بناء الببتيدات الحلقية باستخدام مركز السلفونيوم على الحبل
Summary
يقدم هذا البروتوكول تخليق الببتيدات الحلقية عن طريق البيسالكيل بين السيستين والميثيونين وتفاعل ثيول ين السهل الناجم عن مركز بروبارجيل السلفونيوم.
Abstract
في السنوات الأخيرة ، جذبت الببتيدات الدورية اهتماما متزايدا في مجال اكتشاف الأدوية بسبب أنشطتها البيولوجية الممتازة ، ونتيجة لذلك ، يتم استخدامها الآن سريريا. لذلك ، من الأهمية بمكان البحث عن استراتيجيات فعالة لتوليف الببتيدات الحلقية لتعزيز تطبيقها في مجال اكتشاف الأدوية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للتوليف الفعال للببتيدات الحلقية باستخدام ثنائي الألكلة على الراتنج أو داخل الجزيئات (بين الجزيئات). باستخدام هذا البروتوكول ، تم تصنيع الببتيدات الخطية من خلال الاستفادة من تخليق الببتيد في المرحلة الصلبة مع السيستين (Cys) والميثيونين (Met) المقترن في وقت واحد على الراتنج. علاوة على ذلك ، تم تصنيع الببتيدات الحلقية عن طريق البيسالكيل بين Met و Cys باستخدام حبل قابل للضبط ومركز سلفونيوم على الحبل. يمكن تقسيم المسار الاصطناعي بأكمله إلى ثلاث عمليات رئيسية: إزالة الحماية من Cys على الراتنج ، واقتران الرابط ، والدوران بين Cys و Met في محلول انقسام حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA). علاوة على ذلك ، مستوحاة من تفاعل مركز السلفونيوم ، تم إرفاق مجموعة بروبارجيل ب Met لتحفيز إضافة ثيول ين وتشكيل ببتيد دوري. بعد ذلك ، تم تجفيف الببتيدات الخام وإذابتها في الأسيتونيتريل ، وفصلها ، ثم تنقيتها بواسطة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC). تم تأكيد الوزن الجزيئي للببتيد الدوري بواسطة قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS) ، وتم تأكيد استقرار تركيبة الببتيد الدوري مع المختزل باستخدام HPLC. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل التحول الكيميائي في الببتيد الدوري بواسطة أطياف الرنين المغناطيسي النووي 1H (1H NMR). بشكل عام ، يهدف هذا البروتوكول إلى وضع استراتيجية فعالة لتوليف الببتيدات الدورية.
Introduction
تلعب تفاعلات البروتين والبروتين (PPIs)1 دورا محوريا في البحث والتطوير في مجال الأدوية. يعد بناء الببتيدات المستقرة ذات التشكل الثابت بالوسائل الكيميائية أحد أهم الطرق لتطوير أشكال محاكاة ل PPIs2. حتى الآن ، تم تطوير العديد من الببتيدات الحلقية التي تستهدف مثبطات مضخة البروتون للاستخدام السريري3. معظم الببتيدات مقيدة بتشكيل حلزوني α لتقليل الإنتروبيا التوافقية وتحسين الاستقرار الأيضي ، وتقارب ربط الهدف ، ونفاذية الخلية 4,5. في العقدين الماضيين ، تم إدخال السلاسل الجانبية ل Cys 6,7 و lysine8,9 و tryptophan 10 و arginine 11 و Met12,13 في الأحماض الأمينية غير الطبيعية لإصلاح الببتيد في شكل دوري. يمكن أن تستهدف هذه الببتيدات الحلقية مساحة كيميائية فريدة أو مواقع خاصة ، مما يؤدي إلى تفاعل تساهمي لتشكيل ارتباط تساهمي بالبروتينالببتيد 14،15،16،17. في تقرير حديث صادر عن Yu et al. ، تم تثبيت كلوروأسيتاميد في مجال روابط الببتيد ، مما يضمن تفاعل اقتران تساهمي مع خصوصية بروتين ممتازة18. علاوة على ذلك ، تم دمج الرؤوس الحربية المحبة للكهرباء ، مثل الأكريلاميد وفلوريد السلفونيل الأريل (ArSO2F) ، في الببتيدات بواسطة Walensky et al.19 لتشكيل مثبطات تساهمية ببتيدية مستقرة وتحسين التأثير المضاد للورم لمثبطات الببتيد. لذلك ، من المهم جدا إدخال مجموعة وظيفية إضافية من أجل تعديل روابط البروتين الببتيد20 تساهميا. لا تتفاعل هذه المجموعات مع البروتينات الموجودة على السلسلة الجانبية فحسب ، بل تعمل أيضا على استقرار التركيب الثانوي للببتيد21. ومع ذلك ، فإن تطبيق البروتينات المعدلة تساهميا التي تسببها روابط الببتيد محدود بسبب المسار الاصطناعي المعقد والارتباط غير المحدد للمجموعات الكيميائية22,23. لذلك ، هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات فعالة لتوليف الببتيدات الحلقية.
