe como o neutrófilo escolhe sua origem no DNA. Ao contrário de estudos anteriores que descreveram as vias canônicas dos TNEs como exigindo várias horas, a via vital é rapidamente ativada em apenas 5-60 min¹⁵.

Apesar desses avanços, a composição da TNE varia de acordo com o estímulo; por exemplo, diferentes cepas mucoides e não mucoides de P. aeruginosa induzem a formação de TNEs contendo 33 proteínas comuns e até 50 proteínas variáveis⁷. Assim, faz-se necessário homogeneizar técnicas que permitam a geração de conclusões objetivas em grupos de pesquisa. Este trabalho descreve um protocolo com várias técnicas que permitem comparar e avaliar a composição, estrutura e morfologia de TNEs induzidos com diferentes microrganismos: Staphylococcus aureus (bactéria gram-positiva), Pseudomonas aeruginosa (bactéria gram-negativa) e Candida albicans (fungo), bem como estímulos químicos (PMA, HOCl) em neutrófilos humanos de indivíduos saudáveis. Os resultados representativos demonstram a heterogeneidade dos TNEs dependendo de seu estímulo indutor em condições in vitro comparáveis, caracterizadas por coloração DNA-DAPI, imunocoloração para LL37 e quantificação da atividade enzimática (NE, GC e MPO).