口腔顔面オペラント疼痛アッセイを用いたラットにおける神経損傷誘発性機械的過敏症の評価

すべての実験手順は、フロリダ大学施設動物管理および使用委員会によって承認され、実験動物の世話と使用に関する国立衛生研究所ガイドに記載されている基準に準拠していました。ここでは、OPADを用いた機械的過敏症の評価を、神経因性口腔顔面痛のラットモデルを用いて説明する。研究で使用されたタイムラインの概略図を 図1に示します。すべての行動評価は女性実験者によって行われた。 1.動物 雌のSprague-Dawleyラット(n = 8 /グループ、150-200 g)を、温度管理された部屋(22°C±1°C)で12時間:12時間の明暗サイクルでペアで飼育します。食料と水を 自由に提供します。実験前に、ラットを馴化のために施設に5日間保管してください。 オペラント疼痛アッセイを同じ曜日と時間(午前9時から午前11時)に実行します。 実験の終わりに、イソフルラン麻酔後の断頭によってラットを安楽死させる。 2. OPAD のセットアップ ミルクドリップトレイ、プレキシグラスケージ、および金属製のフローリング格子をOPADに置きます。ケージに配線を取り付けます。ボトルホルダーをデバイスの背面にある金属製のポールに滑り込ませます。 報酬溶液として、甘くしたコンデンスミルクの缶を開けて1Lのビーカーに注ぐことにより、水と加糖コンデンスミルクの比率を2:1で準備します。300 mLの牛乳に~600 mLの水道水を加えます。最初にスプーンを使用して溶液を攪拌し、次に攪拌子とホットプレートスターラーを使用します。次に、報酬ボトルにミルク溶液を入れ、ストックミルク溶液を4°Cに保ちます。注意: ストックミルク溶液をプラスチック製のフードラップで覆います。毎回使用する前にミルク溶液を温めてください。冷蔵庫の中のストックミルク溶液は一週間後に凝固することがあります。凝固すると、リックチューブを閉塞する可能性があります。したがって、それを破棄して新しいストック溶液を準備してください。 報酬ミルクボトルをボトルホルダーに置き、動物が注ぎ口に到達できるように調整します。ホルダーの左側のノブを締めて、ボトルを所定の位置に固定します。 フロントパネルのスイッチを使用してケージの電源を入れます。 3. プロトコルの設定と実験ファイルの作成 注: まず、実験を実行するためのプロトコルを設定します。プロトコルは、ANY-mazeソフトウェアが実験を実行する方法を記述します。 ソフトウェアを開きます。パスワードを入力します。[ ログオン ] をクリックするか 、Enter キーを押します。 [ 新しい空のテスト] をクリックします|プロトコル メニュー。このプロトコルが使用する モード を選択し、プロトコルに名前を付けます。 [装置] で [ 名前のないプロトコル] をクリックし、[ このプロトコルで使用するモードを選択する ] セクションをクリックし、[ 装置固有のモード] で OPAD メカニカル ケージ モードを選択して [OK] をクリックします。次に、プロトコルに名前を付けます(例:OPADメカニカル)。 OPADケージを追加します。「装置」で、「装置」をクリックします|[プロトコル] ウィンドウの上部にある項目を追加します|新しいOPADケージ|接続されているすべてのOPADケージを追加します。注意: ケージを追加する前に、すべてのケージがオンになっていることを確認してください。 実験テスト ステージを追加します。[テスト] で、[ステージ] をクリックします|最初のステージと名前ステージ(例:ベースライン1日目)。テスト期間として「10 分」と入力します。さらにステージを追加するには、[プロトコル] ウィンドウの上部にある [項目の追加] をクリックします|新しいステージ。注:各段階は、アッセイが実行されるときのセッションを指します。たとえば、10日間のトレーニングの場合、10のステージが必要です。試験時間は、実験計画に基づいて増減することができます。 処理グループを割り当てます。[ 追加情報] で、[ 治療グループ] をクリックします。[ 治療グループの使用] |にチェックを入れます。ユーザーは手動で動物をグループに割り当てます。