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Engineering

Determinazione dell'efficacia della disinfezione virale del lavaggio dell'acqua calda

Published: June 21, 2022
doi:
10.3791/64164
, , , , , , , ,
1Office of Research and Development, Center for Environmental Solutions and Emergency Response, Homeland Security and Materials Management Division,U.S. Environmental Protection Agency, 2Jacobs Technology Inc., 3Science Systems and Applications Inc., 4CSS Inc.

Summary

In risposta alla pandemia di sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2), è stato sviluppato un protocollo di laboratorio per testare l’efficacia della disinfezione virale del lavaggio con acqua calda di rivestimenti per il viso in tessuto, scrub di cotone e pantaloni di jeans. Il virus Phi6 (batteriofago) è stato utilizzato come organismo per testare l’efficacia della disinfezione.

Abstract

Questo protocollo fornisce un esempio di un processo di laboratorio per condurre studi di riciclaggio che generano dati sulla disinfezione virale. Mentre il protocollo è stato sviluppato per la ricerca durante la pandemia di coronavirus 2019 (COVID-19), è destinato a essere un quadro, adattabile ad altri studi di disinfezione dei virus; Dimostra le fasi per preparare il virus di prova, inoculare il materiale di prova, valutare i cambiamenti visivi e di integrità degli articoli lavati a causa del processo di lavaggio e quantificare la riduzione della carica virale. Inoltre, il protocollo delinea i campioni di controllo di qualità necessari per garantire che gli esperimenti non siano influenzati dalla contaminazione e dalle misurazioni / osservazioni che dovrebbero essere registrate per monitorare l’integrità materiale degli articoli dei dispositivi di protezione individuale (DPI) dopo più cicli di lavaggio. I risultati rappresentativi presentati con il protocollo utilizzano il batteriofago Phi6 inoculato su materiali di rivestimento del viso di cotone, denim e cotone e indicano che il processo di lavaggio e asciugatura dell’acqua calda ha ottenuto una riduzione di 3 log (99,9%) della carica virale per tutti i campioni (una riduzione di 3 log è la metrica delle prestazioni del disinfettante nella linea guida 810.2200 del test delle prestazioni dei prodotti dell’Agenzia per la protezione ambientale degli Stati Uniti). La riduzione della carica virale è stata uniforme in diverse posizioni sugli articoli DPI. I risultati di questo protocollo di test di efficacia della disinfezione virale dovrebbero aiutare la comunità scientifica a esplorare l’efficacia del lavaggio domestico per altri tipi di virus di prova e procedure di lavaggio.

Introduction

La pandemia di coronavirus del 2019 (COVID-19) ha causato un’interruzione senza precedenti della catena di approvvigionamento globale e ha portato a una grave carenza di molti articoli, compresi i dispositivi di protezione individuale essenziali (DPI)1,2,3. Coloro che svolgevano occupazioni ad alto rischio dovevano adattarsi utilizzando le strategie raccomandate per la capacità di crisi e il pubblico ha adottato l’uso di articoli non specializzati come rivestimenti per il viso in materiale di stoffa principalmente per il controllo della fonte, ma anche per fornire una certa protezione respiratoria per chi li indossa. Negli Stati Uniti, la protezione respiratoria specializzata (cioè i respiratori facciali filtranti (FFR) come gli N95) era riservata ad alcune di queste occupazioni ad alto rischio (ad esempio, l’assistenza sanitaria) durante le carenze di approvvigionamento4. Quando si sapeva poco sulla trasmissione della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-Cov-2), una varietà di altri tipi di materiali di abbigliamento sono stati considerati come protezione barriera all’inizio della pandemia5. Con la diversità dei tessuti utilizzati per la protezione di chi li indossa, sono sorte domande sull’uso, il riutilizzo e la disinfezione / decontaminazione di questi articoli. Mentre negli Stati Uniti era generalmente accettato che il lavaggio di routine delle macchine domestiche di rivestimenti per il viso e altri articoli di abbigliamento rendesse i virus su quelle superfici non infettivi, esistevano pochi dati per convalidare questa affermazione e mancavano protocolli di laboratorio pubblicati per i test. Lo scopo del protocollo di ricerca qui presentato è quello di fornire un esempio di un processo di laboratorio per condurre studi di riciclaggio che generano dati sulla disinfezione virale. Sebbene il protocollo sia stato sviluppato per la ricerca durante la pandemia di COVID-19, è destinato a essere un quadro adattabile ad altri studi sulla disinfezione dei virus.