مستوحى من الاستراتيجيات المتنوعة للببتيدات الحلقية2،24،25،26 ، يحاول هذا البروتوكول تطوير طريقة بسيطة وفعالة لتثبيت الببتيدات. بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا أن مجموعة السلسلة الجانبية للببتيد المستقر يمكن أن تتفاعل تساهميا مع البروتين المستهدف عندما تكون قريبة مكانيا من روابط الببتيد. تم سد نقص Met المعدل كيميائيا من قبل مجموعة Deming في عام 2013 من خلال تطوير طريقة جديدة لإنتاج ميثيونين الببتيد المعدل بشكل انتقائي27. بناء على هذه الخلفية ، ركز Shi et al. على تطوير الإغلاق الحلقي للسلاسل الجانبية لتشكيل مركز ملح السلفونيوم. عندما يتحد ليجند الببتيد مع البروتين المستهدف ، تتفاعل مجموعة ملح السلفونيوم تساهميا مع بروتين Cys القريب مكانيا. في السنوات الأخيرة ، صمم Shi et al. طريقة جديدة لتثبيت الببتيد الدوري28. تم تقليل ملح السلفونيوم على الببتيد الدوري بواسطة عامل اختزال مع مجموعة سلفهيدريل التي تم اختزالها عكسيا إلى Met. ومع ذلك ، كان للتفاعل كفاءة منخفضة ، مما كان ضارا بدراسات التطبيق البيولوجي اللاحقة. في الدراسة الحالية ، تم تصميم تفاعل إغلاق حلقة Met-Cys وبروبارجيل بروميد-Cys ، مع بقاء ملح سلفونيوم واحد على السلسلة الجانبية للببتيد الدوري. كان ملح السلفونيوم بمثابة رأس حربي جديد يتفاعل تساهميا مع بروتين Cys تحت القرب المكاني. باختصار ، تم تدوير الببتيد المتحور Cys and Met عن طريق الألكلة داخل الجزيئات ، مما أدى إلى توليد مركز سلفونيوم على الحبل. في هذه العملية ، كان تشكيل جسر سلسلة جانبية أمرا بالغ الأهمية للببتيدات الدورية. بشكل عام ، يصف هذا البروتوكول دورة الببتيد التفصيلية القائمة على السلفونيوم والتي يتم تحقيقها باستخدام ظروف وعمليات تفاعل بسيطة. والهدف من ذلك هو تطوير طريقة محتملة لمزيد من التطبيقات البيولوجية الواسعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر النهج التركيبي الموصوف في هذه الورقة طريقة لتوليف الببتيدات الحلقية باستخدام Cys و Met في تسلسل الببتيد ، حيث يتم إنشاء الببتيدات الخطية الأساسية بواسطة تقنيات تخليق الببتيد ذات الطور الصلب الشائعة. بالنسبة لثنائي ألكلة الببتيدات الحلقية بين Cys و Met ، يمكن تقسيم المسار الاصطناعي بأكمله…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نقر بالدعم المالي من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFC2103900) ؛ منح مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية (21778009 و 21977010) ؛ مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ (2022A1515010996 و 2020A1515010521): لجنة الابتكار في العلوم والتكنولوجيا في شنتشن ، (RCJC20200714114433053 ، JCYJ201805081522131455 ، و JCYJ20200109140406047) ؛ ومنحة معهد شنتشن-هونغ كونغ لعلوم الدماغ – مؤسسات البحوث الأساسية في شنتشن (2019SHIBS0004). يقر المؤلفون بدعم المجلة من العلوم الكيميائية ، والجمعية الملكية للكيمياء كمرجع 30 ومجلة الكيمياء العضوية ، الجمعية الكيميائية الأمريكية ، كمرجع 31.
Materials
| 1,3-bis(bromomethyl)-benzen | Energy | D0215 | |
| 1,3-Dimethylbarbituric acid | Energy | A46873 | |
| 1H NMR and HSQC | Bruker | AVANCE-III 400 | |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate | Energy | E020543 | |
| 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | Energy | A1797 | |
| 2-mercaptopyridine | Energy | Y31130 | |
| 6-Aminocaproic acid | Energy | A010678 | |
| Acetic anhydride | Energy | A01021454 | |
| Acetonitrile | Aldrich | 9758 | |
| Ammonium carbonate | Energy | 12980 | |
| Dichloromethane (DCM) | Energy | W330229 | |
| Digital Heating Cooling Drybath | Thermo Scientific | 88880029 | |
| Diisopropylethylamine (DIPEA) | Energy | W320014 | |
| Dimethyl formamide (DMF) | Energy | B020051 | |
| Dithiothreitol | Energy | A10027 | |
| Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU2020 | LC-MS2020 | |
| Fmoc-Ala-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30101 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30201 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30501 | |
| Fmoc-Gln(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30601 | |
| Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30701 | |
| Fmoc-His(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30902 | |
| Fmoc-Ile-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31001 | |
| Fmoc-Lys(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31201 | |
| Fmoc-Met-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31301 | |
| Fmoc-Pro-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31501 | |
| Fmoc-Ser(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31601 | |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31701 | |
| Fmoc-Trp(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31801 | |
| Fmoc-Tyr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31901 | |
| Fmoc-Val-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R32001 | |
| Formic acid | Energy | W810042 | |
| High Performance Liquid Chromatography |
SHIMADZU | LC-2030 | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | |
| Morpholine | Aldrich | M109062 | |
| N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Energy | B010023 | |
| Ninhydrin Reagent | Energy | N7285 | |
| Propargyl bromide | Energy | W320293 | |
| Rink Amide MBHA resin | Nanjing Peptide Biotech Ltd. | ||
| Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates | Thermo Scientific | 60300-403 | |
| Tetrakis(triphenylphosphine) palladium | Energy | T1350 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Triethylamine | Energy | B010737 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J&K | 101398 | |
| Triisopropylsilane (TIS) | Energy | T1533 |
References
- Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
- Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
- White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
- Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
- Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
- Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
- Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
- Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
- Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
- Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
- Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
- Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
- Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
- Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
- Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
- Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
- Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
- Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
- Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
- Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
- Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
- Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
- Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
- Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
- Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
- Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
- Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
- Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
- Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
