التحليل المورفولوجي والتركيبي لمصائد العدلات خارج الخلية التي تسببها المحفزات الميكروبية والكيميائية
Summary
يظهر هنا بروتوكول لتحريض وتحليل مصائد العدلات خارج الخلية في المختبر (NETs). أسفر القياس الكمي للحمض النووي والكاثيليسيدين (LL37) ونشاط الإنزيم عن بيانات تظهر التباين في تكوين ومورفولوجيا الشبكات التي تسببها المحفزات الميكروبية والكيميائية في ظل ظروف مضبوطة مماثلة.
Abstract
تعمل العدلات كخط أول للدفاع الخلوي في الاستجابة المناعية الفطرية من خلال استخدام آليات متنوعة ، مثل تكوين مصائد العدلات خارج الخلية (NETs). تحلل هذه الدراسة التغيرات المورفولوجية والتركيبية في الشبكات التي تسببها المحفزات الميكروبية والكيميائية باستخدام منهجيات موحدة في المختبر لتحريض NET وتوصيف الخلايا البشرية. تسمح الإجراءات الموضحة هنا بتحليل مورفولوجيا NET (lytic أو non-lytic) وتكوينها (هياكل بروتين الحمض النووي والنشاط الأنزيمي) ، وتأثير العوامل القابلة للذوبان أو الاتصال الخلوي على هذه الخصائص. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل التقنيات الموضحة هنا لتقييم تأثير العوامل الخارجية القابلة للذوبان أو الاتصال الخلوي على تكوين NET.
تشمل التقنيات المطبقة تنقية الخلايا متعددة الأشكال النووية من الدم المحيطي البشري باستخدام تدرج مزدوج الكثافة (1.079-1.098 جم / مل) ، مما يضمن النقاء الأمثل والجدوى (≥ 95٪) كما يتضح من تلطيخ رايت ، واستبعاد تريبان الأزرق ، وقياس التدفق الخلوي ، بما في ذلك تحليل FSC مقابل SSC وتلطيخ 7AAD. يتم تحفيز تكوين NET مع الميكروبات (Pseudomonas aeruginosa ، المكورات العنقودية الذهبية ، والمبيضات البيض) والمحفزات الكيميائية (أسيتات phorbol myristate ، HOCl) ، وتتميز NETs بتلطيخ DNA-DAPI ، والتلوين المناعي لكاثيليسيدين الببتيد المضاد للميكروبات (LL37) ، وقياس النشاط الأنزيمي (إيلاستاز العدلات ، والكاثيبسين G ، والميلوبيروكسيداز). يتم الحصول على الصور من خلال الفحص المجهري الفلوري وتحليلها باستخدام ImageJ.
Introduction
العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في مجرى الدم ، وتلعب دورا أساسيا أثناء إزالة العوامل المسببة للأمراض من خلال عدة آليات ، بما في ذلك إطلاق هياكل الكروماتين الكبيرة المكونة من الحمض النووي والعديد من البروتينات المضادة للبكتيريا النووية والسيتوبلازمية والحبيبية 1,2. تم إجراء السابقة المباشرة التي تصف هذا الدور المضاد للميكروبات للعدلات بواسطة Takei et al.3 في عام 1996. أبلغ هؤلاء المؤلفون عن شكل جديد من الموت يختلف عن موت الخلايا المبرمج والتنخر في العدلات ، وأظهروا تغيرات مورفولوجية تظهر تمزقا نوويا ، يليه انسكاب من بلازما النواة إلى السيتوبلازم ، وزيادة في نفاذية الغشاء من 3 ساعات من الحضانة مع أسيتات ميريستات فوربول (PMA) 2,3. ومع ذلك ، لم يتم استخدام مصطلح “مصائد العدلات خارج الخلية (NETs)”حتى عام 2004 4.
لوحظ تكوين NET في ظروف مختلفة ، مثل الالتهابات البكتيرية والفطرية5 والفيروسية6 والطفيلية ، لتحييد وقتل ومنع انتشار الميكروبات7. تظهر دراسات أخرى أنه يمكن أن يحدث أيضا في الحالات غير المسببة للأمراض عن طريق المنبهات المعقمة ، مثل السيتوكينات وحمض اليوريك أحادي الصوديوم أو بلورات الكوليسترول والأجسام المضادة الذاتية والمجمعات المناعية والصفائح الدموية المنشطة7. كانت عديد السكاريد الشحمي (LPS) وإنترلوكين -8 (IL-8) و PMA من بين المحفزات الأولى في المختبر الموصوفة بأنها محرضات NET ، وتم إثبات مشاركة NET في الجسم الحي في العمليات المسببة للأمراض في نموذجين من الالتهاب الحاد: الزحار التجريبي والتهاب الزائدة الدودية البشري التلقائي4. الحمض النووي هو مكون NET أساسي. هيكلها وتكوينها المناسبان ضروريان لعزل الكائنات الحية الدقيقة وقتلها عن طريق توصيل تركيز محلي عال من جزيئات مضادات الميكروبات نحو الميكروبات التي تم اصطيادها ، كما يتضح من علاج ديوكسي ريبونوكلياز (DNase) الموجز الذي يفكك الشبكات وخصائصها القاتلةللميكروبات 4. إلى جانب الحمض النووي ، تشتمل الشبكات على بروتينات متصلة مثل الهستونات ، وإيلاستاز العدلات (NE) ، والكاثيبسين G (CG) ، والبروتيناز 3 ، واللاكتوفيرين ، والجيلاتيناز ، والمايلوبيروكسيديز (MPO) ، والببتيدات المضادة للميكروبات (AMPs) مثل الببتيد الكاتيوني المؤيد للالتهابات cathelicidin LL-37 من بين أمور أخرى 8,9. قد تشكل هذه المجاميع خيوطا أكبر بأقطار تصل إلى 50 نانومتر. هذه العوامل يمكن أن تعطل عوامل الفوعة الميكروبية أو سلامة غشاء الخلية الممرضة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ل AMPs تثبيت الحمض النووي المشتق من NET ضد التدهور بواسطة النيوكليازات البكتيرية10.
