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Avaliação da hipersensibilidade mecânica induzida por lesão nervosa em ratos usando um ensaio de dor operante orofacial

Published: July 26, 2022
doi:
10.3791/64221
, , , , , ,
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery,University of Florida, Gainesville, 2Department of Orthodontics,University of Florida, Gainesville, 3Stoelting Co. Wood Dale

Summary

Este protocolo descreve a avaliação da hipersensibilidade mecânica em um modelo de rato de dor orofacial neuropática usando um dispositivo de avaliação da dor orofacial baseado em operação.

Abstract

A dor tem componentes sensoriais e afetivos. Ao contrário dos ensaios de dor tradicionais baseados em reflexos, os ensaios de dor operante podem produzir resultados clinicamente mais relevantes, abordando os aspectos cognitivos e motivacionais da dor em roedores. Este trabalho apresenta um protocolo para avaliação da hipersensibilidade mecânica após lesão crônica por constrição dos nervos infraorbitários (CCI-ION) em ratos utilizando um sistema de dor operante orofacial. Antes da cirurgia CCI-ION, os ratos foram treinados em um dispositivo de avaliação da dor orofacial (OPAD) para beber leite condensado adoçado enquanto faziam contato facial com as barras de metal cravadas e o tubo de lambida.

Neste ensaio, os ratos podem escolher entre receber leite como um reforçador positivo ou escapar de um estímulo mecânico aversivo que é produzido por uma fileira vertical de pequenos picos em forma de pirâmide em cada lado do orifício de acesso à recompensa. Após 2 semanas de treinamento na OPAD e antes da cirurgia CCI-ION, os dados de sensibilidade mecânica basal foram registrados por 5 dias para cada rato durante uma sessão de teste de 10 minutos. Durante uma sessão, o sistema operante registra automaticamente o número de ativações da garrafa de recompensa (lambidas) e contatos faciais, duração do contato e latência para a primeira lambida, entre outras medidas.

Após as medidas basais, os ratos foram submetidos a CCI-ION ou cirurgia simulada. Nesse protocolo, a hipersensibilidade mecânica foi quantificada medindo-se o número de lambidas, a latência à primeira lambida, o número de contatos e a razão entre lambeduras e contatos faciais (L/F). Os dados mostraram que o CCI-ION resultou em uma diminuição significativa no número de lambidas e na relação L/F e um aumento na latência à primeira lambida, indicando hipersensibilidade mecânica. Esses dados apoiam o uso de ensaios de dor baseados em operação para avaliar a sensibilidade mecânica à dor em pesquisas pré-clínicas sobre dor.

Introduction

A dor crônica afeta milhões de americanos anualmente1. Infelizmente, a dor crônica é difícil de tratar, pois as terapias existentes são relativamente ineficazes na mitigação da dor crônica e muitas vezes têm efeitos colaterais indesejados com o uso a longo prazo 2,3,4. Os ensaios pré-clínicos tradicionais de dor, como o ensaio de von Frey, baseiam-se em resultados reflexivos ou respostas estimuladas pela dor5. Embora o ensaio de von Frey tenha sido usado por décadas para medir a alodinia mecânica, ele é suscetível a vários fatores de confusão, notadamente o viés do experimentador6. O uso do teste de von Frey para avaliar a dor orofacial também é problemático devido ao grau de contenção necessário para proteger a cabeça do animal para testar com sucesso a área facial, o que pode produzir efeitos de estresse indesejados, como aumentar a dor ou, inversamente, a analgesia induzida pelo estresse.

Comportamentos estimulados pela dor também são suscetíveis a resultados falso-positivos7 e não explicam o componente afetivo da dor, que é parte integrante da experiência de dor humana8. Portanto, há um interesse crescente no uso de modelos de dor operante que avaliam comportamentos deprimidos pela dor que abrangem os componentes sensoriais e afetivos da dor para melhorar o conteúdo e a validade preditiva em testes pré-clínicos. O ensaio de avaliação da dor orofacial operante aqui descrito baseia-se em um paradigma de recompensa-conflito 9,10,11. Neste ensaio, o roedor pode escolher entre receber um reforçador positivo e submeter-se a um estímulo nociceptivo ou renunciar à recompensa e evitar o estímulo nociceptivo, controlando assim a quantidade de dor que experimenta. Ao contrário dos ensaios de dor tradicionais, o ensaio baseado em operação é independente do experimentador e não é suscetível a resultados falso-positivos devido a efeitos sedativos indesejáveis.

