קביעת יעילות חיטוי ויראלי של הלבנת מים חמים

Phi6 התקבל ממעבדת שיתוף פעולה כאליקוט קפוא של ~ 1 מ”ל ואוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הוא שימש בתחילה להפצת מלאי וירוסים נוספים אשר אוחסנו לאחר מכן ב -80 מעלות צלזיוס עד השימוש. Phi6 נבחר כנגיף ההדגמה מכיוון שהוא משמש בדרך כלל כנגיף מעטפת מודל, ניתן להפיץ אותו לטיטרים גבוהים, ודורש מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית נמוכה כדי לבצע את הבדיקה22,23,24. 1. הכן פתרון מלאי וירוסים להפיץ בקטריופאג’ Phi6 במזרק פסאודומונס מארח חיידקי באמצעות הכנת מדיה טריפטית שונה של Soy Agar ושיטת כיסוי אגר רכה כמתואר להלן.הכינו אגר סויה טריפטי מעובד על ידי שקילה וערבוב המרכיבים מטבלה 1 במים שעברו דה-יוניזציה. הכינו תרבית לילה של מזרק P. על ידי הוספת אליקוט של 1 מ”ל של מזרק P. עם צפיפות אופטית (OD600) בין 0.9 ל-1.5, ל-100 מ”ל של מרק סויה טריפטי שונה (טבלה 1) ודגירה באינקובטור רועד ב~260 סל”ד בטמפרטורת החדר (20-26 מעלות צלזיוס). הכינו צינורות אגר רכים על ידי הנחת אגר סויה טריפטי שונה (~ 6 מ”ל) במבחנות וכיסוי בכובע אוטומטי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש. אוטוקלאב צינורות אגר רכים בטמפרטורה של 121°C למשך 15 דקות להמסת אגר. יש להחזיק בטמפרטורה של 48°C עד לציפוי. שיווי משקל ב-48 מעלות צלזיוס הוא חשוב, אחרת הנגיף עלול להיות מומת בבדיקה. הוסף 1 מ”ל של אליקוט וירוס מרוכז לא מדולל לאגר רך ו-100 μL של שלב לוג (OD600 בין 0.9 ל-1.5) תרבית מזרק P. יוצקים אגר רך על פני השטח של צלחת אגר סויה טריפטית מוצקה בקוטר 100 מ”מ. כדי למנוע בועות ו/או שפיכה, יש לסובב את הלוחות בעדינות כדי לפזר את האגר הרך באופן שווה על פני משטח האגר המוצק ולדגור במשך הלילה בטמפרטורת החדר. מגרדים בעדינות25 מתכולת שלושת הלוחות בעזרת מפזר תאים סטרילי לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ”ל המכיל 15 מ”ל של חיץ SM. צינורות מערבולת בהגדרה מקסימלית למשך 1-2 דקות כדי לפרק אגר ולאחר מכן צנטריפוגה ב 7,000 x גרם במשך 15 דקות. הסר סופרנטנט וסנן דרך מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן 1 מ”ל בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש. 2. בצע הערכה חזותית לפני הבדיקה של פריט PPE הניחו כל פריט PPE על משטח נקי וחלק (למשל, ספסל מעבדה המכוסה בתוחם נייר חד פעמי). הערך כל פריט PPE במשולש. הקפידו על תאורה נאותה במהלך בדיקת ה-PPE. מדדו ותעדו את האורך והרוחב של הפריטים הלא שטופים במקומות שונים (איור 1). איור 1. מיקומי מדידה של הערכת PPE לפני הבדיקה. מקומות ג’ינס, קרצוף וכיסוי פנים שבהם נרשם האורך לצורך מעקב אחר שינויים מהותיים מתהליך הכביסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. 