Valutazione dell'ipersensibilità meccanica indotta da lesioni nervose nei ratti utilizzando un saggio del dolore operante orofacciale
Summary
Questo protocollo descrive la valutazione dell’ipersensibilità meccanica in un modello di ratto di dolore orofacciale neuropatico utilizzando un dispositivo di valutazione del dolore orofacciale basato su operante.
Abstract
Il dolore ha componenti sensoriali e affettive. A differenza dei tradizionali test del dolore basati sul riflesso, i test del dolore operante possono produrre risultati clinicamente più rilevanti affrontando gli aspetti cognitivi e motivazionali del dolore nei roditori. Questo articolo presenta un protocollo per la valutazione dell’ipersensibilità meccanica a seguito di lesioni croniche da costrizione dei nervi infraorbitali (CCI-ION) nei ratti che utilizzano un sistema di dolore operante orofacciale. Prima della chirurgia CCI-ION, i ratti sono stati addestrati in un dispositivo di valutazione del dolore orofacciale (OPAD) a bere latte condensato zuccherato mentre entravano in contatto facciale con le barre chiodate metalliche e il tubo da leccare.
In questo test, i ratti possono scegliere tra ricevere latte come rinforzo positivo o sfuggire a uno stimolo meccanico avversivo prodotto da una fila verticale di piccole punte a forma di piramide su ciascun lato del foro di accesso alla ricompensa. Dopo 2 settimane di allenamento nell’OPAD e prima dell’intervento chirurgico CCI-ION, i dati di sensibilità meccanica al basale sono stati registrati per 5 giorni per ciascun ratto durante una sessione di test di 10 minuti. Durante una sessione, il sistema operativo registra automaticamente il numero di attivazioni della bottiglia di ricompensa (leccate) e i contatti facciali, la durata del contatto e la latenza alla prima leccata, tra le altre misure.
Dopo le misurazioni di base, i ratti sono stati sottoposti a CCI-ION o a interventi chirurgici fittizi. In questo protocollo, l’ipersensibilità meccanica è stata quantificata misurando il numero di leccate, la latenza alla prima leccata, il numero di contatti e il rapporto tra leccate e contatti facciali (L / F). I dati hanno mostrato che CCI-ION ha comportato una significativa diminuzione del numero di leccate e del rapporto L / F e un aumento della latenza al primo lick, indicando ipersensibilità meccanica. Questi dati supportano l’uso di saggi del dolore basati su operanti per valutare la sensibilità meccanica al dolore nella ricerca preclinica sul dolore.
Introduction
Il dolore cronico colpisce milioni di americani ogni anno1. Sfortunatamente, il dolore cronico è difficile da trattare, poiché le terapie esistenti sono relativamente inefficaci nel mitigare il dolore cronico e spesso hanno effetti collaterali indesiderati con l’uso a lungo termine 2,3,4. I tradizionali test preclinici del dolore, come il test di von Frey, si basano su esiti riflessivi o risposte stimolate dal dolore5. Mentre il saggio di von Frey è stato utilizzato per decenni per misurare l’allodinia meccanica, è suscettibile a diversi fattori confondenti, in particolare il bias dello sperimentatore6. L’uso del test di von Frey per valutare il dolore orofacciale è anche problematico a causa del grado di contenzione necessario per assicurare la testa dell’animale per testare con successo l’area del viso, che può produrre effetti indesiderati sullo stress, come aumentare il dolore o, al contrario, l’analgesia indotta dallo stress.
I comportamenti stimolati dal dolore sono anche suscettibili di risultati falsi positivi7 e non tengono conto della componente affettiva del dolore, che è parte integrante dell’esperienza del dolore umano8. Pertanto, vi è un crescente interesse nell’utilizzo di modelli di dolore operante che valutano i comportamenti depressi dal dolore che comprendono sia le componenti sensoriali che affettive del dolore per migliorare il contenuto e la validità predittiva nei test preclinici. Il test operante di valutazione del dolore orofacciale qui descritto si basa su un paradigma di ricompensa-conflitto 9,10,11. In questo test, il roditore può scegliere tra ricevere un rinforzo positivo e sottoporsi a uno stimolo nocicettivo o rinunciare alla ricompensa ed evitare lo stimolo nocicettivo, controllando così la quantità di dolore che prova. A differenza dei tradizionali test del dolore, il test basato sull’operante è indipendente dallo sperimentatore e non è suscettibile di risultati falsi positivi a causa di effetti sedativi spiacevoli.
