Sıcak Su Aklamanın Viral Dezenfeksiyon Etkinliğinin Belirlenmesi

Phi6, bir işbirlikçi laboratuvardan ~ 1 mL dondurulmuş aliquot olarak alındı ve kullanıma kadar -80 ° C’de saklandı. Başlangıçta, daha sonra kullanıma kadar -80 ° C’de depolanan daha fazla virüs stokunu yaymak için kullanıldı. Phi6, gösteri virüsü olarak seçildi, çünkü yaygın olarak model zarflı bir virüs olarak kullanılıyor, yüksek titrelere yayılabiliyor ve22,23,24 testini gerçekleştirmek için düşük biyogüvenlik seviyesinde bir laboratuvar gerektiriyor. 1. Virüs stok çözümü hazırlayın Bakteriyofaj Phi6’yı bakteriyel konakçı Pseudomonas şırıngasında aşağıda açıklandığı gibi modifiye edilmiş bir Triptik Soya Agar media preparasyonu ve yumuşak agar kaplama yöntemi kullanarak çoğaltın.Modifiye Triptik Soya Agar’ı, Tablo 1’deki malzemeleri deiyonize suda tartarak ve karıştırarak hazırlayın. 0,9 ila 1,5 arasında optik yoğunluğa (OD 600) sahip 1 mL’lik bir P. şırıngası aliquot’u, 100 mL modifiye Triptik Soya Suyu (Tablo 1) ekleyerek ve oda sıcaklığında (20-26 ° C) ~ 260 rpm’de çalkalayıcı bir inkübatörde inkübe ederek bir gecelik P. syringae kültürü hazırlayın. Modifiye Triptik Soya Agarını (~ 6 mL) test tüplerine yerleştirerek ve otoklavlanabilir bir kapakla kaplayarak yumuşak agar tüpleri hazırlayın. Kullanana kadar 4 °C’de saklayın. Agar’ı eritmek için 15 dakika boyunca 121 ° C’de otoklav yumuşak agar tüpleri. Kaplamaya kadar 48 °C’de tutun. 48 ° C’de denge önemlidir, aksi takdirde virüs tahlilde inaktive edilebilir. Yumuşak agar’a 1 mL seyreltilmemiş konsantre virüs aliquot ve bir log fazının 100 μL’sini (OD 600 0.9 ila 1.5 arasında) P. şırınga kültürüne ekleyin. Katılaşmış 100 mm çapında modifiye edilmiş bir Triptik Soya agar plakasının yüzeyine yumuşak agar dökün. Kabarcıkları ve / veya dökülmeyi önlemek için, yumuşak agar’ı katı agar yüzeyine eşit olarak dağıtmak ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe etmek için plakaları yavaşça döndürün. Üç plakanın içeriğini25 steril hücre yayıcı ile 15 mL SM tamponu içeren steril 50 mL konik bir tüpe nazikçe kazıyın. Agar’ı parçalamak için 1-2 dakika boyunca maksimum ayarda vorteks tüpleri ve daha sonra 15 dakika boyunca 7.000 x g’de santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve 0,2 μm’lik bir şırınga filtresinden süzün. Kullanana kadar kriyovyallerde 1 mL alikot -80 °C’de saklayın. 2. KKD öğesinin ön test görsel değerlendirmesini yapın Her KKD öğesini temiz, pürüzsüz bir yüzeye yerleştirin (örneğin, tek kullanımlık kağıt astarı ile kaplı bir laboratuvar tezgahı). Her KKD öğesini üçlü olarak değerlendirin. KKD muayenesi sırasında uygun aydınlatmayı sağlayın. Çeşitli yerlerde yıkanmamış öğelerin uzunluğunu ve genişliğini ölçün ve kaydedin (Şekil 1). Şekil 1. KKD ön test değerlendirme ölçüm yerleri. Denim, fırçalama ve yüz kaplama yerleri, yıkama işleminden kaynaklanan malzeme değişikliklerini izlemek için uzunluğun kaydedildiği yerler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 3. Kupon hazırlayın KKD’yi keserek 2 cm x 4 cm test kuponları yapın, yüz örtüsü