Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im Blutkreislauf und spielen eine wesentliche Rolle bei der Beseitigung von Krankheitserregern durch verschiedene Mechanismen, einschließlich der Freisetzung großer Chromatinstrukturen, die aus DNA und mehreren nuklearen, zytoplasmatischen und granulären antibakteriellen Proteinen bestehen ^1,2. Der direkte Vorläufer, der diese antimikrobielle Rolle von Neutrophilen beschreibt, wurde 1996 von Takei et ^al.3 erstellt. Diese Autoren berichteten über eine neue Form des Todes, die sich von Apoptose und Nekroptose bei Neutrophilen unterschied, morphologische Veränderungen zeigten, die einen Kernbruch zeigten, gefolgt von einem Austreten aus dem Nukleoplasma in das Zytoplasma und einer Erhöhung der Membranpermeabilität nach 3 Stunden Inkubation mit Phorbolmyristatacetat (PMA)^2,3. Es dauerte jedoch bis 2004, bis der Begriff “neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs)” verwendet wurde⁴.

Die NET-Bildung wurde unter verschiedenen Bedingungen beobachtet, wie z. B. bakteriellen,^Pilz-5-,^Virus-6– und parasitären Infektionen, um die mikrobielle Verbreitung zu neutralisieren, abzutöten und zu verhindern⁷. Andere Studien zeigen, dass es auch unter nicht-pathogenen Zuständen durch sterile Reize wie Zytokine, Mononatriumharnsäure- oder Cholesterinkristalle, Autoantikörper, Immunkomplexe und aktivierte Blutplättchen auftreten^{kann 7}. Lipopolysaccharid (LPS), Interleukin-8 (IL-8) und PMA gehörten zu den ersten In-vitro-Stimuli, die als NET-Induktoren beschrieben wurden, und die In-vivo-Beteiligung von NET an pathogenen Prozessen wurde in zwei Modellen akuter Entzündung nachgewiesen: experimentelle Dysenterie und spontane menschliche Appendizitis⁴. DNA ist eine wesentliche NET-Komponente. Seine geeignete Struktur und Zusammensetzung sind für die Sequestrierung und Abtötung von Mikroorganismen notwendig, indem eine hohe lokale Konzentration antimikrobieller Moleküle an die gefangenen Mikroben abgegeben wird, wie eine kurze Desoxyribonuklease (DNase)-Behandlung zeigt, die NETs und ihre mikrobiziden Eigenschaften zersetzt⁴. NETs umfassen neben DNA u.a. angehängte Proteine wie Histone, neutrophile Elastase (NE), Cathepsin G (CG), Proteinase 3, Lactoferrin, Gelatinase, Myeloperoxidase (MPO) und antimikrobielle Peptide (AMPs) wie das kationische proinflammatorische Peptid Cathelicidin LL-37 u.a. ^8,9. Solche Aggregate können größere Fäden mit Durchmessern von bis zu 50 nm bilden. Diese Faktoren können die mikrobiellen Virulenzfaktoren oder die Integrität der Zellmembran des Erregers stören. zusätzlich können die AMPs die NET-abgeleitete DNA gegen den Abbau durch bakterielle Nukleasen^{stabilisieren 10}.

Die spezifischen Mechanismen, die die NET-Bildung regulieren, sind noch nicht vollständig geklärt. Der am besten charakterisierte Weg, der zur NET-Freisetzung führt, ist der ERK-Signalweg, der zur Aktivierung der NADPH-Oxidase und zur Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sowie zu erhöhtem intrazellulärem Kalzium führt, das die Aktivierung des MPO-Signalwegs auslöst. Dies wiederum wandelt Wasserstoffperoxid in hypochlorige Säure um und aktiviert NE durch Oxidation^11,12. NE ist verantwortlich für den Abbau der Aktinfilamente des Zytoskeletts, um die Phagozytose zu blockieren, und für die Translokation in den Zellkern zur Verarbeitung durch proteolytische Spaltung und Desaminierung durch PAD4, die die Desensibilisierung von Chromatinfasern vorantreiben, die sich mit granulierten und zytoplasmatischen Proteinen verbinden und dann extrazellulär freigesetzt werden⁷. Zu diesen Proteasen gehören diejenigen, die aus dem Azurosomenkomplex des azurophilen Granulats und anderen Proteasen wie Cathepsin G¹³ freigesetzt werden.

Abhängig von den morphologischen Veränderungen der Neutrophilen werden NETs in zwei Typen eingeteilt: suizidale oder lytische NET-Bildung, die zum Zelltod führt⁴, und vitale oder nicht-lytische NET-Bildung, die von lebensfähigen Zellen erzeugt wird, die durch eine vesikuläre Freisetzung von nukleärer oder mitochondrialer DNA vermittelt wird, mit einem Überrest eines kernhaltigen Zytoplasten mit phagozytärer Fähigkeit^14,15. Im Allgemeinen weisen NETs, die aus mitochondrialer DNA bestehen, eine längliche^{Faser-14-Morphologie} auf, während solche, die aus Kern-DNA strukturiert sind, ein wolkenartiges Aussehen^{aufweisen 3}. Es ist jedoch nicht bekannt, wie die Neutrophile ihren DNA-Ursprung wählt. Im Gegensatz zu früheren Studien, die die kanonischen Signalwege von NETs als mehrere Stunden dauernd beschrieben, wird der Vitalweg in nur 5-60 min¹⁵ schnell aktiviert.

Trotz dieser Fortschritte variiert die NET-Zusammensetzung je nach Stimulus; Zum Beispiel induzieren verschiedene schleimige und nicht-mukoide Stämme von P. aeruginosa die Bildung von NETs, die 33 gemeinsame Proteine und bis zu 50 variable Proteine enthalten⁷. Daher ist es notwendig, Techniken zu homogenisieren, die die Generierung objektiver Schlussfolgerungen in Forschungsgruppen ermöglichen. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll mit verschiedenen Techniken, die den Vergleich und die Bewertung der Zusammensetzung, Struktur und Morphologie von NETs ermöglichen, die mit verschiedenen Mikroorganismen induziert werden: Staphylococcus aureus (grampositives Bakterium), Pseudomonas aeruginosa (gramnegatives Bakterium) und Candida albicans (Pilz) sowie chemische Stimuli (PMA, HOCl) in menschlichen Neutrophilen von gesunden Personen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen die Heterogenität von NETs in Abhängigkeit von ihrem induzierenden Stimulus unter vergleichbaren in vitro Bedingungen, gekennzeichnet durch DNA-DAPI-Färbung, Immunfärbung für LL37 und Quantifizierung der enzymatischen Aktivität (NE, CG und MPO).