Le sensazioni nocive dalla testa e dal viso sono trasportate dai rami oftalmici, mascellari e mandibolari del nervo trigemino. La lesione o l’infiammazione del nervo trigemino aumenta la sensibilità dei neuroni sensoriali agli stimoli termici o meccanici12,13,14,15. I saggi del dolore orofacciale basati su operanti forniscono una misurazione automatizzata del dolore orofacciale termico o meccanico trasmesso dal nervo trigemino nei roditori 11,12,16,17,18. La stimolazione con stimoli non nocivi e nocivi è un’importante distinzione tra testare l’allodinia termica e meccanica e l’iperalgesia nella regione orofacciale con l’OPAD, in quanto possono rappresentare manifestazioni di diversi meccanismi sottostanti.
Nel test termico orofacciale, gli animali premono il viso contro i termodi lisci per accedere alla ricompensa. I termodi possono essere impostati su varie temperature fredde, calde e calde, consentendo così la valutazione del comportamento in condizioni neutre o nocicettive. Nel saggio meccanico orofacciale, gli animali premono la faccia contro barre chiodate durante i test operanti; Poiché queste punte causano un certo livello di disagio, i roditori potrebbero bere meno quando i loro volti toccano le punte rispetto alle superfici lisce dei termodi. Pertanto, il saggio meccanico orofacciale operante può valutare l’effetto di vari gradi di stimolazione nocicettiva meccanica. Abbiamo precedentemente dimostrato che l’OPAD è un metodo utile e affidabile per valutare la temperatura acuta9, così come la meccanica acuta19, la nocicezione e l’iperalgesia.
Questo documento riporta l’uso di una versione di nuova concezione dell’OPAD per valutare la nocicezione meccanica e l’ipersensibilità. Inoltre, a titolo di convalida, dimostriamo la capacità di CCI-ION di indurre neuropatia cronica che si traduce in una risposta prevedibile nell’OPAD. Inoltre, è dettagliato come utilizzare l’OPAD e il software associato per ottenere e analizzare rapidamente i dati comportamentali dei roditori.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il dolore innescato da innocua stimolazione meccanica del viso e della mucosa intraorale è una caratteristica importante delle condizioni di dolore orofacciale, tra cui nevralgia del trigemino e disturbi dell’articolazione temporo-mandibolare24,25. Sebbene il dolore neuropatico del trigemino sia clinicamente ben descritto, la valutazione dei comportamenti nocicettivi neuropatici nei roditori è impegnativa. I saggi del dolore che misurano i comportamenti riflessivi sono i metodi più frequentemente utilizzati nella ricerca preclinica sul dolore. Tuttavia, lo stress correlato all’apparato di test, l’incapacità di valutare lo stato affettivo e il pregiudizio dello sperimentatore sollevano preoccupazioni riguardo all’utilità e alla validità dei saggi riflessi26.
Questo studio introduce la valutazione della sensibilità meccanica nella regione orofacciale dei ratti, dimostrando la sua sensibilità a CCI-ION utilizzando un test del dolore basato su operante. Lo stesso sistema operante può essere utilizzato anche per testare la sensibilità meccanica dei topi. Va notato che i ceppi di topo e ratto possono mostrare variazioni nella loro risposta a CCI-ION e, quindi, i livelli di ipersensibilità meccanica possono differire. Sulla base della nostra esperienza, i ratti Sprague-Dawley sviluppano tipicamente un’ipersensibilità meccanica stabile 2 settimane dopo CCI-ION, iniziano a recuperare 4 settimane dopo CCI-ION e, dopo 6 settimane di CCI-ION, vediamo il recupero dall’intervento chirurgico.
In questo protocollo, l’ipersensibilità meccanica è stata quantificata misurando il numero di leccate e i contatti, L / F e la latenza al primo lick. I dati hanno dimostrato che CCI-ION ha provocato diminuzioni di L / F e del numero di risposte di leccamento e aumenti della latenza alla prima risposta di leccata, indicando che gli animali non erano disposti a premere i loro volti contro le barre chiodate a causa della maggiore sensibilità al dolore orofacciale.
OPAD è un test di ricompensa-conflitto in cui gli animali devono sopportare stimoli nocicettivi per accedere a una ricompensa appetibile. Il comportamento di leccare nel test potrebbe essere influenzato dal comportamento appetitivo. Inoltre, in questo studio, abbiamo usato ratti che avevano peli facciali. Sulla base di precedenti esperienze con i saggi del dolore operante, tra i roditori, i ceppi glabri sono migliori per rilevare i contatti facciali16; Tuttavia, al momento della pubblicazione, i ceppi di ratti glabri non erano più disponibili in commercio. Questo può essere considerato un limite dello studio. Poiché abbiamo utilizzato solo ratti Sprague-Dawley femmina, dovrebbero essere previste differenze legate al sesso e allo sforzo nelle risposte al dolore.