3. הכינו קופונים הכינו תלושי בדיקה בגודל 2 ס”מ על 4 ס”מ על ידי חיתוך PPE, הכינו שני קופונים לכל כיסוי פנים (נבדקו שלושה כיסויי פנים), חמישה קופונים למכנס ג’ינס (נבדקו שלושה מכנסי ג’ינס) ושלושה קופונים לכל חולצת קרצוף (נבדקו שלושה קרצוף). הכינו סט של קופונים ריקים פרוצדורליים בגודל 2 ס”מ על 4 ס”מ (סט לפריט PPE אחד בגודל מלא) לכל סוג חומר שלא יתחסן אך יכובס. הכינו שני קופונים לכל יום של ניסויים בכיסוי פנים, חמישה קופונים לכל יום של ניסויי ג’ינס, ושלושה קופונים לכל יום של ניסויי קרצוף. הכינו סט של קופוני בקרה חיובית בגודל 2 ס”מ על 4 ס”מ שיחוסנו, אך לא יכובסו. הכינו שני קופונים לכל יום של ניסויים בכיסוי פנים (שלושה כיסויי פנים נבדקו), חמישה קופונים לכל יום של ניסויי ג’ינס (שלושה מכנסי ג’ינס נבדקו), ושלושה קופונים לכל יום של ניסויי קרצוף (שלושה סקראבים נבדקו), ושלושה קופונים מפלדת אל-חלד.הערה: מספר שונה של עותקים משוכפלים נבחרו בהתאם לגודל הפריט. לדוגמה, קשה פיזית להדביק חמישה קופונים על כיסוי הפנים, ושני קופונים ייצגו שטח מוגבל של מכנסי הג’ינס. המיקומים נבחרו כדי למקסם את הכיסוי ובאזורים שעלולים להתקפל במהלך הכביסה ולהיות קשים יותר לניקוי. 4. בצע חיסון הכינו תמיסת תמצית בקר 10% על ידי המסת 1 גרם של תמצית בקר בנפח כולל של 10 מ”ל של מי מלח 1x פוספט חצוי. המסנן מעקר את כל אמצעי האחסון באמצעות מסנן מזרק בגודל 0.2 מיקרומטר. להפשיר את תמיסת מלאי הנגיף שהוכנה בסעיף 1 בטמפרטורת החדר. ביום השימוש, יש להוסיף 100 μL של ציר Phi6 המופשר ל-900 μL של תמיסת תמצית בקר 10%. חיסון קופוני בדיקה וקופונים לבקרה חיובית עם ~ 107 PFU / דגימה על ידי צינורית טיפת תמיסה של 10 μL על פריט PPE והפצת הטיפות באמצעות קצה הפיפטה. בהתאם לחומר ה-PPE, הטיפות ייפרדו ויצטברו מחדש באופן שונה. אפשרו לקופונים מחוסנים להתייבש בארון בטיחות ביולוגית. קבעו את זמני הייבוש באמצעות תצפית על החומרים הספציפיים שלכם. עבור התוצאות המוצגות כאן, נעשה שימוש בזמנים הבאים: קרצוף = 30 דקות זמן יבש; כיסוי פנים = 60 דקות זמן יבש; ג’ינס = 30 דקות זמן ייבוש; נירוסטה = 120 דקות זמן ייבוש. הצמידו קופונים מחוסנים לפריטי PPE בגודל מלא לפי איור 2 באמצעות סיכות בטיחות וטכניקות אספטיות. איור 2. בדקו את מיקומי הקופונים על ג’ינס, קרצוף וכיסויי פנים. האותיות A-D תואמות את מזהי הקופון הייחודיים לכל ניסויי הכביסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. 5. בצע כביסה הכינו את חומר הניקוי לכביסה באופן הבא.