温水洗浄のウイルス消毒効果の決定

Phi6は、共同研究者研究室から~1 mLの凍結アリコートとして受け取り、使用するまで-80°Cで保存しました。当初はより多くのウイルスストックを増殖させるために使用され、その後、使用されるまで-80°Cで保存されました。Phi6が実証ウイルスとして選択されたのは、モデルエンベロープウイルスとして一般的に使用され、高力価に増殖することができ、試験を実施するために低いバイオセーフティレベルの実験室を必要とするためです22,23,24。 1.ウイルスストック溶液を準備する 細菌宿主 シュードモナス・シリンガエ 中のバクテリオファージPhi6を、以下に述べるような改変されたトリプシン大豆寒天培地調製物および軟寒天オーバーレイ法を用いて増殖させる。表1の成分を秤量し、イオン交換水中で混合することにより、改質トリプシン大豆寒天培地を調製する。 光学密度(OD600)が0.9〜1.5のP. syringaeのアリコート1 mLを100 mLの修飾トリプシン大豆ブロス(表1)に加え、室温(20-26°C)で~260 rpmで振とうインキュベーター内でインキュベートすることにより、P. syringaeの一晩培養を準備します。 修飾トリプシン大豆寒天培地(~6 mL)を試験管に入れ、オートクレーブ可能なキャップで覆って、柔らかい寒天チューブを準備します。使用するまで4°Cで保存してください。軟寒天チューブを121°Cで15分間オートクレーブし、寒天を溶かした。めっきするまで48°Cで保持する。48°Cでの平衡化が重要であり、そうでなければウイルスはアッセイで不活化される可能性があります。 1 mLの希釈されていない濃縮ウイルスアリコートを軟寒天培地に加え、100 μLの対数相(OD600 0.9〜1.5の間) P.シリンガエ 培養液を加えます。凝固した直径100mmの改質トリプシン大豆寒天プレートの表面に軟寒天を注ぎます。気泡やこぼれを防ぐために、プレートを穏やかに回転させて軟寒天を固体寒天表面に均一に分散させ、室温で一晩インキュベートします。 滅菌セルスプレッダーで3枚のプレートの内容物を25個を、15 mLのSMバッファーを含む滅菌済みの50 mLコニカルチューブに静かにこすり落とします。ボルテックスチューブを最大設定で1〜2分間、寒天を分解し、7,000 x g で15分間遠心分離します。 上清を除去し、0.2μmシリンジフィルターでろ過します。1 mLアリコートをクライオバイアルに入れて、使用するまで-80°Cで保存してください。 2.PPEアイテムのテスト前の視覚的評価を実行します 各PPEアイテムを清潔で滑らかな表面(使い捨ての紙ライナーで覆われた実験台など)に置きます。各PPEアイテムを3回に分けて評価します。 PPE検査中は適切な照明を確認してください。さまざまな場所で未洗浄のアイテムの長さと幅を測定して記録します(図1)。 図 1.PPEテスト前の評価測定場所。 洗濯プロセスからの材料の変化を追跡するために長さが記録されたデニム、スクラブ、および顔を覆う場所。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 3.クーポンを準備する PPEをカットして2 cm x 4 cmのテストクーポンを作成し、フェイスカバーごとに2つのクーポン(3つのフェイスカバーがテストされました)、デニムパンツごとに5つのクーポン(3つのデニムパンツがテストされました)、およびスクラブシャツごとに3つのクーポンを準備します(3つのスクラブがテストされました)。 接種しないが洗濯する素材の種類ごとに、2cm×4cmの手続き用ブランククーポンのセット(フルサイズのPPEアイテム1点分のセット)を用意します。顔の覆いの実験は毎日2枚、デニムの実験は毎日5枚、スクラブ実験は毎日3枚用意します。 接種されるが洗濯されない2cm×4cmのポジティブコントロールクーポンのセットを用意します。フェイスカバー実験の毎日に2枚のクーポン(フェイスカバーを3枚テスト)、デニム実験の毎日に5枚(デニムパンツ3枚テスト)、スクラブ実験の毎日に3枚(スクラブを3枚テスト)、ステンレスクーポンを3枚用意する。注: 項目のサイズに基づいて異なる反復数が選択されました。たとえば、フェイスカバーに5枚のクーポンを貼り付けることは物理的に困難であり、2枚のクーポンはデニムパンツの限られた領域を表します。場所は、カバレッジを最大化するために選択され、洗濯中に折りたたまれ、清掃がより困難になる可能性のあるゾーンに配置されました。 4.接種を行う 1xリン酸緩衝生理食塩水の総量10mLに1gの牛肉抽出物を溶解することにより、10%牛肉抽出物溶液を調製する。フィルターは、0.2μmシリンジフィルターを使用して全体を滅菌します。 