Ci sono anche alcuni passaggi critici per garantire risultati ottimali con il test. I dati accurati di lick e contatto devono apparire rispettivamente come blocchi rossi e bianchi solidi nel software di riferimento (vedere la Figura 3). La distanza tra le punte e la bottiglia di latte è cruciale per il successo dell’esperimento. Se la punta della bottiglia del latte è troppo in avanti, l’animale non entrerà in contatto con le punte e il software non registrerà correttamente i contatti o leccherà i numeri. Al contrario, se la bottiglia del latte è troppo indietro, i contatti si registreranno, ma l’animale non sarà in grado di raggiungere il latte. Durante le sessioni di allenamento, i dati di lick potrebbero apparire come blocchi bianchi solidi, poiché la punta della bottiglia del latte è troppo in avanti. Si trasforma in blocchi solidi rossi una volta che la bottiglia di latte viene spinta all’indietro. Per qualche ragione, se i dati di lick iniziano ad apparire come blocchi bianchi dalla distanza che è stata notata, spingere leggermente la bottiglia e spostare leggermente il supporto del latte verso il basso / verso l’alto potrebbe aiutare.
Diversi punti potrebbero anche essere considerati come limitazioni del sistema di dolore operante orofacciale qui descritto. La formazione dei roditori è necessaria e richiede settimane. Prima di ogni sessione di test, la restrizione alimentare è necessaria nei topi ma non nei ratti. I topi non a digiuno hanno dimostrato di avere numeri di leccate bassi e incoerenti rispetto ai topi a digiuno27. Poiché il sistema OPAD è un modello di ricompensa-conflitto, potrebbe essere influenzato dal comportamento appetitivo degli animali o da un farmaco che influenza l’appetito. Avere più apparecchiature è anche vantaggioso per ridurre il tempo complessivo per testare gli animali, il che potrebbe aumentare i costi. Tuttavia, i test del dolore operante orofacciale sono ancora vantaggiosi rispetto ai test convenzionali basati sui riflessi, in quanto consentono di testare più animali contemporaneamente e limitano l’interazione animale-sperimentatore.
Il condizionamento operante durante gli stati di dolore modifica il comportamento umano e animale in base alle loro conseguenze28. L’utilizzo di un modello di ricompensa-conflitto è, quindi, vantaggioso per valutare le condizioni di dolore perché consente agli animali di eseguire risposte operative. Questo è clinicamente più rilevante perché le caratteristiche dei comportamenti operanti coinvolgono l’intenzione, la motivazione e, tipicamente, l’elaborazione corticale29. Poiché gli animali si avvicinano volontariamente alla bottiglia della ricompensa e possono ritirarsi liberamente dalle barre chiodate in qualsiasi momento, questo integra i centri superiori del cervello e consente la valutazione degli stati affettivo-motivazionali correlati al dolore10. Pertanto, i saggi del dolore operante forniscono dati superiori nella valutazione del dolore e degli analgesici in vivo. Aiutano anche a comprendere i processi nocicettivi nel sistema trigemino, contribuendo così all’avanzamento del campo del dolore orofacciale.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è finanziato dalla Facial Pain Research Foundation.
Materials
| ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting | 60000 | |
| Bottle cleaning brushes | ANY | ANY | Different size brushes for bottles and tubes |
| Chromic gut suture size 5-0 | Ethicon | 687-G | |
| Dish soap | ANY | ANY | Liquid |
| Dish sponge | ANY | ANY | |
| GraphPad Prism version 9.3.1 | GraphPad Software, San Diego, CA | ||
| Hotplate magnetic stirrer | Benchmark Scientific | H4000-HS | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Pivetal |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | 60-001-56 | |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment | |
| Operant Pain Assessment Device (OPAD) System | Stoelting | 67500 | |
| Oxygen tank | Medical | ||
| Paper towel | ANY | ANY | |
| Plastic food wrap | ANY | ANY | |
| Polygon stir bars | Fisher Scientific | 14-512-124 | |
| Reusable glass Berzelius beakers (1 L) | Fisher Scientific | FB1021000 | |
| Scalpel blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Small animal anesthesia system | VetFlo | VetFlo-1205S | |
| Spoon | ANY | ANY | |
| Sprague-Dawley rats, female | Charles River Laboratories, USA | ||
| Stereo boom microscope | Omano | OM2300S-GX4 | |
| Sweetened condensed milk | Borden | Eagle Brand | |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| Water circulating heating pad and pump | Gaymar | Model TP-500 |
References
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