Sensações nocivas da cabeça e da face são transportadas pelos ramos oftálmico, maxilar e mandibular do nervo trigêmeo. A lesão ou inflamação do nervo trigêmeo aumenta a sensibilidade dos neurônios sensoriais a estímulos térmicos ou mecânicos12,13,14,15. Os ensaios de dor orofacial baseados em operantes fornecem uma medida automatizada da dor orofacial térmica ou mecânica transmitida pelo nervo trigêmeo em roedores 11,12,16,17,18. A estimulação com estímulos não nocivos e nocivos é uma distinção importante entre testar alodinia térmica e mecânica e hiperalgesia na região orofacial com a DAOP, pois podem representar manifestações de diferentes mecanismos subjacentes.

No ensaio térmico orofacial, os animais pressionam o rosto contra termodes lisos para acessar a recompensa. Os termodos podem ser ajustados para várias temperaturas frias, quentes e quentes, permitindo assim a avaliação do comportamento sob condições neutras ou nociceptivas. No ensaio mecânico orofacial, os animais pressionam o rosto contra barras cravadas durante o teste operante; como esses picos causam algum nível de desconforto, os roedores podem beber menos quando seus rostos tocam os picos em comparação com as superfícies lisas dos termodes. Assim, o ensaio mecânico orofacial operante pode avaliar o efeito de diferentes graus de estimulação nociceptiva mecânica. Demonstramos anteriormente que a DAOP é um método útil e confiável para avaliar a termização aguda9, bem como a mecânica aguda19, a nocicepção e a hiperalgesia.