יש לעקר מי ברז שישמשו במכונת הכביסה ולאסוף 10 מ”ל מים אוטומטיים לבדיקת סטריליות. עבור פרוטוקול זה, autoclave 7 ליטר של מי ברז על מחזור נוזל של 60 דקות. הכינו תמיסת כביסה בהתאם להוראות הדילול של היצרן. עבור פרוטוקול זה, יש להמיס 1.54 מ”ל של חומר ניקוי ב-3.5 ליטר של מי ברז סטריליים. חממו את תמיסת הכביסה ל-50°C באמצעות פלטה חמה וערבבו. מדוד ורשום את ה- pH והטמפרטורה של תמיסת הכביסה. לאסוף 10 מ”ל של פתרון עבור בדיקת סטריליות. יוצקים תמיסת כביסה לתוך מכונת כביסה מעוקרת (3.25 L). יש לעקר מראש מכונות כביסה באמצעות מחזור של 250 ppm-4 שעות של מי חמצן אדים בין הבדיקות. הנח פריטי PPE במכונת כביסה מעוקרת. הוסיפו מכנסי ג’ינס אחד וחולצת קרצוף אחת לכל מכונת כביסה. הוסף כיסוי פנים מחוסן אחד וארבע מסכות מילוי לא מזוהמות לכל מכונת כביסה; למסכות מילוי לא היו מחוברים קופונים. יש לשטוף פריט PPE למשך 18 דקות (שני מחזורי כביסה של 9 דקות עם תסיסה רגילה). מסננים את מכונת הכביסה ושוטפים שלוש עם מי ברז בטמפרטורת החדר (5 ליטר בכל פעם) להסרת קצף. הוסיפו מי ברז מעוקרים בטמפרטורת החדר למכונת הכביסה (3.25 ליטר) ובצעו מחזור שטיפה באורך 9 דקות. הזז את פריטי ה- PPE לצד הסיבוב של מכונת הכביסה וסובב במשך 5 דקות. העבירו את פריטי ה-PPE למייבש וייבשו במשך 80 דקות על הגדרת החום הגבוה (93°C). העבר PPE ממייבש לסביבת עבודה סטרילית והסר באופן אספטי את הקופונים מכל פריט והנח אותם בצינורות חרוטיים. ממלאים מראש את הצינורות ב-10 מ”ל של 10% חיץ מיצוי מרק Dey-Engley ומכסים ברדיד אלומיניום. 6. לחלץ ולמנות מטענים ויראליים על קופונים חלץ קופונים ב-10 מ”ל של מרק מנטרל Dey-Engley 10% על ידי מערבולת למשך 2 דקות בהגדרה המרבית של הציוד שלך. תמציות צלחת בשיטת כיסוי אגר עליונה רכה קונבנציונלית26.הכן צינורות של אגר סויה טריפטי רך שונה ותרבית מזרק P . כמתואר בסעיף 1. ביום הבדיקה, autoclave את צינורות אגר רך ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להמיס את agar. החזיקו את האגר הרך בטמפרטורה של 48°C עד לציפוי. שיווי משקל ב-48 מעלות צלזיוס הוא חשוב, אחרת הנגיף יכול להיות מומת תרמית בבדיקה. הכינו סדרת דילול של פי עשרה במי מלח עם אגירת פוספטים עבור כל דגימת בדיקה ששימשה במחקר הכביסה. יש להשתמש הן באליקוטים מדוללים סדרתיים (100 μL) והן לא מדוללים (1 מ”ל ו-100 μL) לציפוי. הוסף אליקוטים לדוגמה לצינור האגר הרך המכיל 6 מ”ל של אגר רך ו-100 μL של תרבית מזרק P . שלב הלוג (OD600 בין 0.9-1.5). יוצקים את האגר הרך על פני השטח של צלחת אגר סויה טריפטית ממוצקת. פזרו את האגר הרך באופן שווה על פני משטח האגר המוצק על ידי סיבוב הצלחת. דגרו לוחות למשך הלילה בטמפרטורת החדר וספרו ידנית את היום שלמחרת על ידי ספירת היחידות יוצרות הרובד על כל צלחת. 7. בצע הערכה חזותית לאחר הבדיקה של פריטי PPE תעד את הדברים הבאים בפריטי PPE השונים המשמשים לבדיקה: סימני דהייה, שינוי צבע ו/או נזק (לדוגמה, קריעה, מתיחה); ריחות; חורים קטנים, חתכים או קרעים (השתמש בפנס קטן כדי לחפש נזק); הפרדת שכבות, חוטים חסרים, אזורים שבהם הכריכה פגומה; נזק לתפרים או לרוכסן; למדוד ולהקליט את המתיחה של אלסטי.