Морфологический и композиционный анализ внеклеточных ловушек нейтрофилов, индуцированных микробными и химическими раздражителями

Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитами в кровотоке, играя существенную роль во время клиренса патогенных агентов несколькими механизмами, включая высвобождение крупных структур хроматина, состоящих из ДНК и нескольких ядерных, цитоплазматических и зернистых антибактериальных белков ^1,2. Прямой предшественник, описывающий эту антимикробную роль нейтрофилов, был сделан Takei et ^al.3 в 1996 году. Эти авторы сообщили о новой форме смерти, отличной от апоптоза и некроптоза у нейтрофилов, показали морфологические изменения, демонстрирующие ядерный разрыв с последующим выплескиванием из нуклеоплазмы в цитоплазму и увеличением проницаемости мембраны от 3 ч инкубации с форбол миристатом ацетатом (PMA)^2,3. Однако только в 2004 году был использован термин «внеклеточные ловушки нейтрофилов (NETs)»⁴.

Образование NET наблюдалось в различных условиях, таких как бактериальные, грибковые⁵, вирусные⁶ и паразитарные инфекции, для нейтрализации, уничтожения и предотвращения распространения микробов⁷. Другие исследования показывают, что он также может возникать в непатогенных условиях стерильными стимулами, такими как цитокины, мононатриевая мочевая кислота или кристаллы холестерина, аутоантитела, иммунные комплексы и активированные тромбоциты⁷. Липополисахарид (ЛПС), интерлейкин-8 (IL-8) и ПМА были одними из первых стимулов in vitro, описанных как индукторы NET, а участие IN VIVO NET в патогенных процессах было продемонстрировано в двух моделях острого воспаления: экспериментальной дизентерии и спонтанного аппендицита человека⁴. ДНК является важным компонентом NET. Его соответствующая структура и состав необходимы для связывания и уничтожения микроорганизмов путем доставки высокой локальной концентрации антимикробных молекул к пойманным микробам, о чем свидетельствует кратковременная обработка дезоксирибонуклеазой (ДНКаза), которая разрушает НЭТ и их микробицидные свойства⁴. Помимо ДНК, NETs содержат присоединенные белки, такие как гистоны, нейтрофильная эластаза (NE), катепсин G (CG), протеиназа 3, лактоферрин, желатиназа, миелопероксидаза (MPO) и антимикробные пептиды (AMPs), такие как катионный провоспалительный пептидный кателицидин LL-37 среди других ^8,9. Такие агрегаты могут образовывать более крупные нити диаметром до 50 нм. Эти факторы могут нарушать микробные факторы вирулентности или целостность клеточной мембраны патогена; кроме того, AMP могут стабилизировать ПОЛУЧЕННУЮ ИЗ NET ДНК против деградации бактериальными нуклеазами¹⁰.

Конкретные механизмы, регулирующие образование NET, до сих пор полностью не выяснены. Наиболее характеризуемым путем, ведущим к высвобождению NET, является передача сигналов ERK, которая приводит к активации NADPH-оксидазы и производству активных форм кислорода (АФК), а также к увеличению внутриклеточного кальция, который вызывает активацию пути MPO. Это, в свою очередь, превращает перекись водорода в хлорноватистую кислоту, активируя NE путем окисления^11,12. NE отвечает за деградацию актиновых нитей цитоскелета для блокирования фагоцитоза и перемещения их в ядро для обработки протеолитическим расщеплением и дезаминированием PAD4, которые управляют десенсибилизацией хроматиновых волокон, которые связываются с гранулами и цитоплазматическими белками, а затем высвобождаются внеклеточным^{образом 7}. Эти протеазы включают те, которые высвобождаются из азуросомного комплекса гранул азурофилов и других протеаз, таких как катепсин G¹³.

В зависимости от морфологических изменений нейтрофилов, НЭТ классифицируются на два типа: суицидальное или литическое образование NET, приводящее к гибели клеток⁴, и жизненно важное или нелитическое ОБРАЗОВАНИЕ NET, продуцируемое жизнеспособными клетками, опосредованными везикулярным высвобождением ядерной или митохондриальной ДНК, с остатком ануклеированного цитопласта с фагоцитарной способностью^14,15. Как правило, НЭТ, состоящие из митохондриальной ДНК, имеют удлиненную морфологию волокна¹⁴, в то время как те, которые структурированы из ядерной ДНК, имеют облачный вид³. Однако неизвестно, как нейтрофил выбирает свое ДНК-происхождение. В отличие от предыдущих исследований, которые описывали канонические пути НЭТ как требующие нескольких часов, жизненно важный путь быстро активируется всего за 5-60 минут¹⁵.

Несмотря на эти достижения, состав NET варьируется в зависимости от стимула; например, различные мукоидные и немукоидные штаммы P. aeruginosa индуцируют образование NETs, содержащих 33 общих белка и до 50 переменных белков⁷. Таким образом, необходимо гомогенизировать методики, позволяющие формировать объективные выводы в исследовательских группах. В данной работе описан протокол с различными методами, позволяющими сравнивать и оценивать состав, структуру и морфологию НЭТ, индуцированных различными микроорганизмами: золотистым стафилококком (грамположительная бактерия), Pseudomonas aeruginosa (грамотрицательная бактерия) и Candida albicans (гриб), а также химическими стимулами (PMA, HOCl) в нейтрофилах человека от здоровых людей. Репрезентативные результаты демонстрируют гетерогенность НЭТ в зависимости от их индуцирующего стимула в сопоставимых условиях in vitro, характеризующихся окрашиванием ДНК-DAPI, иммуноокрашиванием для LL37 и количественной оценкой ферментативной активности (NE, CG и MPO).