Summary

Cyclische peptiden construeren met behulp van een on-tether sulfoniumcentrum

Published: September 28, 2022
doi:

Summary

Dit protocol presenteert de synthese van cyclische peptiden via bisalkylering tussen cysteïne en methionine en de gemakkelijke thiol-yne-reactie veroorzaakt door het propargylsulfoniumcentrum.

Abstract

In de afgelopen jaren hebben cyclische peptiden steeds meer aandacht getrokken op het gebied van medicijnontdekking vanwege hun uitstekende biologische activiteiten, en als gevolg daarvan worden ze nu klinisch gebruikt. Het is daarom van cruciaal belang om effectieve strategieën te zoeken voor het synthetiseren van cyclische peptiden om hun toepassing op het gebied van medicijnontdekking te bevorderen. Dit artikel rapporteert een gedetailleerd protocol voor de efficiënte synthese van cyclische peptiden met behulp van on-resin of intramoleculaire (intermoleculaire) bisalkylering. Met behulp van dit protocol werden lineaire peptiden gesynthetiseerd door gebruik te maken van vaste-fase peptidesynthese met cysteïne (Cys) en methionine (Met) die tegelijkertijd aan de hars werden gekoppeld. Verder werden cyclische peptiden gesynthetiseerd via bisalkylering tussen Met en Cys met behulp van een instelbare tether en een on-tether sulfoniumcentrum. De hele synthetische route kan worden onderverdeeld in drie belangrijke processen: de bescherming van Cys op de hars, de koppeling van de linker en de cyclisering tussen Cys en Met in een trifluorazijnzuur (TFA) splitsingsoplossing. Bovendien, geïnspireerd door de reactiviteit van het sulfoniumcentrum, werd een propargylgroep aan de Met gehecht om thiol-yne-toevoeging te activeren en een cyclisch peptide te vormen. Daarna werden de ruwe peptiden gedroogd en opgelost in acetonitril, gescheiden en vervolgens gezuiverd door high-performance vloeistofchromatografie (HPLC). Het molecuulgewicht van het cyclische peptide werd bevestigd door vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS), en de stabiliteit van de cyclische peptidecombinatie met het reductant werd verder bevestigd met behulp van HPLC. Bovendien werd de chemische verschuiving in het cyclische peptide geanalyseerd door 1H nucleaire magnetische resonantie (1H NMR) spectra. Over het algemeen was dit protocol gericht op het vaststellen van een effectieve strategie voor het synthetiseren van cyclische peptiden.

Introduction

Eiwit-eiwit interacties (PPI’s)1 spelen een cruciale rol in onderzoek en ontwikkeling van geneesmiddelen. Het construeren van gestabiliseerde peptiden met een vaste conformatie met chemische middelen is een van de belangrijkste methoden voor het ontwikkelen van mimetische motieven van PPI’s2. Tot op heden zijn verschillende cyclische peptiden die zich richten op PPI’s ontwikkeld voor klinisch gebruik3. De meeste peptiden zijn beperkt tot een α-helix conformatie om de conformationele entropie te verminderen en de metabole stabiliteit, doelbindingsaffiniteit en celpermeabiliteit te verbeteren 4,5. In de afgelopen 2 decennia zijn de zijketens van Cys 6,7, lysine 8,9, tryptofaan10, arginine11 en Met 12,13 in onnatuurlijke aminozuren ingebracht om het peptide in een cyclische conformatie te fixeren. Dergelijke cyclische peptiden kunnen zich richten op een unieke chemische ruimte of speciale plaatsen, waardoor een covalente reactie wordt geactiveerd om eiwit-peptide covalente binding 14,15,16,17 te vormen. In een recent rapport van Yu et al. werd een chloroacetamide verankerd in het domein van peptideliganden, waardoor een covalente conjugatiereactie met een uitstekende eiwitspecificiteitwerd gewaarborgd 18. Bovendien werden elektrofiele kernkoppen, zoals acrylamide en arylsulfonylfluoride (ArSO2F), verder opgenomen in peptiden door Walensky et al.19 om gestabiliseerde peptide covalente remmers te vormen en het antitumoreffect van peptideremmers te verbeteren. Daarom is het erg belangrijk om een extra functionele groep te introduceren om eiwit-peptide liganden covalent te modificeren20. Deze groepen reageren niet alleen met eiwitten aan de zijketen, maar stabiliseren ook de secundaire structuur van het peptide21. De toepassing van covalent gemodificeerde eiwitten geïnduceerd door peptideliganden is echter beperkt vanwege de gecompliceerde synthetische route en de niet-specifieke binding van de chemische groepen22,23. Effectieve strategieën voor de synthese van cyclische peptiden zijn daarom dringend nodig.

