استجابة لوباء فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة، تم تطوير بروتوكول مختبري لاختبار فعالية التطهير الفيروسي لغسل الماء الساخن لأغطية الوجه القماشية والدعك القطني والسراويل الدنيم. تم استخدام فيروس Phi6 (البكتيريا) ككائن حي لاختبار فعالية التطهير.
ويقدم هذا البروتوكول مثالا على عملية مختبرية لإجراء دراسات غسل الأموال التي تولد بيانات عن التطهير الفيروسي. في حين تم تطوير البروتوكول للبحث خلال جائحة مرض الفيروس التاجي 2019 (COVID-19) ، إلا أنه يهدف إلى أن يكون إطارا قابلا للتكيف مع دراسات تطهير الفيروسات الأخرى. يوضح خطوات تحضير فيروس الاختبار ، وتطعيم مواد الاختبار ، وتقييم التغييرات البصرية والنزاهة في العناصر المغسولة بسبب عملية الغسيل ، وتحديد مقدار الانخفاض في الحمل الفيروسي. بالإضافة إلى ذلك، يحدد البروتوكول عينات مراقبة الجودة اللازمة لضمان عدم تحيز التجارب بسبب التلوث والقياسات / الملاحظات التي ينبغي تسجيلها لتتبع السلامة المادية لعناصر معدات الحماية الشخصية (PPE) بعد دورات غسيل متعددة. تستخدم النتائج التمثيلية المقدمة مع البروتوكول بكتيريا Phi6 الملقحة على مقشر القطن والدنيم ومواد تغطية الوجه القطنية وتشير إلى أن عملية غسل الماء الساخن وتجفيفه حققت أكثر من 3 سجلات (99.9٪) انخفاضا في الحمل الفيروسي لجميع العينات (تخفيض 3 سجلات هو مقياس أداء المطهر في المبدأ التوجيهي لاختبار أداء المنتج التابع لوكالة حماية البيئة الأمريكية 810.2200). كان الانخفاض في الحمل الفيروسي موحدا عبر مواقع مختلفة على عناصر معدات الوقاية الشخصية. يجب أن تساعد نتائج بروتوكول اختبار فعالية التطهير الفيروسي هذا المجتمع العلمي على استكشاف فعالية غسل المنازل لأنواع أخرى من فيروسات الاختبار وإجراءات الغسيل.
تسببت جائحة مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) في اضطراب عالمي غير مسبوق في سلسلة التوريد وأدت إلى نقص حاد في العديد من العناصر ، بما في ذلك معدات الحماية الشخصية الأساسية (PPE) 1،2،3. وكان على أولئك الذين يعملون في مهن عالية الخطورة أن يتكيفوا باستخدام استراتيجيات القدرة على الأزمات الموصى بها، واعتمد الجمهور استخدام مواد غير متخصصة مثل أغطية الوجه المصنوعة من مواد القماش في المقام الأول للتحكم في المصدر، ولكن أيضا لتوفير بعض الحماية التنفسية لمرتديها. في الولايات المتحدة ، تم حجز حماية الجهاز التنفسي المتخصصة (أي تصفية أجهزة التنفس (FFRs) مثل N95s) لبعض هذه المهن عالية الخطورة (مثل الرعاية الصحية) أثناء نقص الإمدادات4. عندما لم يكن يعرف سوى القليل عن انتقال فيروس كورونا 2 (SARS-Cov-2) المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة، اعتبرت مجموعة متنوعة من الأنواع الأخرى من مواد الملابس أيضا بمثابة حماية حاجزة في وقت مبكر من الجائحة5. مع تنوع الأقمشة المستخدمة لحماية مرتديها ، نشأت أسئلة حول استخدام هذه العناصر وإعادة استخدامها وتطهيرها / تطهيرها. وفي حين أنه في الولايات المتحدة كان من المقبول عموما أن الغسيل الروتيني للآلات المنزلية لأغطية الوجه وغيرها من الملابس يجعل الفيروسات على تلك الأسطح غير معدية، إلا أنه لا توجد سوى بيانات قليلة للتحقق من صحة هذا الادعاء، وكان هناك نقص في البروتوكولات المختبرية المنشورة للاختبار. الغرض من بروتوكول البحث المعروض هنا هو تقديم مثال على عملية مختبرية لإجراء دراسات غسل الأموال التي تولد بيانات عن التطهير الفيروسي. في حين تم تطوير البروتوكول للبحث خلال جائحة COVID-19 ، إلا أنه يهدف إلى أن يكون إطارا قابلا للتكيف مع دراسات تطهير الفيروسات الأخرى.