Il ruolo dell’abbigliamento nella trasmissione delle malattie è un concetto difficile da quantificare. Il Forum scientifico internazionale sull’igiene domestica ha tentato questo impegnativo compito conducendo una revisione del ruolo dell’abbigliamento nella diffusione delle malattie infettive insieme a una valutazione del rischio delle pratiche di igiene domestica6. Incluso in questo lavoro è stata la revisione di diversi studi scientifici che hanno esaminato la sopravvivenza di diversi ceppi virali su diversi tipi di tessuti come lana e cotone 7,8,9,10,11. Ogni studio si è concentrato su un diverso tipo di virus tra cui vaccinia, poliovirus, virus respiratorio sinciziale, herpesvirus e virus dell’influenza. I tempi di sopravvivenza dei diversi virus sui tessuti variavano da 30 minuti a 5 mesi a seconda della combinazione virus-materiale. Molti degli studi hanno anche dimostrato il trasferimento della contaminazione virale dal materiale alle mani. Come parte della pubblicazione, il riciclaggio efficace è stato discusso come un’importante tecnica di gestione per ridurre la trasmissione, ma ha riconosciuto che l’entità dell’impatto del lavaggio sulla riduzione del carico di malattia dipendeva dal contaminante virale specifico e difficile da quantificare 7,8,9,10,11.

Il processo di lavaggio distrugge i microrganismi utilizzando processi di trattamento chimico, fisico e termico. Ad esempio, saponi e detergenti possono separare i terreni e possono conferire un’azione antimicrobica chimicamente mediata. Fisicamente, la diluizione e l’agitazione possono aiutare nella riduzione della carica virale. Uno studio che esamina la persistenza del coronavirus umano HCoV-OC43 su campioni di cotone utilizzando cicli di lavaggio industriali e domestici con e senza temperatura e detergente non ha rilevato alcun virus rilevabile durante il lavaggio in acqua non riscaldata senza detergente, ma che in presenza di un carico di terreno (saliva artificiale), i cicli di lavaggio domestico richiedevano detergente per i campioni per avere carichi di virus non rilevati12. L’acqua calda stessa può anche fornire un mezzo efficace per distruggere alcuni microrganismi13,14.

In una recente pubblicazione che riassume lo stato delle attuali pratiche di lavanderia, molti fattori come la composizione del tessuto, le condizioni di conservazione, il carico di sporco, la temperatura e il tempo di lavaggio e la temperatura di asciugatura sono stati identificati come variabili nelle pratiche globali di lavaggio15. Mentre il lavaggio è un metodo di pulizia comune per una grande percentuale della popolazione, questa grande variazione nelle pratiche esistenti rende l’emissione di linee guida dettagliate su come farlo in modo sicuro ed efficace, quando un articolo può essere contaminato da un virus, impegnativo e scarso. Durante la pandemia di COVID-19, i Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie (CDC) hanno pubblicato linee guida su come riciclare articoli per i proprietari di case16,17. Gran parte di questa guida al lavaggio era basata su diversi studi precedenti sulla disinfezione batterica18,19 e supportata da diversi studi da banco che hanno trovato virus avvolti inattivati in acqua con detergenti20,21. La guida può essere riassunta come 1) seguire le istruzioni del produttore per il detergente, 2) utilizzare l’impostazione dell’acqua appropriata più calda e 3) asciugare completamente gli articoli. La logica di queste raccomandazioni era che il lavaggio sul ciclo più caldo possibile con detersivo combinato con asciugatura completa (con calore se possibile) ucciderà il virus SARS-CoV-2.

L’enorme numero di possibili variazioni nel processo di lavaggio richiede un protocollo uniforme, come quello qui presentato, per essere in grado di isolare le variabili e testare l’efficacia della disinfezione virale di processi specifici. L’intento di questo protocollo, abbinato a un video didattico, è quello di dimostrare un processo di lavaggio dell’acqua calda basato sul laboratorio per la replica in altri studi di ricerca. Inoltre, i risultati di questo test di efficacia della disinfezione virale dovrebbero rafforzare la fiducia dei consumatori nell’efficacia del lavaggio domestico durante le pandemie virali.