başına iki kupon hazırlayın (üç yüz kaplaması test edildi), denim pantolon başına beş kupon (üç kot pantolon test edildi) ve fırçalama gömleği başına üç kupon (üç fırçalama test edildi). Aşılanmayacak ancak yıkanacak her malzeme türü için 2 cm x 4 cm prosedürel boş kupon seti (bir tam boyutlu KKD öğesi için bir set) hazırlayın. Yüz örtme deneylerinin her günü için iki kupon, her kot deneyi günü için beş kupon ve fırçalama deneylerinin her günü için üç kupon hazırlayın. Aşılanacak, ancak yıkanmayacak 2 cm x 4 cm pozitif kontrol kuponu seti hazırlayın. Yüz kaplama deneylerinin her günü için iki kupon hazırlayın (üç yüz kaplaması test edildi), her gün denim deneyleri için beş kupon (üç denim pantolon test edildi) ve her gün fırçalama deneyleri için üç kupon (üç fırçalama test edildi) ve üç paslanmaz çelik kupon.NOT: Öğenin boyutuna bağlı olarak farklı sayıda çoğaltma seçilmiştir. Örneğin, yüz kaplamasına beş kupon yapıştırmak fiziksel olarak zordur ve iki kupon kot pantolonun sınırlı bir alanını temsil eder. Konumlar, kapsama alanını en üst düzeye çıkarmak için ve aklama sırasında katlanabilecek ve temizlenmesi daha zor olabilecek bölgelerde seçildi. 4. Aşılama yapın Toplam 10 mL 1x fosfat tamponlu salin hacminde 1 g sığır eti ekstraktını çözerek% 10’luk bir sığır eti özü çözeltisi hazırlayın. Filtre, 0,2 μm’lik bir şırınga filtresi kullanarak tüm hacmi sterilize eder. Bölüm 1’de hazırlanan virüs stok çözeltisini oda sıcaklığında çözün. Kullanım gününde,% 10 sığır eti ekstraktı çözeltisinin 900 μL’sine çözülmüş Phi6 stoğunun 100 μL’sini ekleyin. Test kuponlarını ve pozitif kontrol kuponlarını ~107 PFU/numune ile KKD maddesine 10 μL’lik bir damlacık çözelti pipetleyerek ve pipetin ucunu kullanarak damlacığı yayarak aşılayın. KKD malzemesine bağlı olarak, damlacıklar farklı şekilde ayrılacak ve yeniden toplanacaktır. Aşılanmış kuponların bir biyogüvenlik kabininde kurumasına izin verin. Özel malzemeleriniz için gözlem yoluyla belirlenen kuruma süreleri. Burada sunulan sonuçlar için aşağıdaki süreler kullanılmıştır: ovma = 30 dakika kuruma süresi; yüz örtüsü = 60 dakika kuruma süresi; denim = 30 dakika kuruma süresi; paslanmaz çelik = 120 dakika kuruma süresi. Güvenlik pimleri ve aseptik teknikler kullanarak Şekil 2’ye göre tam boyutlu KKD öğelerine aşılanmış kuponlar ekleyin. Şekil 2. Kupon konumlarını denim, keseler ve yüz kaplamaları üzerinde test edin. A-D harfleri, tüm aklama deneyleri için benzersiz kupon tanımlayıcılarına karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 5. Aklama işlemi gerçekleştirin Aklama deterjanını aşağıdaki gibi hazırlayın.