Analisi morfologica e composizionale di trappole extracellulari neutrofile indotte da stimoli microbici e chimici

I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel flusso sanguigno, svolgendo un ruolo essenziale durante la clearance degli agenti patogeni attraverso diversi meccanismi, tra cui il rilascio di grandi strutture cromatiniche composte da DNA e diverse proteine antibatteriche nucleari, citoplasmatiche e granulari ^1,2. L’antecedente diretto che descrive questo ruolo antimicrobico dei neutrofili è stato fatto da Takei et ^al.3 nel 1996. Questi autori hanno riportato una nuova forma di morte diversa dall’apoptosi e dalla necroptosi nei neutrofili, hanno mostrato cambiamenti morfologici che mostrano rottura nucleare, seguita da fuoriuscita dal nucleoplasma nel citoplasma e un aumento della permeabilità della membrana da 3 ore di incubazione con forbolo miristato acetato (PMA)^2,3. Tuttavia, non è stato fino al 2004 che è stato utilizzato il termine “trappole extracellulari di neutrofili (NET)”⁴.

La formazione di NET è stata osservata in varie condizioni, come infezioni batteriche, fungine⁵, virali⁶ e parassitarie, per neutralizzare, uccidere e prevenire la diffusione microbica⁷. Altri studi dimostrano che può verificarsi anche in condizioni non patogene da stimoli sterili, come citochine, acido urico monosodico o cristalli di colesterolo, autoanticorpi, immunocomplessi e piastrine attivate⁷. Il lipopolisaccaride (LPS), l’interleuchina-8 (IL-8) e la PMA sono stati tra i primi stimoli in vitro descritti come induttori NET e il coinvolgimento in vivo del NET nei processi patogeni è stato dimostrato in due modelli di infiammazione acuta: dissenteria sperimentale e appendicite umana spontanea⁴. Il DNA è un componente essenziale di NET. La sua struttura e composizione appropriate sono necessarie per il sequestro e l’uccisione dei microrganismi fornendo un’alta concentrazione locale di molecole antimicrobiche verso i microbi catturati, come dimostrato da un breve trattamento con desossiribonucleasi (DNasi) che disintegra i NET e le loro proprietà microbicide⁴. Oltre al DNA, i NET comprendono proteine attaccate come istoni, elastasi neutrofila (NE), catepsina G (CG), proteinasi 3, lattoferrina, gelatinasi, mieloperossidasi (MPO) e peptidi antimicrobici (AMP) come il peptide pro-infiammatorio cationico catelicidina LL-37 tra gli altri ^8,9. Tali aggregati possono formare fili più grandi con diametri fino a 50 nm. Questi fattori possono interrompere i fattori di virulenza microbica o l’integrità della membrana cellulare patogena; inoltre, gli AMP possono stabilizzare il DNA derivato dal NET contro la degradazione da parte delle nucleasi batteriche¹⁰.

I meccanismi specifici che regolano la formazione di NET non sono ancora stati completamente chiariti. La via meglio caratterizzata che porta al rilascio di NET è attraverso la segnalazione ERK, che porta all’attivazione della NADPH ossidasi e alla produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), nonché all’aumento del calcio intracellulare che innesca l’attivazione della via MPO. Questo a sua volta trasforma il perossido di idrogeno in acido ipocloroso, attivando NE per ossidazione^11,12. NE è responsabile della degradazione dei filamenti di actina del citoscheletro per bloccare la fagocitosi e della loro traslocazione al nucleo per l’elaborazione mediante scissione proteolitica e deaminazione da parte di PAD4 che guidano la desensibilizzazione delle fibre di cromatina, che si associano a proteine granulari e citoplasmatiche, e vengono quindi rilasciate extracellulare⁷. Queste proteasi includono quelle rilasciate dal complesso degli azurosomi dei granuli azurofili e altre proteasi come la catepsina G¹³.

A seconda dei cambiamenti morfologici nei neutrofili, i NET sono classificati in due tipi: formazione di NET suicidaria o litica che porta alla morte cellulare⁴ e formazione di NET vitale o non litica prodotta da cellule vitali mediate da un rilascio vescicolare di DNA nucleare o mitocondriale, con un residuo di un citoplasto anucleato con capacità fagocitaria^14,15. Generalmente, i NET composti da DNA mitocondriale presentano una morfologia allungata della fibra¹⁴, mentre quelli strutturati di DNA nucleare hanno un aspetto simile a una nuvola³. Tuttavia, non è noto come il neutrofilo scelga la sua origine del DNA. Contrariamente a studi precedenti che descrivevano i percorsi canonici dei NET come se richiedessero diverse ore, il percorso vitale viene rapidamente attivato in soli 5-60 minuti^{e 15}.

Nonostante questi progressi, la composizione NET varia a seconda dello stimolo; ad esempio, diversi ceppi mucoidi e non mucoidi di P. aeruginosa inducono la formazione di NET contenenti 33 proteine comuni e fino a 50 proteine variabili⁷. Pertanto, è necessario omogeneizzare le tecniche che consentono la generazione di conclusioni oggettive nei gruppi di ricerca. Questo articolo descrive un protocollo con varie tecniche che consentono il confronto e la valutazione della composizione, della struttura e della morfologia dei NET indotti con diversi microrganismi: Staphylococcus aureus (batterio gram-positivo), Pseudomonas aeruginosa (batterio gram-negativo) e Candida albicans (fungo), nonché stimoli chimici (PMA, HOCl) in neutrofili umani da individui sani. I risultati rappresentativi dimostrano l’eterogeneità dei NET a seconda del loro stimolo inducente in condizioni comparabili in vitro, caratterizzate da colorazione DNA-DAPI, immunocolorazione per LL37 e quantificazione dell’attività enzimatica (NE, CG e MPO).