Protocol

Phi6 è stato ricevuto da un laboratorio collaboratore come aliquota congelata ~1 mL ed è stato conservato a -80 °C fino all’uso. Inizialmente è stato utilizzato per propagare più stock di virus che sono stati successivamente conservati a -80 ° C fino all’uso. Phi6 è stato selezionato come virus dimostrativo perché è comunemente usato come virus con involucro modello, può essere propagato a titoli elevati e richiede un laboratorio a basso livello di biosicurezza per eseguire i test22,23,24. 1. Preparare la soluzione madre di virus Propagare il batteriofago Phi6 nell’ospite batterico Pseudomonas syringae utilizzando una preparazione modificata di terreni di agar di soia triptica e un metodo di sovrapposizione di agar morbido come descritto di seguito.Preparare l’Agar di soia triptico modificato pesando e mescolando gli ingredienti della Tabella 1 in acqua deionizzata. Preparare una coltura notturna di P. syringae aggiungendo un’aliquota di 1 mL di P. syringae con una densità ottica (OD 600) compresa tra 0,9 e 1,5, a100 mL di brodo di soia triptico modificato (Tabella 1) e incubando in un incubatore agitatore a ~260 rpm a temperatura ambiente (20-26 °C). Preparare provette di agar morbido posizionando Agar di soia triptico modificato (~6 ml) in provette e coprendo con un cappuccio autoclavabile. Conservare a 4 °C fino all’uso. Tubi di agar morbido in autoclave a 121 °C per 15 minuti per fondere l’agar. Tenere a 48 °C fino alla placcatura. L’equilibrio a 48 °C è importante altrimenti il virus può essere inattivato nel test. Aggiungere 1 mL di aliquota virale concentrata non diluita all’agar molle e 100 μL di coltura di P. syringae in fase logaritmica (OD600 tra 0,9 e 1,5). Versare l’agar morbido sulla superficie di una piastra di agar di soia triptica modificata del diametro di 100 mm solidificata. Per evitare bolle e/o fuoriuscite, ruotare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente l’agar morbido sulla superficie solida dell’agar e incubare durante la notte a temperatura ambiente. Raschiare delicatamente 25 il contenuto delle tre piastre con uno spargitore di cellule sterili in un tubo conico sterile da 50 mL contenente15 mL di tampone SM. Vortex tubi alla massima impostazione per 1-2 minuti per rompere l’agar e quindi centrifugare a 7.000 x g per 15 minuti. Rimuovere il surnatante e filtrare attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm. Conservare 1 mL di aliquote in crioviali a -80 °C fino all’uso. 2. Eseguire la valutazione visiva pre-test dell’articolo DPI Posizionare ogni DPI su una superficie pulita e liscia (ad esempio, un banco da laboratorio coperto da un liner di carta usa e getta). Valutare ogni elemento DPI in triplice copia. Garantire una corretta illuminazione durante l’esame dei DPI. Misurare e registrare la lunghezza e la larghezza degli elementi non lavati in varie posizioni (Figura 1). Figura 1. Posizioni di misurazione della valutazione pre-test dei DPI. Denim, scrub e punti di copertura del viso in cui è stata registrata la lunghezza per tenere traccia delle modifiche materiali dal processo di lavaggio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. 3. Prepara i coupon Crea coupon di prova di 2 cm x 4 cm tagliando i DPI, prepara due coupon per copertura del viso (sono stati testati tre rivestimenti per il viso), cinque coupon per pantalone in denim (sono stati testati tre pantaloni in denim) e tre coupon per camicia scrub (sono stati testati tre scrub). Preparare un set di tagliandi procedurali in bianco di 2 cm x 4 cm (un set per un DPI a grandezza naturale) per ogni tipo di materiale che non verrà inoculato ma sarà lavato. Prepara due coupon per ogni giorno di esperimenti di copertura del viso, cinque coupon per ogni giorno di esperimenti sul denim e tre coupon per ogni giorno di esperimenti di scrub. Preparare un set di tagliandi di controllo positivo di 2 cm x 4 cm che verranno inoculati, ma non lavati. Prepara due coupon per ogni giorno di esperimenti di copertura del viso (sono stati testati tre rivestimenti per il viso), cinque coupon per ogni giorno di esperimenti sul denim (sono stati testati tre pantaloni in denim) e tre coupon per ogni giorno di esperimenti di scrub (sono stati testati tre scrub) e tre coupon in acciaio inossidabile.NOTA: sono stati selezionati numeri diversi di repliche in base alle dimensioni dell’elemento. Ad esempio, è fisicamente difficile aderire a cinque coupon sulla copertura del viso e due coupon rappresenterebbero un’area limitata dei pantaloni in denim. Le posizioni sono state selezionate per massimizzare la copertura e in zone che potrebbero essere piegate durante il lavaggio ed essere più difficili da pulire. 