Çamaşır makinesinde kullanılacak musluk suyunu sterilize edin ve sterilite kontrolü için 10 mL otoklavlanmış su toplayın. Bu protokol için, 60 dakikalık bir sıvı döngüsünde 7 L musluk suyunu otoklav edin. Üreticinin seyreltme talimatlarına göre yıkama çözeltisi hazırlayın. Bu protokol için, 1.54 mL deterjanı 3.5 L steril musluk suyunda çözün. Bir sıcak plaka ve karıştırma çubuğu kullanarak yıkama solüsyonunu 50 °C’ye ısıtın. Yıkama çözeltisinin pH ve sıcaklığını ölçün ve kaydedin. Sterilite kontrolü için 10 mL çözelti toplayın. Aklama solüsyonunu sterilize edilmiş bir yıkayıcıya (3.25 L) dökün. Testler arasında 250 ppm-4 saatlik buharlı hidrojen peroksit döngüsü kullanarak yıkayıcıları önceden sterilize edin. KKD ürünlerini sterilize edilmiş bir yıkayıcıya yerleştirin. Yıkayıcı başına bir kot pantolon ve bir ovma gömlek ekleyin. Yıkayıcı başına bir aşılanmış yüz örtüsü ve dört kirlenmemiş dolgu maskesi ekleyin; Maskeleri doldurmak için kupon takılı değildi. KKD öğesini 18 dakika boyunca yıkayın (normal ajitasyonla iki adet 9 dakikalık yıkama döngüsü). Köpüğü çıkarmak için yıkayıcıyı boşaltın ve oda sıcaklığında musluk suyuyla (her seferinde 5 L) üçlü durulayın. Oda sıcaklığında sterilize edilmiş musluk suyunu yıkayıcıya (3,25 L) ekleyin ve 9 dakika uzunluğunda bir durulama döngüsü gerçekleştirin. KKD öğelerini/eşyalarını yıkayıcının sıkma tarafına taşıyın ve 5 dakika boyunca döndürün. KKD ürünlerini kurutucuya taşıyın ve yüksek ısı ayarında (93 °C) 80 dakika kurutun. KKD’yi kurutucudan steril çalışma alanına taşıyın ve kuponları her bir öğeden aseptik olarak çıkarın ve konik tüplere yerleştirin. Tüpleri 10 mL% 10 Dey-Engley et suyu ekstraksiyon tamponu ile önceden doldurun ve alüminyum folyo ile örtün. 6. Kuponlardaki viral yükleri ayıklayın ve numaralandırın Kuponları, ekipmanınızın maksimum ayarında 2 dakika boyunca vorteks yaparak 10 mL% 10 Dey-Engley nötralize et suyunu çıkarın. Geleneksel bir yumuşak üst agar kaplama yöntemi kullanılarak plaka ekstraktları26.Bölüm 1’de açıklandığı gibi yumuşak modifiye Triptik Soya Agar tüpleri ve bir P. şırınga kültürü hazırlayın. Test gününde, agar’ı eritmek için yumuşak agar tüplerini 121 ° C’de 15 dakika boyunca otoklav yapın. Yumuşak agar’ı kaplamaya kadar 48 ° C’de tutun. 48 ° C’de denge önemlidir, aksi takdirde virüs tahlilde termal olarak inaktive edilebilir. Aklama çalışmasında kullanılan her test örneği için 1x fosfat tamponlu salin içinde on kat seyreltme serisi hazırlayın. Kaplama için hem seri olarak seyreltilmiş (100 μL) hem de seyreltilmemiş (1 mL ve 100 μL) alikotlar kullanın. 6 mL yumuşak agar ve log fazı P. şırınga kültürünün 100 μL’sini içeren yumuşak agar tüpüne test numunesi aliquots ekleyin (OD600 0.9-1.5 arasında). Yumuşak agar’ı katılaşmış modifiye edilmiş bir Triptik Soya agar plakasının yüzeyine dökün. Plakayı döndürerek yumuşak agar’ı katı agar yüzeyine eşit olarak dağıtın. Plakaları oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin ve her plakadaki plak oluşturan birimleri sayarak ertesi gün manuel olarak numaralandırın. 7. KKD ürün(ler)inin test sonrası görsel değerlendirmesini yapın Test için kullanılan çeşitli KKD öğelerinde aşağıdakileri belgeleyin: solma, renk değişikliği ve / veya hasar belirtileri (örneğin, yırtılma, gerilme); Koku; küçük delikler, kesikler veya gözyaşları (hasar aramak için küçük bir el feneri kullanın); katmanların ayrılması, eksik iplikler, bağlanmanın zarar gördüğü alanlar; dikişlere veya fermuarlara hasar; elastiğin gerilmesini ölçün ve kaydedin.