دور الملابس في انتقال الأمراض هو مفهوم يصعب تحديده كميا. حاول المنتدى العلمي الدولي المعني بالنظافة المنزلية هذه المهمة الصعبة من خلال إجراء مراجعة لدور الملابس في انتشار الأمراض المعدية إلى جانب تقييم مخاطر ممارسات النظافة المنزلية6. تضمن هذا العمل مراجعة العديد من الدراسات العلمية التي فحصت بقاء سلالات فيروسية مختلفة على أنواع مختلفة من الأقمشة مثل الصوف والقطن7،8،9،10،11. ركزت كل دراسة على نوع مختلف من الفيروسات بما في ذلك اللقاح وفيروس شلل الأطفال والفيروس المخلوي التنفسي وفيروس الهربس وفيروس الأنفلونزا. تراوحت أوقات بقاء الفيروسات المختلفة على الأقمشة من 30 دقيقة إلى 5 أشهر اعتمادا على مزيج المواد الفيروسية. كما أظهرت العديد من الدراسات نقل التلوث الفيروسي من المادة إلى اليدين. وكجزء من المنشور، نوقش غسل الأموال الفعال بوصفه أسلوبا إداريا هاما للحد من انتقال العدوى، ولكنه أقر بأن حجم أثر غسل الأموال على الحد من عبء المرض يعتمد على الملوثات الفيروسية المحددة ويصعب تحديده كميا7،8،9،10،11.
عملية الغسيل تدمر الكائنات الحية الدقيقة باستخدام عمليات المعالجة الكيميائية والفيزيائية والحرارية. على سبيل المثال ، يمكن للصابون والمنظفات فصل التربة وقد يضفي بعض الإجراءات المضادة للميكروبات بوساطة كيميائية. جسديا ، قد يساعد التخفيف والإثارة في تقليل الأحمال الفيروسية. وجدت دراسة فحصت استمرار فيروس كورونا البشري HCoV-OC43 على حوامل القطن باستخدام دورات الغسيل الصناعية والمنزلية مع وبدون درجة حرارة ومنظفات أنه لا يوجد فيروس يمكن اكتشافه عند الغسيل في ماء غير مدفأ بدون منظفات ، ولكن في وجود حمولة التربة (اللعاب الاصطناعي) ، تتطلب دورات الغسيل المنزلية منظفات للعينات حتى لا تحتوي على أحمال الفيروس غير المكتشفة12. الماء الساخن نفسه يمكن أن يوفر أيضا وسيلة فعالة لتدمير بعض الكائنات الحية الدقيقة13,14.
في منشور صدر مؤخرا يلخص حالة ممارسات الغسيل الحالية ، تم تحديد العديد من العوامل مثل تكوين النسيج ، وظروف التخزين ، وحمل الأوساخ ، ودرجة حرارة الغسيل والوقت ، ودرجة حرارة التجفيف على أنها متفاوتة في الممارسات العالمية لغسل الأموال15. في حين أن غسل الأموال هو طريقة تنظيف شائعة لنسبة كبيرة من السكان ، فإن هذا التباين الكبير في الممارسات الحالية يجعل إصدار إرشادات مفصلة حول كيفية القيام بذلك بأمان وفعالية ، عندما يكون العنصر ملوثا بفيروس ، أمرا صعبا ومتناثرا. خلال جائحة COVID-19 ، أصدرت مراكز الولايات المتحدة لمكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC) إرشادات حول كيفية غسل العناصر لأصحاب المنازل16,17. استند جزء كبير من إرشادات الغسيل هذه إلى العديد من الدراسات القديمة حول التطهير البكتيري 18,19 وبدعم من العديد من الدراسات التي وجدت أن الفيروسات المغلفة معطلة في الماء مع المنظفات20,21. يمكن تلخيص الإرشادات على النحو التالي: 1) اتباع تعليمات الشركة المصنعة للمنظف ، 2) استخدام أحر إعداد مناسب للمياه ، و 3) تجفيف العناصر تماما. كان الأساس المنطقي لهذه التوصيات هو أن الغسيل في أحر دورة ممكنة باستخدام المنظفات جنبا إلى جنب مع التجفيف تماما (مع الحرارة إن أمكن) سيقتل فيروس SARS-CoV-2.