4. Eseguire l’inoculazione Preparare una soluzione di estratto di manzo al 10% sciogliendo 1 g di estratto di manzo in un volume totale di 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato 1x. Filtrare l’intero volume utilizzando un filtro a siringa da 0,2 μm. Scongelare la soluzione madre di virus preparata nella sezione 1 a temperatura ambiente. Il giorno dell’uso, aggiungere 100 μL del brodo di Phi6 scongelato a 900 μL della soluzione di estratto di carne bovina al 10%. Inoculare i tagliandi di prova e i tagliandi di controllo positivi con ~ 107 PFU/campione pipettando una goccia di soluzione da 10 μL sul prodotto DPI e diffondendo la goccia utilizzando la punta della pipetta. A seconda del materiale DPI, le goccioline si separeranno e si riaggregeranno in modo diverso. Lasciare asciugare i tagliandi inoculati in un armadietto di biosicurezza. Determinati tempi di asciugatura tramite osservazione per i vostri materiali specifici. Per i risultati qui presentati, sono stati utilizzati i seguenti tempi: scrub = 30 minuti di asciugatura; copertura del viso = 60 minuti di asciugatura; denim = 30 minuti di asciugatura; acciaio inossidabile = 120 minuti di asciugatura. Allegare tagliandi inoculati a DPI di dimensioni standard secondo la Figura 2 utilizzando spille da balia e tecniche asettiche. Figura 2. Prova le posizioni dei coupon su denim, scrub e rivestimenti per il viso. Le lettere A-D corrispondono agli identificatori univoci dei coupon per tutti gli esperimenti di riciclaggio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. 5. Eseguire il riciclaggio Preparare il detergente per il lavaggio come segue.Sterilizzare l’acqua del rubinetto che verrà utilizzata nella lavatrice e raccogliere 10 ml di acqua autoclavata per un controllo di sterilità. Per questo protocollo, autoclavare 7 L di acqua di rubinetto su un ciclo liquido di 60 minuti. Preparare la soluzione di lavaggio secondo le istruzioni di diluizione del produttore. Per questo protocollo, sciogliere 1,54 ml di detergente in 3,5 L di acqua di rubinetto sterile. Riscaldare la soluzione di lavaggio a 50 °C utilizzando una piastra riscaldante e una barra mescolante. Misurare e registrare il pH e la temperatura della soluzione di lavaggio. Raccogliere 10 ml di soluzione per il controllo della sterilità. Versare la soluzione di lavaggio in una lavatrice sterilizzata (3,25 L). Pre-sterilizzare le rondelle utilizzando un ciclo di 250 ppm-4 h di perossido di idrogeno vaporoso tra i test. Mettere gli articoli DPI in una lavatrice sterilizzata. Aggiungi un pantalone in denim e una camicia scrub per ogni rondella. Aggiungere una copertura per il viso inoculata e quattro maschere di riempimento non contaminate per lavatrice; Le maschere di riempimento non avevano tagliandi allegati. Lavare i DPI per 18 minuti (due cicli di lavaggio di 9 minuti con agitazione normale). Scolare la lavatrice e risciacquare tre volte con acqua di rubinetto a temperatura ambiente (5 L ogni volta) per rimuovere la schiuma. Aggiungere acqua di rubinetto sterilizzata a temperatura ambiente nella lavatrice (3,25 L) ed eseguire un ciclo di risciacquo di 9 minuti. Spostare gli elementi DPI nel lato di rotazione della lavatrice e ruotare per 5 minuti. Spostare i DPI nell’asciugatrice e asciugare per 80 minuti con l’impostazione a fuoco elevato (93 °C). Spostare i DPI dall’essiccatore allo spazio di lavoro sterile e rimuovere asetticamente i coupon da ciascun articolo e posizionarli in tubi conici. Pre-riempire i tubi con 10 ml di tampone di estrazione del brodo Dey-Engley al 10% e coprire con un foglio di alluminio. 6. Estrai ed enumera le cariche virali sui coupon Estrarre tagliandi in 10 ml di brodo neutralizzante Dey-Engley al 10% mediante vortice per 2 minuti alla massima impostazione dell’attrezzatura. Estratti di lastre con un metodo convenzionale di sovrapposizione di agar top26.Preparare provette di agar di soia triptica morbida modificata e una coltura di P. syringae come descritto nel paragrafo 1. Il giorno della prova, autoclavare i tubi di agar morbido a 121 °C per 15 minuti per sciogliere l’agar. Tenere l’agar morbido a 48 °C fino alla placcatura. L’equilibrio a 48 °C è importante, altrimenti il virus può essere inattivato termicamente nel test. Preparare una serie di diluizioni di dieci volte in 1x soluzione salina tamponata con fosfato per ciascun campione di prova utilizzato nello studio di lavaggio. Utilizzare aliquote sia diluite in serie (100 μL) che non diluite (1 mL e 100 μL) per la placcatura. Aggiungere aliquote del campione di prova alla provetta di agar morbido contenente 6 ml di agar molle e 100 μL di coltura di p. syringae in fase logaritmica (OD600 tra 0,9-1,5). Versare l’agar morbido sulla superficie di una piastra di agar di soia triptica modificata solidificata. Distribuire uniformemente l’agar morbido sulla superficie solida dell’agar ruotando la piastra. Incubare le piastre durante la notte a temperatura ambiente e enumerarle manualmente il giorno seguente contando le unità che formano la placca su ciascuna piastra. 7. Eseguire la valutazione visiva post-test degli articoli DPI Documentare quanto segue nei vari DPI utilizzati per i test: segni di sbiadimento, scolorimento e/o danni (ad esempio, strappo, stiramento); Odori; piccoli fori, tagli o strappi (utilizzare una piccola torcia per cercare danni); separazione di strati, fili mancanti, aree in cui la legatura è danneggiata; danni alle cuciture o alle cerniere; Misurare e registrare lo stiramento dell’elastico.