セクション1で調製したウイルスストック溶液を室温で解凍する。使用当日、10%牛エキス溶液900μLに解凍したPhi6ストック100μLを加えます。 10 μLの溶液滴をPPEアイテムにピペッティングし、ピペットの先端を使用して液滴を広げることにより、テストクーポンとポジティブコントロールクーポンに~107 PFU/サンプルを接種します。PPE材料に応じて、液滴は異なる方法で分離および再凝集します。 接種されたクーポンをバイオセーフティキャビネットで乾燥させます。特定の材料の観察 によって 乾燥時間を決定しました。ここに提示された結果については、次の時間が使用されました:スクラブ= 30分の乾燥時間;フェイスカバー= 60分の乾燥時間。デニム= 30分の乾燥時間。ステンレス鋼= 120分の乾燥時間。 安全ピンと無菌技術を使用して、 図2 に従って接種されたクーポンをフルサイズのPPEアイテムに取り付けます。 図 2.デニム、スクラブ、フェイスカバーのクーポンの場所をテストします。 文字A〜Dは、すべてのロンダリング実験の一意のクーポン識別子に対応します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 5.洗濯を行う 次のように洗濯洗剤を準備します。洗濯機で使用する水道水を滅菌し、オートクレーブ処理した水10mLを採取して無菌チェックを行います。このプロトコルでは、60分の液体サイクルで7 Lの水道水をオートクレーブします。 メーカーの希釈方向に従って洗濯液を調製してください。このプロトコルでは、1.54 mLの洗剤を3.5 Lの滅菌水道水に溶かします。ホットプレートと攪拌子を使用して洗濯液を50°Cに温めます。洗濯液のpHと温度を測定して記録します。無菌チェックのために10 mLの溶液を採取します。 洗濯液を滅菌洗浄機(3.25 L)に注ぎます。テストの間に過酸化水素蒸気を250ppm-4時間サイクル使用してワッシャーを滅菌します。 PPEアイテムを滅菌済みの洗濯機に入れます。ワッシャーごとにデニムパンツとスクラブシャツを1枚追加します。ワッシャーごとに1つの接種されたフェイスカバーと4つの汚染されていないフィルマスクを追加します。フィルマスクにはクーポンが添付されていませんでした。 PPEアイテムを18分間洗浄します(通常の攪拌で9分間の洗浄サイクルを2回行います)。 洗濯機を排水し、室温の水道水(毎回5 L)で三度すすぎ、泡を取り除きます。室温で滅菌した水道水を洗濯機(3.25 L)に加え、9分間のすすぎサイクルを実行します。 PPEアイテムをワッシャーのスピン側に移動し、5分間回転させます。PPEアイテムを乾燥機に移動し、強熱設定(80°C)で93分間乾燥させます。 PPEを乾燥機から滅菌作業スペースに移動し、各アイテムからクーポンを無菌的に取り出して、円錐形のチューブに入れます。チューブに10 mLの10y-Engleyブロス抽出バッファーを事前に充填し、アルミホイルで覆います。 6.クーポンのウイルス量を抽出して列挙します 10 mLの10y-Engley中和ブロスにクーポンを抽出し、機器の最大設定で2分間ボルテックスします。 プレート抽出は、従来のソフトトップ寒天オーバーレイ法26を用いた。セクション1に記載されているように、柔らかい修飾トリプシン大豆寒天培地と P.syringae 培養物のチューブを準備します。試験当日、軟寒天チューブを121°Cで15分間オートクレーブし、寒天を溶かした。軟寒天をめっきするまで48°Cに保持する。48°Cでの平衡化が重要で、そうでなければウイルスはアッセイで熱的に不活化される可能性があります。 洗濯研究で使用した各試験サンプルについて、1xリン酸緩衝生理食塩水で10倍希釈系列を調製します。めっきには、段階希釈(100 μL)と希釈前(1 mLおよび100 μL)の両方のアリコートを使用してください。 6 mLの軟寒天と100 μLの対数 相P.シリンガエ 培養物(OD600 0.9-1.5)を含む軟寒天チューブに試験サンプルアリコートを追加します。固化した変性トリプシン大豆寒天プレートの表面に軟寒天を注ぎます。プレートを旋回させて、軟寒天を固体寒天表面に均一に分配します。 プレートを室温で一晩インキュベートし、翌日、各プレートのプラーク形成単位を数えて手動で列挙します。 7.PPEアイテムのテスト後の視覚的評価を実行します テストに使用されるさまざまなPPEアイテムに次のことを文書化します:退色、変色、および/または損傷の兆候(例:引き裂き、伸び)。悪臭;小さな穴、切り傷、または裂け目(小さな懐中電灯を使用して損傷を探します)。層の分離、糸の欠落、結合が損傷している領域。縫い目やジッパーの損傷;弾性の伸びを測定して記録します。