Este artigo relata o uso de uma versão recém-desenvolvida do OPAD para avaliar a nocicepção mecânica e a hipersensibilidade. Além disso, por meio de validação, demonstramos a capacidade do CCI-ION de induzir neuropatia crônica que resulta em uma resposta previsível na OPAD. Também detalhado é como usar o OPAD e seu software associado para obter e analisar rapidamente dados comportamentais de roedores.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Flórida e cumpriram os padrões estabelecidos no National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Aqui, a avaliação da hipersensibilidade mecânica usando o OPAD é descrita usando um modelo de rato de dor orofacial neuropática. Um esquema da linha do tempo utilizada no estudo é mostrado na Figura 1. Todas as avaliações comportamentais foram realizadas por experimentadoras do sexo feminino. 1. Animais Ratas Sprague-Dawley domésticas (n = 8/grupo, 150-200 g) em pares em uma sala com temperatura controlada (22 °C ± 1 °C) com um ciclo claro-escuro de 12 h:12 h. Fornecer comida e água ad libitum. Mantenha os ratos na instalação por 5 dias para aclimatação antes dos experimentos. Realizar os ensaios de dor operante no mesmo dia da semana e horário (9h-11h). No final dos experimentos, eutanasiar os ratos por decapitação após anestesia com isoflurano. 2. Criação do OPAD Coloque bandejas de gotejamento de leite, gaiolas de plexiglas e grades de piso de metal no OPAD. Anexe a fiação às gaiolas. Coloque o suporte da garrafa no poste de metal na parte de trás do dispositivo. Prepare uma proporção de 2:1 de água para leite condensado adoçado como solução de recompensa, abrindo uma lata de leite condensado adoçado e despejando-a em um copo de 1 L. Adicione ~600 mL de água da torneira a 300 mL de leite. Inicialmente mexa a solução usando uma colher e, em seguida, use uma barra de agitação e o agitador de placa quente. Em seguida, encha os frascos de recompensa com a solução de leite e mantenha a solução de leite em estoque a 4 °C.NOTA: Cubra a solução de leite em pó com um invólucro alimentar de plástico. Aqueça a solução de leite antes de cada utilização. A solução de leite de estoque na geladeira pode coagular após uma semana. Quando coagula, pode ocluir o tubo de lambida. Portanto, descarte-o e prepare uma nova solução de estoque. Coloque as garrafas de leite de recompensa no porta-garrafas e ajuste-as para que o bico possa ser alcançado pelo animal. Aperte o botão esquerdo do suporte para fixar o frasco no lugar. Ligue as gaiolas usando o interruptor no painel frontal. 3. Configurando um protocolo e criando um arquivo de experimento Observação : primeiro, configure o protocolo para executar o experimento. O protocolo descreve como o software ANY-maze executa o experimento. Abra o software. Digite a senha. Clique em Log me on ou pressione Enter. Clique em Nova | de experimento vazia Menu Protocolo .Selecione o modo que este protocolo usará e nomeie o protocolo. Em Aparelho, clique em Protocolo sem nome, clique na seção selecione o modo que este protocolo usará e, em Modos específicos do equipamento, selecione Modo de gaiola mecânica OPAD e clique em OK. Em seguida, nomeie o protocolo (por exemplo, mecânico OPAD). Adicione gaiolas OPAD.Em Aparelho, clique em Aparelho | Adicionar item encontrado na parte superior do painel Protocolo | Nova gaiola OPAD | Adicione todas as gaiolas OPAD conectadas.NOTA: Antes de adicionar as gaiolas, certifique-se de que todas as gaiolas estão ligadas. Adicione estágios de teste de experimento.Em Teste, clique em Estágios | Primeiro estágio e nome Estágio (por exemplo, Dia de Linha de Base 1). Digite 10 min para a duração do teste. Para adicionar mais estágios, clique em Adicionar item encontrado na parte superior do painel Protocolo | Nova Etapa.NOTA: Cada etapa refere-se à sessão em que um ensaio é executado. Por exemplo, para 10 dias de treinamento, são necessárias 10 etapas. A duração do teste pode ser aumentada ou diminuída com base no delineamento experimental. Atribua grupos de tratamento.Em Informações Adicionais, clique em Grupos de tratamento. Verificar Utilizar grupos de tratamento | O usuário atribuirá manualmente os animais aos seus grupos.NOTA: O software referenciado (consulte a Tabela de Materiais) também permite que os animais sejam atribuídos aleatoriamente ou em uma ordem específica. Os experimentos podem ser executados às cegas. Para ver os grupos de tratamento atribuídos, desmarque Executar experimentos às cegas. Atribuir identificações de animais (ID).Clique no menu Protocolo ; em Informações Adicionais, clique em Animal ID e marque Usar minhas IDs para se referir a animais. Clique no menu Experimentar .Digite um título de experimento. Nomeie os tratamentos clicando em Exibir tratamentos e digite os nomes dos tratamentos (por exemplo, Tratamento 1: CCI-ION, Tratamento 2: simulado). Adicione animais e atribua tratamentos e identificações de animais clicando em Exibir animais | Adicione animais, insira o número de animais que serão testados e clique em OK. Aguarde até que a lista de animais apareça e adicione identificações e tratamentos para cada rato.NOTA: Uma lista de status que aparece ao lado de ID do animal será definida como Normal no início do estudo. Os animais podem ser removidos posteriormente do cronograma de testes, alterando seu status para Aposentado ou Excluído. Salve o protocolo clicando no menu Protocolo | Salvar protocolo encontrado na parte superior do painel Protocolo . Digite o nome do arquivo e a senha do software (ANY-maze) e clique em Salvar.NOTA: Os protocolos salvos podem ser reutilizados para novos experimentos. Salve o arquivo de experimento clicando em Arquivo | Salve, digite a senha do software e clique em Salvar. 