Geïnspireerd door de veelzijdige strategieën van cyclische peptiden 2,24,25,26, probeert dit protocol een eenvoudige en efficiënte methode te ontwikkelen voor het stabiliseren van peptiden. Bovendien merkten we op dat de zijketengroep van een stabiel peptide covalent kon reageren met een doeleiwit wanneer het ruimtelijk dicht bij de peptideliganden lag. Het gebrek aan chemisch gemodificeerde Met werd in 2013 door de Deming-groep opgevuld door een nieuwe methode te ontwikkelen voor het produceren van selectief gemodificeerd peptide methionine27. Op basis van deze achtergrond richtten de Shi et al. zich op de ontwikkeling van de ringsluiting van zijketens om een sulfoniumzoutcentrum te vormen. Wanneer het peptide ligand zich combineert met het doeleiwit, reageert de sulfoniumzoutgroep covalent met het ruimtelijk nauwe Cys-eiwit. In de afgelopen jaren hebben de Shi et al. een nieuwe methode ontworpen voor het stabiliseren van cyclisch peptide28. Het sulfoniumzout op het cyclische peptide werd gereduceerd door een reductiemiddel met een sulfhydrylgroep die reversibel werd gereduceerd tot Met. De reactie had echter een lage efficiëntie, wat schadelijk was voor latere biologische toepassingsstudies. In de huidige studie werd een Met-Cys en propargylbromide-Cys ringsluitingsreactie ontworpen, waarbij een enkel sulfoniumzout achterbleef aan de zijketen van het cyclische peptide. Het sulfoniumzout fungeerde als een nieuwe kernkop die covalent reageerde met het eiwit Cys onder ruimtelijke nabijheid. Kortom, een Cys en Met gemuteerd peptide werd gecyclizeerd door intramoleculaire alkylering, wat resulteerde in het genereren van een on-tether sulfoniumcentrum. In dit proces was de vorming van een zijketenbrug van cruciaal belang voor cyclische peptiden. Over het algemeen beschrijft dit protocol een gedetailleerde op sulfonium gebaseerde peptidecyclisatie die wordt bereikt met behulp van eenvoudige reactieomstandigheden en -bewerkingen. Het doel is om een mogelijke methode te ontwikkelen voor verdere brede biologische toepassingen.

Protocol

1. Voorbereiding van de apparatuur LET OP: Morfoline, N, N-dimethylformamide (DMF), dichloormethaan (DCM), N, N-diisopropylethylamine (DIPEA), TFA, morfoline, piperidine, diethylether en methanol zijn giftig, vluchtig en corrosief. Deze reagentia kunnen het menselijk lichaam schaden door inademing, inname of huidcontact. Gebruik voor alle chemische experimenten beschermende uitrusting, waaronder wegwerphandschoenen, experimentele jassen en beschermende brillen. Const…

Representative Results

Alle lineaire peptiden werden gesynthetiseerd op Rink-amide MBHA-hars door standaard handmatige Fmoc vaste-fasesynthese. Een model cyclisch hexapeptide (Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH2) werd geconstrueerd zoals beschreven in figuur 5A. Met name een nieuw on-tether chiraal centrum werd gegenereerd door Met-alkylering, waarbij de twee epimeren van cyclisch peptide (Ia, Ib) werden bevestigd door reverse-phase HPLC. Verder werden de conversie en verhouding van epimeren bepaald met behulp van …

Discussion

De synthetische benadering die in dit artikel wordt beschreven, biedt een methode voor het synthetiseren van cyclische peptiden met behulp van Cys en Met in de peptidesequentie, waarbij de elementaire lineaire peptiden worden geconstrueerd door gemeenschappelijke vaste-fase peptidesynthesetechnieken. Voor de bisalkylering van cyclische peptiden tussen Cys en Met kan de hele synthetische route worden onderverdeeld in drie belangrijke processen: de bescherming van Cys op de hars, de koppeling van de linker en de cycliserin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We erkennen financiële steun van het National Key R&D-programma van China (2021YFC2103900); de Natural Science Foundation of China subsidies (21778009, en 21977010); de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (2022A1515010996 en 2020A1515010521): de Shenzhen Science and Technology Innovation Committee, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 en JCYJ20200109140406047); en de Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions grant (2019SHIBS0004). De auteurs erkennen tijdschriftondersteuning van Chemical Science, The Royal Society of Chemistry voor referentie 30 en The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, voor referentie 31.

Materials

1,3-bis(bromomethyl)-benzen Energy D0215
1,3-Dimethylbarbituric acid Energy A46873
1H NMR and HSQC Bruker  AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrate Energy E020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) Energy A1797
2-mercaptopyridine Energy Y31130
6-Aminocaproic acid Energy A010678
Acetic anhydride Energy A01021454
Acetonitrile Aldrich 9758
Ammonium carbonate Energy 12980
Dichloromethane (DCM) Energy W330229
Digital Heating Cooling Drybath  Thermo Scientific 88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA) Energy W320014
Dimethyl formamide (DMF) Energy B020051
Dithiothreitol Energy A10027
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU2020  LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30701
Fmoc-His(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30902
Fmoc-Ile-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31201
Fmoc-Met-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31301
Fmoc-Pro-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31901
Fmoc-Val-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R32001
Formic acid Energy W810042
High Performance Liquid
Chromatography
SHIMADZU LC-2030
Methanol Aldrich 9758
Morpholine Aldrich M109062
N,N'-Diisopropylcarbodiimide Energy B010023
Ninhydrin Reagent Energy N7285
Propargyl bromide Energy W320293
Rink Amide MBHA resin Nanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates  Thermo Scientific 60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium Energy T1350
Three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
Triethylamine Energy B010737
Trifluoroacetic acid (TFA) J&K 101398
Triisopropylsilane (TIS) Energy T1533

References

  1. Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
  2. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  3. Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
  4. White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
  5. Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
  6. Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
  7. Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
  8. Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
  9. Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  10. Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
  11. Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
  12. Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
  13. Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
  14. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
  15. Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
  16. Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
  17. Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
  18. Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
  19. Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
  20. Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
  21. Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
  22. Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
  23. Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
  24. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  25. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  26. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  27. Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
  28. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  29. Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
  30. Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
  31. Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
  32. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).

Play Video

Cite This Article
Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu, Z., Lian, C., Zhang, M., Liang, W., Yin, F., Li, Z. Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center. J. Vis. Exp. (187), e64289, doi:10.3791/64289 (2022).

View Video