لم يتم بعد توضيح الآليات المحددة التي تنظم تكوين NET بشكل كامل. أفضل مسار مميز يؤدي إلى إطلاق NET هو من خلال إشارات ERK ، مما يؤدي إلى تنشيط NADPH oxidase وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، بالإضافة إلى زيادة الكالسيوم داخل الخلايا الذي يؤدي إلى تنشيط مسار MPO. وهذا بدوره يحول بيروكسيد الهيدروجين إلى حمض هيبوكلوروس ، وينشط NE عن طريق الأكسدة11,12. NE مسؤول عن تحلل خيوط الأكتين في الهيكل الخلوي لمنع البلعمة ونقلها إلى النواة للمعالجة عن طريق الانقسام المحلل للبروتين وإزالة الأمين بواسطة PAD4 التي تدفع إزالة حساسية ألياف الكروماتين ، والتي ترتبط بالبروتينات الحبيبية والسيتوبلازمية ، ثم يتم إطلاقها خارج الخلية7. تشمل هذه البروتياز تلك المنبعثة من مجمع الأزوروسوم لحبيبات الأزوروفيل والبروتياز الأخرى مثل cathepsin G13.
اعتمادا على التغيرات المورفولوجية في العدلات ، يتم تصنيف الشبكات إلى نوعين: تكوين NET انتحاري أو lytic يؤدي إلى موت الخلية4 ، وتشكيل NET حيوي أو غير lytic ينتج عن خلايا قابلة للحياة بوساطة إطلاق حويصلي من الحمض النووي أو الميتوكوندريا ، مع بقايا من cytoplast anucleated مع القدرة البلعمية14,15. بشكل عام ، تقدم الشبكات المكونة من الحمض النووي للميتوكوندريا مورفولوجيا ممدودة من الألياف14 ، في حين أن تلك المكونة من الحمض النووي النووي لها مظهر يشبه السحابة3. ومع ذلك ، من غير المعروف كيف يختار العدلة أصل الحمض النووي. على عكس الدراسات السابقة التي وصفت المسارات الكنسية للشبكات بأنها تتطلب عدة ساعات ، يتم تنشيط المسار الحيوي بسرعة في 5-60 دقيقة15 دقيقة فقط.
على الرغم من هذه التطورات ، يختلف التكوين الصافي اعتمادا على الحافز. على سبيل المثال ، تحفز سلالات مخاطية وغير مخاطية مختلفة من P. aeruginosa تكوين شبكات تحتوي على 33 بروتينا شائعا وما يصل إلى 50 بروتينا متغيرا7. وبالتالي ، من الضروري تجانس التقنيات التي تسمح بتوليد استنتاجات موضوعية في مجموعات البحث. تصف هذه الورقة بروتوكولا بتقنيات مختلفة تسمح بمقارنة وتقييم تكوين وهيكل ومورفولوجيا الشبكات المستحثة مع الكائنات الحية الدقيقة المختلفة: المكورات العنقودية الذهبية (بكتيريا إيجابية الجرام) ، Pseudomonas aeruginosa (بكتيريا سالبة الجرام) ، والمبيضات البيض (الفطريات) ، وكذلك المحفزات الكيميائية (PMA ، HOCl) في العدلات البشرية من الأفراد الأصحاء. توضح النتائج التمثيلية عدم تجانس الشبكات اعتمادا على محفزاتها المحفزة في ظل ظروف مماثلة في المختبر ، والتي تتميز بتلطيخ DNA-DAPI ، والتلطيخ المناعي ل LL37 ، والقياس الكمي للنشاط الأنزيمي (NE و CG و MPO).
Protocol
Representative Results
Discussion
يجب الحصول على مجموعة عالية النقاء من العدلات القابلة للحياة للحث على إطلاق الشبكات لأن هذه الخلايا لها عمر محدود خارج الجسم الحي يبلغ 8 ساعات في المتوسط ، وهي فترة يجب خلالها إجراء جميع التجارب. تحقيقا لهذه الغاية ، فإن المنهجية المثالية هي التدرج مزدوج الكثافة لتحسين وقت التنقية عن …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة العلوم الأساسية (# 285480) من CONACyT وقسم أبحاث المناعة السريرية في كلية العلوم الكيميائية الحيوية ، جامعة أوتونوما “بينيتو خواريز” دي أواكساكا. A.A.A، S.A.S.L، و W.J.R.R. لديها زمالات الدكتوراه من أرقام CONACyT # 799779 و # 660793 و # 827788 ، على التوالي.
Materials
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL – Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory – CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
References
- De Buhr, N., Maren, K. B. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. eLife. 6, 24437 (2017).
- Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection. Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Delgado-Rizo, V., et al. Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview. Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).
- Petretto, A., et al. Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis. PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).
- Neumann, A., et al. Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases. Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Sabbatini, M., Magnelli, V., Renò, F. NETosis in wound healing: When enough Is enough. Cells. 10 (3), 494 (2021).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).
- Clark, S. R., et al. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Sosa, S. A., et al. Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus. Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).
- White, P. C., et al. Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).