4. Sessões de treinamento e teste de linha de base NOTA: Traga ratos para a sala pelo menos 15 minutos antes do teste se a sala de testes comportamentais estiver na mesma instalação de alojamento de animais. Se eles forem transportados para uma sala de testes fora da instalação animal, dê aos ratos 1 h para se aclimatarem à sala. Antes dos registros basais, treine os ratos nas OPADs por 2 semanas (5 dias / semana, 10 minutos / dia) para pressionar seus rostos contra as barras de metal cravadas para receber a solução de leite.NOTA: Uma imagem representativa de barras cravadas e um rato executando o ensaio é mostrada na Figura 2. Configure o equipamento OPAD. Ligue as gaiolas usando o interruptor no painel frontal. Procure a luz verde na gaiola, o que significa que a gaiola está pronta para testar. Clique duas vezes no arquivo de experimento salvo para abrir. Digite a senha. Clique em Log me on ou pressione Enter. Aguarde até que o menu Testes apareça. No lado esquerdo da tela, anote o número de animais e a gaiola correspondente (por exemplo, o animal 1 será testado na gaiola 1), o estágio que será executado naquele dia e o status do teste (“pronto”). No lado direito da tela, observe o gráfico de cada animal que mostra o número de lambidas e contatos. Observe a tela das gaiolas que exibe o ID do animal a ser testado. Coloque cada rato na gaiola correspondente e pressione o botão na gaiola duas vezes. Observe que a luz verde se transformará em uma luz laranja assim que o teste for iniciado, e um som de aviso será ouvido quando a sessão de teste terminar. Durante os primeiros 2 dias de treinamento, coloque garrafas de leite completamente na gaiola para permitir que os ratos bebam leite sem entrar em contato com o estímulo. Nos dias 3-8 de treinamento, uma vez que os animais comecem a beber, mova as garrafas progressivamente para trás para incentivar os ratos a pressionar seus rostos contra as barras cravadas. Nos dias 9-10 de treinamento, uma vez que os animais pressionam totalmente contra as barras cravadas e os números de lambida são consistentes (um mínimo de 500 lambidas durante as sessões de teste de 10 minutos), observe a localização da garrafa de leite para cada animal e use essa distância para gravações de linha de base. Após 2 semanas de treinamento, colete dados da distância da garrafa de leite observada por 5 dias como linha de base (10 min/dia). 5. Indução da dor neuropática orofacial e avaliação da hipersensibilidade mecânica NOTA: Após as medidas basais, os ratos foram submetidos à cirurgia de CCI-ION, que envolveu ligadura bilateral do ION, conforme descrito anteriormente20. Ratos de controle tiveram cirurgia simulada. Nenhuma analgesia pré ou pós-operatória foi utilizada no procedimento, pois pode alterar o curso temporal da neuropatia. CUIDADO: Os resíduos de isoflurano devem ser eliminados através de recipientes de carvão. As lâminas e agulhas do bisturi devem ser eliminadas nos resíduos de risco biológico. Anestesiar o rato na câmara de indução com uma mistura de O2 (1 L/min) e isoflurano a 4% e manter o estado anestésico com um cone nasal especializado durante a duração da cirurgia. Coloque o rato anestesiado em uma bancada cirúrgica e contenha-o. Mantenha a temperatura do corpo a 37 °C usando uma almofada de aquecimento. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar que eles sequem. Verifique a profundidade anestésica apertando o dedo do pé e inicie o procedimento quando o reflexo de retirada do dedo do pé não for mais observado. Realize o procedimento cirúrgico sob um microscópio estéreo. Abra a boca usando afastadores e retraia o lábio usando um pequeno clipe. Faça uma pequena incisão entre a gengiva dorsal e o lábio usando uma lâmina de bisturi (# 15). Corte suavemente o tecido mole usando a ponta da lâmina do bisturi para revelar um ramo do ION. Coloque duas ligaduras de intestino crômico (#5-0) ao redor do ION usando uma agulha de seringa contundente e dobrada. Feche a ferida usando adesivo de tecido. Para a cirurgia simulada, exponha o ION usando o mesmo procedimento, mas não ligue o nervo. Após a cirurgia, forneça ração de roedores amolecida com leite por 2 dias para incentivar a alimentação e prevenir a desidratação. Teste os ratos na DAOP no dia seguinte à cirurgia por 3 dias consecutivos e, em seguida, 3 dias / semana (por exemplo, todas as terças, quintas e sextas-feiras) nas semanas seguintes até que os números de lambida atinjam seus valores basais.NOTA: A duração da sensibilidade mecânica induzida por CCI-ION pode depender do sexo, da tensão do roedor utilizado e do desempenho do experimentador. Assim, pode não ser preciso indicar uma certa duração para testar animais. Assim, o teste até que os números de lambida atinjam os valores basais é mais preciso. 6. Limpeza do dispositivo Quando o teste estiver concluído, saia do software clicando no ícone x no canto superior direito e aguarde que os dados sejam salvos automaticamente. Desligue as gaiolas usando o interruptor no painel frontal. Desconecte os fios das grades de piso de metal. Retire e lave as bandejas de gotejamento de leite, as gaiolas de plexiglas, as grades de piso de metal e os porta-garrafas com sabão de prato. Coloque tudo no rack de secagem. Limpe as barras com espinhos de metal, o dispositivo de teste e as bancadas de laboratório usando álcool isopropílico a 70%.NOTA: Os instrumentos precisam ser manuseados com cuidado. Use escovas macias enquanto limpa as garrafas de leite e lambe os tubos. Equipamentos sujos podem levar ao acúmulo de bactérias. 7. Análise dos dados Clique duas vezes no arquivo de experimento para abri-lo. Clique no menu Resultados . Selecione quais medidas (ou seja, lamber, entrar em contato) ou dias de teste para ver. Clique em Texto ou Gráfico ou Estatística encontrado na parte superior do painel Resultados para ver um relatório, gráfico ou de análise estatística. Para ver os dados brutos, clique no menu Dados . Clique em Salvar na parte superior do painel Dados para salvar os dados como uma planilha ou clique em Enviar para recebê-los por email. Para alterar ou adicionar mais variáveis para ver, clique em Selecionar dados, selecione as medidas e clique em Exibir planilha. Análise estatísticaDerive automaticamente o número de licks e contatos e a latência para a primeira lambida do software e exporte os dados do software para uma planilha. Calcular a relação L/F como índice de hipersensibilidade dividindo o número de lambidas pelo número de contatos21,22,23.NOTA: Neste estudo, um dos ratos do grupo sham foi excluído do estudo devido ao baixo número de lambeduras (<500 lambidas) antes da cirurgia. Analisar a significância estatística das diferenças entre L/F, o número de lambidas e os contatos, e a latência para a primeira lambida através de ANOVA de medidas repetidas bidirecionais seguidas pelas comparações múltiplas de Dunnett ou testes de comparações múltiplas de Šídák, quando apropriado.NOTA: P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (EPM).

