Analyse morphologique et compositionnelle des pièges extracellulaires neutrophiles induits par des stimuli microbiens et chimiques

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans la circulation sanguine, jouant un rôle essentiel lors de la clairance des agents pathogènes par plusieurs mécanismes, dont la libération de grandes structures chromatiniques composées d’ADN et de plusieurs protéines antibactériennes nucléaires, cytoplasmiques et granulaires ^1,2. L’antécédent direct décrivant ce rôle antimicrobien des neutrophiles a été fait par Takei et ^al.3 en 1996. Ces auteurs ont rapporté une nouvelle forme de mort différente de l’apoptose et de la nécroptose chez les neutrophiles, ont montré des changements morphologiques présentant une rupture nucléaire, suivie d’un débordement du nucléoplasme dans le cytoplasme, et une augmentation de la perméabilité de la membrane à partir de 3 h d’incubation avec l’acétate de myristate de phorbol (PMA)^2,3. Cependant, ce n’est qu’en 2004 que le terme « pièges extracellulaires (TNE) » a été utilisé⁴.

La formation de TNE a été observée dans diverses conditions, telles que les infections bactériennes, fongiques⁵, virales⁶ et parasitaires, pour neutraliser, tuer et prévenir la dissémination microbienne⁷. D’autres études montrent qu’il peut également se produire dans des conditions non pathogènes par des stimuli stériles, tels que des cytokines, des cristaux d’acide urique monosodique ou de cholestérol, des auto-anticorps, des complexes immunitaires et des plaquettes activées⁷. Le lipopolysaccharide (LPS), l’interleukine-8 (IL-8) et la PMA ont été parmi les premiers stimuli in vitro décrits comme des inducteurs NET, et l’implication in vivo des TNE dans les processus pathogènes a été démontrée dans deux modèles d’inflammation aiguë : la dysenterie expérimentale et l’appendicite humaine spontanée⁴. L’ADN est une composante essentielle de la TNE. Sa structure et sa composition appropriées sont nécessaires à la séquestration et à la destruction des micro-organismes en délivrant une forte concentration locale de molécules antimicrobiennes vers les microbes capturés, comme le démontre un bref traitement par désoxyribonucléase (DNase) qui désintègre les TNE et leurs propriétés microbicides⁴. Outre l’ADN, les TNE comprennent des protéines attachées telles que les histones, l’élastase neutrophile (NE), la cathepsine G (CG), la protéinase 3, la lactoferrine, la gélatinase, la myéloperoxydase (MPO) et les peptides antimicrobiens (AMP) tels que le peptide cationique pro-inflammatoire cathélicidine LL-37, entre autres, ^8,9. Ces agrégats peuvent former des fils plus grands avec des diamètres allant jusqu’à 50 nm. Ces facteurs peuvent perturber les facteurs de virulence microbienne ou l’intégrité de la membrane cellulaire pathogène; de plus, les AMPs peuvent stabiliser l’ADN dérivé de NET contre la dégradation par les nucléases bactériennes¹⁰.

Les mécanismes spécifiques régulant la formation des TNE n’ont pas encore été complètement clarifiés. La voie la mieux caractérisée menant à la libération de NET est la signalisation ERK, qui conduit à l’activation de la NADPH oxydase et à la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), ainsi qu’à une augmentation du calcium intracellulaire qui déclenche l’activation de la voie MPO. Cela transforme à son tour le peroxyde d’hydrogène en acide hypochloreux, activant NE par oxydation^11,12. L’entérite nécrotique est responsable de la dégradation des filaments d’actine du cytosquelette pour bloquer la phagocytose et de leur translocation vers le noyau pour traitement par clivage protéolytique et désamination par PAD4 qui entraînent la désensibilisation des fibres de chromatine, qui s’associent aux protéines granulaires et cytoplasmiques, et sont ensuite libérées extracellulairement⁷. Ces protéases comprennent celles libérées par le complexe azurosome des granules azurophiles et d’autres protéases telles que la cathepsine G¹³.

Selon les changements morphologiques des neutrophiles, les TNE sont classées en deux types : la formation de TNE suicidaires ou lytiques conduisant à la mort cellulaire⁴, et la formation de TNE vitale ou non lytique produite par des cellules viables médiées par une libération vésiculeuse d’ADN nucléaire ou mitochondrial, avec un reste d’un cytoplaste anucléé ayant une capacité phagocytaire^14,15. Généralement, les TNE composées d’ADN mitochondrial présentent une morphologie allongée^{de fibres 14}, tandis que celles structurées d’ADN nucléaire ont une apparence nuageuse³. Cependant, on ne sait pas comment le neutrophile choisit son origine ADN. Contrairement aux études précédentes qui décrivaient les voies canoniques des TNE comme nécessitant plusieurs heures, la voie vitale est rapidement activée en seulement 5 à 60 minutes¹⁵.

Malgré ces avancées, la composition de l’EVF varie en fonction du stimulus; par exemple, différentes souches mucoïdes et non mucoïdes de P. aeruginosa induisent la formation de TNE contenant 33 protéines communes et jusqu’à 50 protéines variables⁷. Ainsi, il est nécessaire d’homogénéiser les techniques qui permettent la génération de conclusions objectives dans les groupes de recherche. Cet article décrit un protocole avec diverses techniques qui permettent de comparer et d’évaluer la composition, la structure et la morphologie des TNE induites par différents micro-organismes: Staphylococcus aureus (bactérie à Gram positif), Pseudomonas aeruginosa (bactérie à Gram négatif) et Candida albicans (champignon), ainsi que des stimuli chimiques (PMA, HOCl) dans les neutrophiles humains d’individus sains. Les résultats représentatifs démontrent l’hétérogénéité des TNE en fonction de leur stimulus inducteur dans des conditions in vitro comparables, caractérisées par la coloration de l’ADN-DAPI, l’immunomarquage pour LL37 et la quantification de l’activité enzymatique (NE, CG et MPO).