ويتطلب العدد الهائل من الاختلافات المحتملة في عملية غسل الأموال بروتوكولا موحدا، كما هو معروض هنا، للتمكن من عزل المتغيرات واختبار فعالية التطهير الفيروسي لعمليات محددة. الغرض من هذا البروتوكول إلى جانب فيديو تعليمي هو إظهار عملية غسل المياه الساخنة القائمة على المختبر لتكرارها في دراسات بحثية أخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تبني نتائج اختبار فعالية التطهير الفيروسي هذا ثقة المستهلك في فعالية غسل المنازل أثناء الأوبئة الفيروسية.
تم تطوير هذا البروتوكول لتنفيذ اختبارات معملية منهجية لتقييم فعالية غسل التطهير الفيروسي من معدات الوقاية الشخصية / الملابس كاملة الحجم. وتحدد الإجراءات الخطوات الحاسمة لإعداد الفيروس، وتلقيح مواد الاختبار، وتقييم التغييرات التي تطرأ على المواد بسبب عملية الغسيل، وتحديد مقدار الانخفاض في الحمل الفيروسي نتيجة لعملية الغسيل (الغسيل والتجفيف في الغسالة). بالإضافة إلى ذلك، يحدد البروتوكول عينات مراقبة الجودة اللازمة لضمان عدم تحيز التجارب بسبب التلوث والقياسات/الملاحظات التي ينبغي تسجيلها لتتبع السلامة المادية لبنود معدات الوقاية الشخصية بعد دورات غسيل متعددة. تشير النتائج باستخدام Phi6 إلى أن عملية غسل الماء الساخن المستخدمة في هذا البروتوكول حققت انخفاضا أكبر من 3 سجلات في الحمل الفيروسي لجميع العينات (تغطية الوجه ، والدعك ، وسراويل الدنيم). كان تخفيض الحمل الفيروسي موحدا أيضا عبر مواقع مختلفة على معدات الوقاية الشخصية / عناصر الملابس. لإثبات تقليل 3 سجلات ، يتطلب هذا البروتوكول استخدام حمولة فيروسية عالية وعامل استقرار (مستخلص لحم البقر) قد لا يكون ممثلا لحمل التربة لجميع الحالات.
تم اختيار الغسالات الصغيرة والمجففات المدمجة لتحسين عدد التجارب المكررة التي يمكن إجراؤها في بيئة محدودة المساحة والحفاظ على تعقيم المعدات وحجم المياه المستخدمة أثناء التجارب التي يمكن لموظفي المختبر التحكم فيها. نتيجة لاستخدام الغسالة الصغيرة ، كانت خطوات الشطف يدوية مقارنة بمعظم تطبيقات غسيل المنازل المؤتمتة بالكامل. من المهم أيضا أن نتذكر أن غسل الغسالة هو السائد في البلدان المتقدمة ، ولكن غسل اليدين لا يزال يمارس في جميع أنحاء العالم15. بالإضافة إلى ذلك ، قد لا يتمكن البعض من الوصول إلى الماء الساخن للغسيل ، والبعض الآخر يدويا تجفيف الملابس بالهواء بدلا من التجفيف في الماكينة. لم يتم تناول هذه الاختلافات في ممارسات غسل الأموال في هذا البروتوكول الحالي ولكن يمكن التحقيق فيها بسهولة مع تعديلات طفيفة مثل استبدال خطوات الغسيل والتجفيف باستخدام دلو وخط قريب.
