Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Nötrofiller, kan dolaşımındaki en bol lökositlerdir ve patojenik ajanların, DNA ve birkaç nükleer, sitoplazmik ve granüler antibakteriyel proteinden oluşan büyük kromatin yapılarının salınması da dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalarla temizlenmesi sırasında önemli bir rol oynarlar ^1,2. Nötrofillerin bu antimikrobiyal rolünü tanımlayan doğrudan öncül, 1996 yılında Takei ve ^ark.3 tarafından yapılmıştır. Bu yazarlar, nötrofillerde apoptoz ve nekroptozdan farklı yeni bir ölüm şekli bildirmiş, nükleer rüptür sergileyen morfolojik değişiklikler göstermiş, bunu nükleoplazmadan sitoplazmaya dökülmeyi ve forbol miristat asetat (PMA) ile 3 saatlik inkübasyondan membran geçirgenliğinde bir artış göstermiştir ^2,3. Bununla birlikte, 2004 yılına kadar “nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET’ler)” teriminin kullanıldığı⁴.

NET oluşumu, mikrobiyal yayılımı nötralize etmek, öldürmek ve önlemek için bakteriyel, fungal⁵, viral⁶ ve paraziter enfeksiyonlar gibi çeşitli koşullarda gözlenmiştir⁷. Diğer çalışmalar, patojenik olmayan koşullarda, sitokinler, monosodyum ürik asit veya kolesterol kristalleri, otoantikorlar, bağışıklık kompleksleri ve aktif trombositler gibi steril uyaranlarla da ortaya çıkabileceğini göstermektedir⁷. Lipopolisakkarit (LPS), interlökin-8 (IL-8) ve PMA, NET indükleyicileri olarak tanımlanan ilk in vitro uyaranlar arasındaydı ve patojenik süreçlerdeki in vivo NET katılımı iki akut inflamasyon modelinde gösterilmiştir: deneysel dizanteri ve spontan insan apandisiti⁴. DNA önemli bir NET bileşenidir. Uygun yapısı ve bileşimi, NET’leri ve mikrobisidal özelliklerini parçalayan kısa bir deoksiribonükleaz (DNaz) tedavisi ile gösterildiği gibi, yakalanan mikroplara karşı yüksek bir lokal antimikrobiyal molekül konsantrasyonu sağlayarak mikroorganizmaların tutulması ve öldürülmesi için gereklidir⁴. DNA’nın yanı sıra, NET’ler histonlar, nötrofil elastaz (NE), kathepsin G (CG), proteinaz 3, laktoferrin, jelatinaz, miyeloperoksidaz (MPO) ve katyonik pro-inflamatuar peptid katelisidin LL-37 gibi antimikrobiyal peptitler (AMP’ler) gibi bağlı proteinleri içerir ^8,9. Bu tür agregalar, 50 nm’ye kadar çaplara sahip daha büyük dişler oluşturabilir. Bu faktörler mikrobiyal virülans faktörlerini veya patojen hücre zarının bütünlüğünü bozabilir; Ek olarak, AMP’ler NET kaynaklı DNA’yı bakteriyel nükleazlar tarafından bozulmaya karşı stabilize edebilir¹⁰.

NET oluşumunu düzenleyen spesifik mekanizmalar henüz tam olarak açıklığa kavuşturulmamıştır. NET salınımına yol açan en iyi karakterize yol, NADPH oksidaz aktivasyonu ve reaktif oksijen türleri (ROS) üretiminin yanı sıra MPO yolunun aktivasyonunu tetikleyen hücre içi kalsiyumun artmasına yol açan ERK sinyallemesidir. Bu da hidrojen peroksiti hipokloröz aside dönüştürür ve NE’yi oksidasyon^11,12 ile aktive eder. NE, fagositozu bloke etmek için sitoiskeletin aktin filamentlerinin parçalanmasından ve granül ve sitoplazmik proteinlerle ilişkili kromatin liflerinin duyarsızlaştırılmasını sağlayan ve daha sonra hücre dışı olarak salınan PAD4 ile proteolitik bölünme ve deaminasyon ile işlenmek üzere çekirdeğe taşınmasından sorumludur⁷. Bu proteazlar, azurofil granüllerinin azurozom kompleksinden ve kathepsin G¹³ gibi diğer proteazlardan salınanları içerir.

Nötrofillerdeki morfolojik değişikliklere bağlı olarak, NET’ler iki tipte sınıflandırılır: hücre ölümüne yol açan intihar veya litik NET oluşumu⁴ ve nükleer veya mitokondriyal DNA’nın veziküler salınımının aracılık ettiği canlı hücreler tarafından üretilen hayati veya litik olmayan NET oluşumu, fagositik kapasiteye sahip bir anüklee sitoplastın kalıntısı^14,15. Genel olarak, mitokondriyal DNA’dan oluşan NET’ler uzatılmış bir lif¹⁴ morfolojisi sunarken, nükleer DNA’dan yapılandırılmış olanlar bulut benzeri bir görünüme sahiptir³. Bununla birlikte, nötrofilin DNA kökenini nasıl seçtiği bilinmemektedir. NET’lerin kanonik yollarını birkaç saat gerektirdiğini tanımlayan önceki çalışmaların aksine, hayati yol sadece 5-60 dakika^15’te hızla aktive edilir.

Bu ilerlemelere rağmen, NET bileşimi uyarana bağlı olarak değişir; Örneğin, P. aeruginosa’nın farklı mukoid ve mukoid olmayan suşları, 33 ortak protein ve 50’ye kadar değişken protein^içeren NET’lerin oluşumunu indükler. Bu nedenle, araştırma gruplarında nesnel sonuçların üretilmesine izin veren teknikleri homojenize etmek gerekir. Bu yazıda, farklı mikroorganizmalarla indüklenen NET’lerin bileşiminin, yapısının ve morfolojisinin karşılaştırılmasına ve değerlendirilmesine olanak tanıyan çeşitli tekniklerle bir protokol açıklanmaktadır: Staphylococcus aureus (gram-pozitif bakteri), Pseudomonas aeruginosa (gram-negatif bakteri) ve Candida albicans (mantar) ve sağlıklı bireylerden gelen insan nötrofillerinde kimyasal uyaranlar (PMA, HOCl). Temsili sonuçlar, DNA-DAPI boyaması, LL37 için immün boyama ve enzimatik aktivitenin (NE, CG ve MPO) nicelleştirilmesi ile karakterize edilen karşılaştırılabilir in vitro koşullar altında indükleyici uyaranlarına bağlı olarak NET’lerin heterojenliğini göstermektedir.