注意: 参照されているソフトウェア( 材料の表を参照)では、動物をランダムまたは特定の順序で割り当てることもできます。実験はブラインドで実行できます。割り当てられた治療グループを表示するには、[ ブラインドで実験を実行] チェックボックスをオフにします。 動物識別情報(ID)を割り当てます。[プロトコル] メニューをクリックします。[追加情報] で [動物 ID] をクリックし、[自分の ID を使用して動物を参照する] をオンにします。 [テスト] メニューをクリックします。実験のタイトルを入力します。 [ 処理の表示] をクリックして処理に名前を付け、処理名を入力します (例: 処理 1: CCI-ION、処理 2: 偽)。 動物を追加し、処理と動物IDを割り当てるには、[ 動物を表示]をクリックします|動物を追加し、テストする動物の数を入力して、[ OK] をクリックします。動物のリストが表示されるのを待ち、各ラットの動物IDと治療法を追加します。注意: 動物IDの横に表示される ステータスリストは 、研究の開始時に 正常 に設定されます。動物は、ステータスを [廃止済み ] または [削除済み] に変更することで、後でテスト スケジュールから削除できます。 [プロトコル] メニューをクリックしてプロトコルを保存します|[プロトコル] ペインの上部にある [プロトコルの保存] をクリックします。ファイル名とソフトウェア(ANY-maze)パスワードを入力し、[保存]をクリックします。注:保存したプロトコルは、新しい実験に再利用できます。 [ ファイル] をクリックして実験ファイルを保存します|保存し、ソフトウェアパスワードを入力して、[ 保存]をクリックします。 4.トレーニングとベースラインテストセッション 注:行動試験室が同じ動物飼育施設にある場合は、試験の少なくとも15分前にラットを部屋に連れて行ってください。動物施設外の試験室に搬送する場合は、ラットに1時間与えて部屋に順応させます。 ベースライン記録の前に、OPADでラットを2週間(5日/週、10分/日)訓練して、金属のスパイクバーに顔を押し付けてミルク溶液を受け取ります。注:スパイクバーとアッセイを実行するラットの代表的な画像を 図2に示します。 OPAD機器をセットアップします。 フロントパネルのスイッチを使用してケージの電源を入れます。ケージの緑色のライトを探します。これは、ケージをテストする準備ができていることを意味します。 保存した実験ファイルをダブルクリックして開きます。パスワードを入力します。[ ログオン ] をクリックするか 、Enter キーを押します。 [テスト] メニューが表示されるのを待ちます。画面の左側で、動物の数と対応するケージ(たとえば、動物1はケージ1でテストされます)、その日に実行されるステージ、およびテストステータス(「準備完了」)をメモします。画面の右側で、なめと接触の数を示す各動物のチャートを観察します。 テストする動物のIDを表示するケージの画面を観察します。各ラットを対応するケージに入れ、ケージのボタンを2回押します。テストが開始されると緑色のライトがオレンジ色のライトに変わり、テストセッションが終了すると警告音が鳴ることに注意してください。 トレーニングの最初の2日間は、牛乳瓶を完全にケージに入れて、ラットが刺激に接触せずに牛乳を飲むことができるようにします。 トレーニングの3〜8日目に、動物が飲み始めたら、ボトルを徐々に後方に動かして、ラットがスパイクバーに顔を押すように促します。 トレーニングの9〜10日目に、動物がスパイクバーを完全に押し、舐めの数が一定になったら(500分間のテストセッション中に最低10回舐めます)、各動物の牛乳瓶の位置をメモし、この距離をベースライン記録に使用します。 2週間のトレーニングの後、ベースラインとして5日間(10分/日)、記載された牛乳瓶の距離からデータを収集します。 5.口腔顔面神経障害性疼痛の誘導と機械的過敏症の評価 注:ベースライン測定に続いて、ラットは、前述のように、IONの両側結紮を伴うCCI-ION手術を受けました20。対照ラットは偽手術を受けた。