كان هناك تركيز ضئيل على تنظيف/تطهير أغطية الوجه الملوثة فيروسيا وملابس الشوارع في الأدبيات العلمية على نطاق واسع. أكثر شيوعا ، تقيم الدراسات أداء الترشيح لأغطية الوجه بعد الغسيل والتجفيف المتكرر ولكنها لا تقيم فعالية التطهير الفيروسي27,28. على سبيل المثال ، قام Clapp et al. بتقييم كفاءة الترشيح المجهزة للأقنعة القماشية وأقنعة الإجراء المعدلة ووجدوا تباينا واسعا في الأداء ، مع تعديلات بسيطة توفر زيادة في الملاءمة وكفاءة الترشيح29. نظرت دراسة أخرى في كفاءة الترشيح لأربعة أقنعة قماشية من مواد مختلفة30 ، مع التركيز مرة أخرى على التحكم في المصدر أو الحماية الشخصية. قد يكون هذا بسبب نقص التخصص لكل من الجزء الميكروبي والاختبارات الميكانيكية في نفس المختبر. يوفر البروتوكول المعروض هنا تقييما لفعالية التطهير وكذلك تدهور المواد.
كان هناك عدد من طرق إزالة التلوث / التطهير لحماية الجهاز التنفسي التي يمكن التخلص منها (في المقام الأول N95s) التي نشرت مؤخرا في الأدبيات العلمية31،32،33. ويرجع التركيز الأساسي على FFRs (على سبيل المثال ، N95s) إلى الحماية التنفسية الحرجة التي توفرها للعاملين في مجال الرعاية الصحية وغيرها من المهن في الخطوط الأمامية. وشملت التكنولوجيات الأولية لإزالة التلوث من أجهزة التنفس التنفس تبخير بيروكسيد الهيدروجين (VHP)، والأشعة فوق البنفسجية المبيدة للجراثيم (UVGI)، والحرارة الرطبة (البخار) لتعطيل الفيروس. وقام فيسكوسي وآخرون بتقييم خمس طرق لإزالة التلوث من أجل FFRs وUVGI؛ تم العثور على أكسيد الإيثيلين و VHP لتكون أكثر طرق إزالة التلوث الواعدة31. قام فيشر وآخرون بتقييم أربع طرق مختلفة لإزالة التلوث – ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، والحرارة الجافة ، والإيثانول بنسبة 70٪ ، و VHP – لقدرتها على تقليل التلوث باستخدام SARS-CoV-2 وتأثيرها على وظيفة جهاز التنفس N9532. هناك العديد من الدراسات الإضافية حول تقنيات إزالة التلوث الفعالة ل FFRs التي تم تلخيصها ونشرها في 202033. ومع ذلك ، لا يمكن الوصول إلى هذه الأساليب المتخصصة أو تصميمها لاستخدامها بأمان من قبل صاحب المنزل العادي أو الأعمال الصغيرة.
تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام Phi6 ، وهي بكتيريا مغلفة تشبه SARS-CoV-2 ، وتحتوي على بروتينات سبايك ، وهي ذات حجم مماثل (80-100 نانومتر)34 ، لجميع الاختبارات. نظرا لأن Phi6 ليس من مسببات الأمراض المعروفة ، فيمكن التلاعب به في مختبر عام للسلامة البيولوجية البيولوجية من المستوى 1 (BSL-1). قد تشير الفعالية ضد Phi6 إلى فعالية الفيروسات الأخرى المغلفة ، ومع ذلك ، فإن التحقق التجريبي لكل فيروس ذي أهمية ضروري35. وباستخدام عامل فيروسي مماثل غير مسبب للأمراض، من المأمول أن يتكرر هذا البروتوكول في مكان آخر وأن يستخدم لدراسة الأوبئة/الجوائح الفيروسية في المستقبل. قد تشمل الأبحاث المستقبلية استخدام المطهرات (مثل المبيضات) بالإضافة إلى المنظفات وبروتوكول موحد لغسل اليدين وتجفيف الخطوط.
The authors have nothing to disclose.
