Questo protocollo presenta la sintesi di peptidi ciclici tramite bisalchilazione tra cisteina e metionina e la facile reazione tiolo-yne innescata dal centro del propargil sulfinfo.
Negli ultimi anni, i peptidi ciclici hanno attirato una crescente attenzione nel campo della scoperta di farmaci grazie alle loro eccellenti attività biologiche e, di conseguenza, sono ora utilizzati clinicamente. È quindi fondamentale cercare strategie efficaci per sintetizzare peptidi ciclici per promuovere la loro applicazione nel campo della scoperta di farmaci. Questo articolo riporta un protocollo dettagliato per la sintesi efficiente di peptidi ciclici utilizzando bisalchilazione on-resina o intramolecolare (intermolecolare). Utilizzando questo protocollo, i peptidi lineari sono stati sintetizzati sfruttando la sintesi di peptidi in fase solida con cisteina (Cys) e metionina (Met) accoppiati simultaneamente sulla resina. Inoltre, i peptidi ciclici sono stati sintetizzati tramite bisalchilazione tra Met e Cys utilizzando un cavo sintonizzabile e un centro di solfonio on-tether. L’intero percorso sintetico può essere suddiviso in tre processi principali: la deprotezione di Cys sulla resina, l’accoppiamento del linker e la ciclizzazione tra Cys e Met in una soluzione di scissione dell’acido trifluoroacetico (TFA). Inoltre, ispirato dalla reattività del centro del sulfonio, un gruppo propargilico è stato attaccato al Met per innescare l’aggiunta di tiolo-yne e formare un peptide ciclico. Successivamente, i peptidi grezzi sono stati essiccati e sciolti in acetonitrile, separati e quindi purificati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Il peso molecolare del peptide ciclico è stato confermato dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) e la stabilità della combinazione di peptidi ciclici con il riducente è stata ulteriormente confermata utilizzando HPLC. Inoltre, lo spostamento chimico nel peptide ciclico è stato analizzato da spettri di risonanza magnetica nucleare1 H (1H NMR). Nel complesso, questo protocollo mirava a stabilire una strategia efficace per sintetizzare peptidi ciclici.
Le interazioni proteina-proteina (PPI)1 svolgono un ruolo fondamentale nella ricerca e nello sviluppo di farmaci. La costruzione di peptidi stabilizzati con una conformazione fissa con mezzi chimici è uno dei metodi più importanti per lo sviluppo di motivi mimetici di PPI2. Ad oggi, diversi peptidi ciclici che prendono di mira i PPI sono stati sviluppati per uso clinico3. La maggior parte dei peptidi sono vincolati a una conformazione a α-elica per diminuire l’entropia conformazionale e migliorare la stabilità metabolica, l’affinità di legame del bersaglio e la permeabilità cellulare 4,5. Negli ultimi 2 decenni, le catene laterali di Cys 6,7, lisina8,9, triptofano 10, arginina 11 e Met12,13 sono state inserite in amminoacidi innaturali per fissare il peptide in una conformazione ciclica. Tali peptidi ciclici possono colpire uno spazio chimico unico o siti speciali, innescando così una reazione covalente per formare un legame covalente proteina-peptide14,15,16,17. In un recente rapporto di Yu et al., una cloroacetammide è stata ancorata al dominio dei ligandi peptidici, garantendo una reazione di coniugazione covalente con un’eccellente specificità proteica18. Inoltre, testate elettrofile, come l’acrilammide e il fluoruro di arilsulfonile (ArSO2F), sono state ulteriormente incorporate nei peptidi da Walensky et al.19 per formare inibitori covalenti peptidici stabilizzati e migliorare l’effetto antitumorale degli inibitori peptidici. Pertanto, è molto importante introdurre un ulteriore gruppo funzionale per modificare covalentemente i ligandi proteina-peptide20. Questi gruppi non solo reagiscono con le proteine sulla catena laterale, ma stabilizzano anche la struttura secondaria del peptide21. Tuttavia, l’applicazione di proteine modificate covalentemente indotta da ligandi peptidici è limitata a causa della complicata via sintetica e del legame non specifico dei gruppi chimici22,23. Sono quindi urgentemente necessarie strategie efficaci per la sintesi di peptidi ciclici.