術前または術後の鎮痛は、神経障害の時間経過を変える可能性があるため、手順では使用されませんでした。注意: 廃イソフルランは、チャコールキャニスターを通して清掃する必要があります。.メスの刃と針はバイオハザード廃棄物として廃棄する必要があります。 O2 (1 L / min)と4%イソフルランの混合物で誘導チャンバー内のラットを麻酔し、手術期間中、特殊なノーズコーンで麻酔状態を維持します。 麻酔をかけたラットを手術用の作業台に置き、拘束します。加熱パッドを使用して体温を37°Cに維持します。眼科用軟膏を目に塗り、乾燥を防ぎます。つま先をつまんで麻酔の深さを確認し、つま先の離脱反射が観察されなくなったら手順を開始します。 実体顕微鏡下で外科的処置を行う。開創器を使用して口を開き、小さなクリップを使用して唇を引っ込めます。 メスの刃(#15)を使用して背側歯茎と唇の間に小さな切開を行います。メスの刃の先端を使用して軟組織をそっと切り取り、IONの枝を明らかにします。 鈍く曲がった注射針を使用して、IONの周りに2つのクロミックガット(#5-0)結紮糸を配置します。 組織接着剤を使用して傷を閉じます。 偽の手術では、同じ手順を使用してIONを露出させますが、神経を結紮しないでください。 手術後、ミルクで柔らかくしたげっ歯類の固形飼料を2日間提供して、食事を促し、脱水症状を防ぎます。 手術の翌日にOPADでラットを3日間連続してテストし、次に3日/週(たとえば、毎週火曜日、木曜日、金曜日)を、なめ数がベースライン値に達するまで次の数週間テストします。注:CCI-ION誘発の機械的感受性の持続時間は、性別、使用するげっ歯類のひずみ、および実験者のパフォーマンスに依存する可能性があります。したがって、動物をテストするための特定の期間を示すことは正確ではないかもしれません。したがって、リック数がベースライン値に達するまでテストする方が正確です。 6.デバイスのクリーンアップ テストが終了したら、右上隅にあるxアイコンをクリックしてソフトウェアを終了し、データが自動的に保存されるのを待ちます。 フロントパネルのスイッチを使用してケージの電源を切ります。 金属製の床格子からワイヤーを外します。ミルクドリップトレイ、プレキシグラスケージ、金属製の床格子、ボトルホルダーを食器用洗剤で取り外して洗います。すべてを物干しラックに置きます。 金属製のスパイクバー、テストデバイス、およびラボベンチを70%イソプロピルアルコールで拭きます。注意: 機器の取り扱いには注意が必要です。牛乳瓶や舐めチューブを掃除するときは、柔らかいブラシを使用してください。汚れた機器はバクテリアの蓄積につながる可能性があります。 7.データ分析 実験ファイルをダブルクリックして開きます。 [結果] メニューをクリックします。表示するメジャー(つまり、なめる、接触する)またはテスト日を選択します。 [結果] パネルの上部にある [テキストまたはグラフ] または [統計] をクリックして、テキスト、グラフ、または統計分析レポートを表示します。 生データを表示するには、[ データ ] メニューをクリックします。[データ] パネルの上部にある [保存] をクリックしてデータをスプレッドシートとして 保存 するか、[ 送信 ] をクリックして電子メールで受信します。 表示する変数を変更または追加するには、[ データの選択] をクリックし、メジャーを選択して、[ スプレッドシートの表示] をクリックします。 統計解析ソフトウェアからリックとコンタクトの数と最初のリックまでの待ち時間を自動的に導き出し、ソフトウェアからスプレッドシートにデータをエクスポートします。 舐めの数を接触の数21,22,23で割ることにより、過敏症の指標としてL / F比を計算します。注:この研究では、偽グループのラットの1人は、手術前の舐め数が少ない(<500舐め)ため、研究から除外されました。 L/Fの差の統計的有意性、舐めと接触の数、および最初の舐めまでの待ち時間を、双方向反復測定ANOVAとそれに続くDunnettの多重比較またはŠídákの多重比較検定(必要に応じて)によって分析します。注:P < 0.05は統計的に有意であると考えられた。データは、平均の標準誤差(SEM)±平均値として提示した。