Representative Results

Um exemplo de lambidas de um único rato no frasco de recompensa e contatos com as barras de metal cravadas no início do estudo e 2 semanas, 4 semanas e 6 semanas após a cirurgia é apresentado na Figura 3. Durante os períodos não nocivos, os ratos geralmente têm longas sessões de beber (por exemplo, no início do estudo e recuperação após o CCI-ION: semana 6 na imagem) e, após o CCI-ION, os números de lambida diminuem, pois não conseguem manter contato facial com as barras cravadas por um longo período (Figura 3A), sem mudanças significativas nos períodos de consumo no grupo sham (Figura 3B). Ratos com CCI-ION tiveram uma diminuição significativa no número de lambidas até 4 semanas após a cirurgia e um aumento na latência para a primeira lambida na semana da cirurgia (semana 0) e 1 semana após a cirurgia em comparação com a linha de base. Não houve alteração significativa no grupo simulado (Figura 4A,B). O CCI-ION produziu uma diminuição no número de contatos, mas essa diferença não foi significativa (Figura 4C). O CCI-ION também causou uma diminuição significativa no L/F, e a diminuição para o grupo CCI-ION foi maior do que a diminuição para o grupo sham (Figura 4D). Esses resultados indicam que, após o CCI-ION, os ratos apresentam menos comportamento de recompensa ao beber leite, e demoram um pouco para fazer a primeira lambida, indicando um comportamento nocifensivo. No entanto, o CCI-ION não afeta seu desejo de alcançar o leite. Além disso, a diminuição da L/F de ratos com CCI-ION indica hipersensibilidade mecânica, pois a L/F é maior durante condições não dolorosas. Figura 1: Representação esquemática do desenho do estudo. Abreviaturas: OPAD = dispositivo de avaliação da dor orofacial; CCI-ION = lesão crônica por constrição dos nervos infraorbitais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Imagem representativa de barras cravadas e de um rato realizando o ensaio. As barras cravadas são feitas de metal inoxidável. O comprimento de toda a barra é de 7 cm. A altura dos espigões é de 0,3 cm. A distância entre os espigões é de 0,5 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Tentativas de contato representativas e dados de lambida de um único rato operado por CCI-ION e sham durante a sessão de teste padrão de 10 minutos no início do estudo e 2 semanas, 4 semanas e 6 semanas após a cirurgia. Abreviaturas: CCI-ION = lesão crônica por constrição dos nervos infraorbitais; AS = após a cirurgia. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Desenvolvimento de hipersensibilidade mecânica após CCI-ION em ratos Sprague-Dawley. (A) Ratos com CCI-ION (n = 8) tiveram uma diminuição significativa no número de lambeduras até 4 semanas após a cirurgia e (B) um aumento na latência para a primeira lambida na semana da cirurgia (semana 0) e 1 semana após a cirurgia (**p < 0,01, *p < 0,05: semanas após a cirurgia vs. linha de base. #p 0,05). (C) CCI-ION ou cirurgia simulada não produziu nenhuma mudança significativa no número de contatos. (D) Ratos com CCI-ION apresentaram uma diminuição significativa da L/F na semana da cirurgia e 3 semanas após a cirurgia e exibiram uma tendência decrescente 2 semanas após a cirurgia. Em comparação com os ratos do grupo simulado, essa diminuição foi significativamente maior em ratos CCI-ION e começou 1 semana após a cirurgia e continuou até 3 semanas após a cirurgia. Não houve diferença significativa no grupo sham (**p < 0,01, *p < 0,05: semanas após a cirurgia vs. linha de base. # p < 0,05: CCI-ION vs. sham). Nos gráficos, a linha vermelha representa o grupo CCI-ION e a linha azul representa o grupo sham. Os dados são apresentados como média ± EPM. As diferenças significativas foram analisadas por ANOVA de medidas repetidas bidirecionais seguida dos testes de comparação múltipla de Šídák ou Dunnett, conforme apropriado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A dor desencadeada pela estimulação mecânica inócua da face e da mucosa intraoral é uma característica proeminente das condições de dor orofacial, incluindo neuralgia do trigêmeo e distúrbios da articulação temporomandibular24,25. Embora a dor neuropática do trigêmeo seja clinicamente bem descrita, a avaliação dos comportamentos nociceptivos neuropáticos em roedores é um desafio. Ensaios de dor que medem comportamentos reflexivos são os métodos mais utilizados na pesquisa pré-clínica da dor. No entanto, o estresse relacionado ao aparelho de teste, a incapacidade de avaliar o estado afetivo e o viés do experimentador levantam preocupações quanto à utilidade e validade dos ensaios reflexos26.