قامت وكالة حماية البيئة الأمريكية (EPA) من خلال مكتبها للبحث والتطوير بتوجيه البحث الموصوف هنا تحت EP-C-15-008 مع شركة Jacobs Technology Inc. وقد استعرضته الوكالة ولكنه لا يعكس بالضرورة آراء الوكالة. ولا ينبغي الاستدلال على أي تأييد رسمي. لا تصادق وكالة حماية البيئة على شراء أو بيع أي منتجات أو خدمات تجارية. يود المؤلفون أن يشكروا مقاولي وكالة حماية البيئة دينيس أسليت على الإشراف على علم الأحياء الدقيقة التابع لوكالة حماية البيئة RTP ، وبراين فورد ، وراشيل بارتمانز ، وليزلي منديز ساندوفال على عملهم في هذا المشروع في مختبر علم الأحياء الدقيقة التابع لوكالة حماية البيئة RTP ، ورامونا شيرمان لتوفير مراجعة ضمان الجودة لوكالة حماية البيئة ، وورث كالفي وشانون سيري لتقديم مراجعات فنية لوكالة حماية البيئة.
Freezer (- 80 °C) | ThermoFisher Scientific | FDE30086FA | |
Hot Plate | VWR | 97042-714 | |
Safety Pins (steel) | Singer | 319921 | |
Shaker | Lab-Line Instruments, Inc. | 3525 | |
SM buffer | Teknova, Hollister, CA | S0249 | |
Syringe filter (0.2 μm) | Corning, Corning, NY | PES syringe filters, 431229 | |
1X Phosphate Buffered Saline | Teknova, Hollister, CA | P0196, 10X PBS solution | |
Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
Autoclavable caps | DWK Life Sciences, Millville, NJ | KIM-KAP Caps, 73663-18 | |
Autoclave | Steris | AMSCO 250LS Steam Sterilizer Model 20VS | |
Beef Extract | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA | P/N B4888-100g | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 793639 | |
Cell spreaders | Busse Hospital Disposables | 23600894 | |
Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004271 | Heraeus MegaFuge 16R Centrifuge |
Certified Timer | https://nist.time.gov/ | Not Applicable | |
Conical tubes (50 mL) | Corning Life Sciences | 352098 | Falcon 50-mL high-clarity polypropylene conical centrifuge tubes |
Cryovials | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AY509X33 | |
Denim | Wrangler | Rustler Regular Fit Straight Leg Jean Four Pocket Jean with Scoop Front Pockets, PN:87619PW | |
Detergent | Proctor and Gamble | Tide Original Scent Liquid Laundry Detergent Product Number (PN): 003700023068 | |
Dextrose | Fisher | BP350 | |
Dey-Engley neutralizing broth | Becton Dickinson | DF0819172 | |
Dryer | Magic Chef | MCSDRY15W | |
Face Coverings | Felina | Reusable Organic Cotton Face Masks, PN: 990121P4 | |
Incubator (top agar) | Symphony | 414004-596 | |
Laboratory Notebook | Scientific Notebook Company | 2001 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
Media sterilization and dispensing system | Integra | Media Clave/Media Jet | |
Petri Dishes (100 mm) | VWR | 25384-342 | |
pH Meter | Orion/Oakton | STARA1110/EW-35634-35 | |
pH Probe | Orion | 8157BNUMD | |
pH Standards | Oakton | 00654-(00/04/08) | |
Phi 6 and Pseudomonas syringae | Battelle Memorial Institute, Columbus, OH | Not Applicable | |
Pipette & Tips | Rainin | (Pipettes) 17014391, 17002921; (Pipette Tips) 30389239, 17014382 | |
Refrigerator | True Manufacturing Co., Inc. | GDM-33 | |
Scrubs | Gogreen cool | PN: WS19100PT | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 57656 | |
Stir Bar | Fisherbrand | 16-800-512 | |
Tape Measure | Lufkin | PS3425 | |
Test Tubes for Soft agar (14 mL) | Corning, Corning, NY | 352059 | |
Thermometer | Fisherbrand | 14-983-19B | |
Tryptone | Sigma-Aldrich | T9410 | |
Vaporous hydrogen peroxide sterilization bags | STERIS | 62020TW | |
Vortex (during the plating process) | Daigger Scientific, Inc | 3030A | Vortex Genie 2 |
Vortex (for sample extraction) | Branson Ultrasonics | 58816-115 | Multi-Tube vortexer |
Washer | Kuppet | KP1040600A | |
Washer Sterilization | Steris | STERIS VHP ED1000 generator | |
Yeast extract | Gibco | 212750 |