Ispirato alle molteplici strategie dei peptidi ciclici 2,24,25,26, questo protocollo tenta di sviluppare un metodo semplice ed efficace per stabilizzare i peptidi. Inoltre, abbiamo notato che il gruppo della catena laterale di un peptide stabile potrebbe reagire covalentemente con una proteina bersaglio quando era spazialmente vicino ai ligandi peptidici. La mancanza di Met chimicamente modificato è stata colmata dal gruppo Deming nel 2013 sviluppando un nuovo metodo per produrre metionina27 peptidica selettivamente modificata. Sulla base di questo background, Shi et al. si sono concentrati sullo sviluppo della chiusura ad anello delle catene laterali per formare un centro di sali di sulfone. Quando il ligando peptidico si combina con la proteina bersaglio, il gruppo salino solfonico reagisce covalentemente con la proteina Cys spazialmente vicina. Negli ultimi anni, Shi et al. hanno progettato un nuovo metodo per stabilizzare il peptide ciclico28. Il sale di solfonio sul peptide ciclico è stato ridotto da un agente riducente con un gruppo sulfidrilico che è stato ridotto reversibilmente a Met. Tuttavia, la reazione ha avuto una bassa efficienza, che è stata dannosa per i successivi studi di applicazione biologica. Nel presente studio, è stata progettata una reazione di chiusura dell’anello Met-Cys e propargyl bromuro-Cys, con un singolo sale di solfonio che rimane sulla catena laterale del peptide ciclico. Il sale di solfonio agiva come una nuova testata che reagiva covalentemente con la proteina Cys nelle vicinanze spaziali. In breve, un peptide mutato Cys e Met è stato ciclizzato mediante alchilazione intramolecolare, con conseguente generazione di un centro di solfonio on-tether. In questo processo, la formazione di un ponte a catena laterale era fondamentale per i peptidi ciclici. Nel complesso, questo protocollo descrive una ciclizzazione dettagliata del peptide a base di solfonio che si ottiene utilizzando semplici condizioni e operazioni di reazione. L’obiettivo è quello di sviluppare un metodo potenziale per ulteriori applicazioni biologiche di ampia portata.
L’approccio sintetico descritto in questo articolo fornisce un metodo per sintetizzare peptidi ciclici utilizzando Cys e Met nella sequenza peptidica, in cui i peptidi lineari di base sono costruiti con tecniche comuni di sintesi peptidica in fase solida. Per la bisalchilazione di peptidi ciclici tra Cys e Met, l’intera via sintetica può essere suddivisa in tre processi principali: la deprotezione di Cys sulla resina, l’accoppiamento del linker e la ciclizzazione tra Cys e Met in una soluzione di scissione dell’acido tr…
The authors have nothing to disclose.
Riconosciamo il sostegno finanziario del National Key R&D Program of China (2021YFC2103900); le sovvenzioni della Natural Science Foundation of China (21778009 e 21977010); la Fondazione per le scienze naturali della provincia del Guangdong (2022A1515010996 e 2020A1515010521): il Comitato per l’innovazione scientifica e tecnologica di Shenzhen (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 e JCYJ20200109140406047); e la sovvenzione Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions (2019SHIBS0004). Gli autori riconoscono il supporto della rivista Chemical Science , The Royal Society of Chemistry per il riferimento 30 e The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, per il riferimento 31.
1,3-bis(bromomethyl)-benzen | Energy | D0215 | |
1,3-Dimethylbarbituric acid | Energy | A46873 | |
1H NMR and HSQC | Bruker | AVANCE-III 400 | |
1-Hydroxybenzotriazole hydrate | Energy | E020543 | |
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | Energy | A1797 | |
2-mercaptopyridine | Energy | Y31130 | |
6-Aminocaproic acid | Energy | A010678 | |
Acetic anhydride | Energy | A01021454 | |
Acetonitrile | Aldrich | 9758 | |
Ammonium carbonate | Energy | 12980 | |
Dichloromethane (DCM) | Energy | W330229 | |
Digital Heating Cooling Drybath | Thermo Scientific | 88880029 | |
Diisopropylethylamine (DIPEA) | Energy | W320014 | |
Dimethyl formamide (DMF) | Energy | B020051 | |
Dithiothreitol | Energy | A10027 | |
Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU2020 | LC-MS2020 | |
Fmoc-Ala-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30101 | |
Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30201 | |
Fmoc-Cys(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30501 | |
Fmoc-Gln(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30601 | |
Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30701 | |
Fmoc-His(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30902 | |
Fmoc-Ile-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31001 | |
Fmoc-Lys(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31201 | |
Fmoc-Met-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31301 | |
Fmoc-Pro-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31501 | |
Fmoc-Ser(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31601 | |
Fmoc-Thr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31701 | |
Fmoc-Trp(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31801 | |
Fmoc-Tyr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31901 | |
Fmoc-Val-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R32001 | |
Formic acid | Energy | W810042 | |
High Performance Liquid Chromatography |
SHIMADZU | LC-2030 | |
Methanol | Aldrich | 9758 | |
Morpholine | Aldrich | M109062 | |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Energy | B010023 | |
Ninhydrin Reagent | Energy | N7285 | |
Propargyl bromide | Energy | W320293 | |
Rink Amide MBHA resin | Nanjing Peptide Biotech Ltd. | ||
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates | Thermo Scientific | 60300-403 | |
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium | Energy | T1350 | |
Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
Triethylamine | Energy | B010737 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | J&K | 101398 | |
Triisopropylsilane (TIS) | Energy | T1533 |