Este estudo introduz a avaliação da sensibilidade mecânica na região orofacial de ratos, demonstrando sua sensibilidade ao CCI-ION por meio de um ensaio de dor baseado em operação. O mesmo sistema operante também pode ser usado para testar a sensibilidade mecânica de camundongos. Deve-se notar que as cepas de camundongos e ratos podem apresentar variação em sua resposta ao CCI-ION e, portanto, os níveis de hipersensibilidade mecânica podem diferir. Com base em nossa experiência, os ratos Sprague-Dawley geralmente desenvolvem uma hipersensibilidade mecânica estável 2 semanas após o CCI-ION, eles começam a se recuperar 4 semanas após o CCI-ION e, após 6 semanas de CCI-ION, vemos a recuperação da cirurgia.

Nesse protocolo, a hipersensibilidade mecânica foi quantificada medindo-se o número de lambidas e os contatos, L/F e latência à primeira lambida. Os dados demonstraram que o CCI-ION resultou em diminuição da L/F e do número de respostas de lambida e aumento da latência à primeira resposta de lambida, indicando que os animais não estavam dispostos a pressionar o rosto contra barras cravadas devido ao aumento da sensibilidade à dor orofacial.

OPAD é um ensaio de recompensa-conflito no qual os animais devem suportar estímulos nociceptivos para acessar uma recompensa palatável. O comportamento de lamber no ensaio pode ser afetado pelo comportamento apetitoso. Além disso, neste estudo, foram utilizados ratos que tinham pelos faciais. Com base na experiência prévia com ensaios de dor operante, entre os roedores, as cepas sem pelos são melhores para detectar contatos faciais16; no entanto, no momento da publicação, as cepas de ratos sem pelos não estavam mais disponíveis comercialmente. Isso pode ser considerado uma limitação do estudo. Como também usamos apenas ratas Sprague-Dawley, diferenças relacionadas ao sexo e à cepa nas respostas à dor devem ser antecipadas.

Há também algumas etapas críticas para garantir resultados ótimos com o ensaio. Os dados precisos de lambida e contato devem aparecer como blocos vermelhos e brancos sólidos no software referenciado, respectivamente (consulte a Figura 3). A distância entre os picos e a garrafa de leite é crucial para o sucesso do experimento. Se a ponta da garrafa de leite estiver muito à frente, o animal não fará contato com os picos e o software não registrará corretamente os contatos ou lamberá os números. Por outro lado, se a garrafa de leite estiver muito para trás, os contatos se registrarão, mas o animal não poderá alcançar o leite. Durante as sessões de treinamento, os dados de lambida podem aparecer como blocos brancos sólidos, já que a ponta da garrafa de leite está muito à frente. Ele se transforma em blocos sólidos vermelhos uma vez que a garrafa de leite é empurrada para trás. Por alguma razão, se os dados de lambida começarem a aparecer como blocos brancos da distância que foi observada, empurrar a garrafa um pouco e mover o suporte de leite ligeiramente para baixo / para cima pode ajudar.

Vários pontos também podem ser considerados como limitações do sistema de dor operante orofacial aqui descrito. O treinamento dos roedores é necessário e leva semanas. Antes de cada sessão de teste, a restrição alimentar é necessária em camundongos, mas não em ratos. Camundongos sem jejum demonstraram ter números de lambedura baixos e inconsistentes em comparação com camundongos em jejum27. Como o sistema OPAD é um modelo de recompensa-conflito, ele pode ser afetado pelo comportamento apetitoso dos animais ou por uma droga que afeta o apetite. Ter vários aparelhos também é vantajoso para reduzir o tempo total para testar os animais, o que pode aumentar os custos. No entanto, os ensaios de dor operante orofacial ainda são vantajosos em relação aos ensaios convencionais baseados em reflexos, pois permitem o teste de vários animais ao mesmo tempo e limitam a interação animal-experimentador.

O condicionamento operante durante os estados de dor modifica o comportamento humano e animal de acordo com suas consequências28. O uso de um modelo de recompensa-conflito é, portanto, vantajoso para avaliar as condições de dor, pois permite que os animais realizem respostas operantes. Isso é mais relevante clinicamente porque as características dos comportamentos operante envolvem intenção, motivação e, tipicamente, processamento cortical29. Como os animais se aproximam voluntariamente da garrafa de recompensa e podem se retirar livremente das barras cravadas a qualquer momento, isso integra centros superiores do cérebro e permite a avaliação dos estados afetivo-motivacionais relacionados à dor10. Assim, os ensaios de dor operante fornecem dados superiores ao avaliar a dor e os analgésicos in vivo. Eles também ajudam a entender os processos nociceptivos no sistema trigêmeo, contribuindo assim para o avanço do campo da dor orofacial.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo é financiado pela Facial Pain Research Foundation.

Materials

ANY-maze Video Tracking Software Stoelting 60000
Bottle cleaning brushes ANY ANY Different size brushes for bottles and tubes
Chromic gut suture size 5-0 Ethicon 687-G
Dish soap ANY ANY Liquid
Dish sponge ANY ANY
GraphPad Prism version 9.3.1  GraphPad Software, San Diego, CA
Hotplate magnetic stirrer Benchmark Scientific H4000-HS
Isoflurane Patterson Veterinary 07-893-8440 Pivetal
Isopropyl alcohol Fisher Scientific 60-001-56
Ophthalmic ointment Dechra Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment
Operant Pain Assessment Device (OPAD) System Stoelting 67500
Oxygen tank Medical
Paper towel ANY ANY
Plastic food wrap ANY ANY
Polygon stir bars Fisher Scientific 14-512-124
Reusable glass Berzelius beakers (1 L) Fisher Scientific FB1021000
Scalpel blade #15 FST 10015-00
Small animal anesthesia system VetFlo VetFlo-1205S
Spoon ANY ANY
Sprague-Dawley rats, female Charles River Laboratories,  USA
Stereo boom microscope Omano OM2300S-GX4
Sweetened condensed milk Borden  Eagle Brand
Tissue adhesive 3M Vetbond 1469SB
Water circulating heating pad and pump Gaymar Model TP-500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Donertas-Ayaz, B., Brice-Tutt, A. C., Malphurs, W. L., Montgomery, D., Mills, R. H., Neubert, J. K., Caudle, R. M. Assessment of Nerve Injury-Induced Mechanical Hypersensitivity in Rats Using an Orofacial Operant Pain Assay. J. Vis. Exp. (185), e64221, doi:10.3791/64221 (2022).
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