Representative Results

Diversi tipi di dati e risultati del controllo di qualità vengono generati dopo il completamento di questo protocollo. I conteggi delle piastre dell’unità formante placca (PFU) insieme al volume del campione estratto consentono il calcolo del numero di PFU per tagliando di prova. La tabella 2 è un esempio di foglio di registrazione dei dati per i risultati seriali di diluizione/placcatura. Utilizzando il fattore di diluizione, il volume del campione e il conteggio delle piastre della Tabella 1, la Tabella 3 mostra i risultati rappresentativi del recupero virale per un test di copertura del viso. Si noti che questi dati includono i tagliandi di prova e i campioni di controllo qualità per l’inoculo, i coupon e l’acqua di lavaggio (con e senza detergente). I campioni procedurali di controllo della qualità del bianco e della sterilità sono importanti per confermare che le soluzioni acquose e i materiali DPI non sono stati contaminati da Phi6. L’indicazione della contaminazione causerebbe calcoli errati dell’efficacia della disinfezione e richiederebbe la ripetizione del test. I campioni di controllo positivi hanno lo scopo di verificare che la soluzione di stock virale non si sia degradata dal punto di vista ambientale / naturale durante gli esperimenti, gonfiando così l’effetto del processo di lavaggio nella riduzione della carica virale. Questi campioni devono rimanere entro 1 PFU log dei controlli dell’inoculo per accettare i risultati del coupon di prova. Una grande riduzione della PFU dei campioni di controllo positivi indica anche che tutte le fasi dell’inoculazione del coupon devono essere attentamente riviste per garantire che l’analista stia eseguendo il protocollo con tecniche di pipettaggio e diffusione appropriate. Questo protocollo fornisce anche informazioni per valutare le modifiche alle proprietà materiali degli articoli di abbigliamento dovute al lavaggio e alle informazioni sul controllo della qualità relative al protocollo (Tabella 4 e Figura 3). Questi dati sono utili per diversi motivi. La registrazione dell’andamento delle misurazioni degli articoli DPI consente di identificare un articolo con un difetto di fabbricazione. Questa identificazione può aiutare a spiegare i dati microbici anomali e contestualizzare la variazione nel comportamento del prodotto. Prendere nota di odori o danni può anche fornire un’indicazione se la lavatrice o l’asciugatrice ha funzionato in modo non ottimale durante un esperimento e se i test devono essere ripetuti o l’apparecchiatura sottoposta a manutenzione. Inoltre, se il piano di test richiede più cicli di lavaggio dello stesso DPI, i dati possono aiutare a determinare per quanto tempo gli articoli DPI mantengono la loro integrità per l’uso durante il lavaggio. Tenere un registro del pH della soluzione detergente fornisce un avviso di cambiamenti nella fonte d’acqua o nel prodotto detergente. Il mantenimento di un registro temporale delle fasi di lavaggio garantisce che il timer sulla lavatrice e asciugatrice non causi variazioni al protocollo sperimentale. In definitiva, questi dati vengono utilizzati per segnalare l’efficacia della disinfezione della procedura di lavaggio dell’acqua calda contro un surrogato per agenti patogeni virali. L’efficacia della disinfezione di lavaggio (Eqn. 1) è calcolata sottraendo il registro medio 10 recuperi di virus dal coupon del test DPI dal registro medio10 recuperi di virus dai risultati positivi del controllo DPI (Figura 4). Per i risultati del coupon di prova non rilevati, nel calcolo dell’efficacia della disinfezione viene utilizzato il registro10 del limite di rilevamento. È comune riportare l’efficacia della disinfezione come valori di registro per il confronto con altre tecniche e standard di disinfezione virale. Efficacia della disinfezione = log medio 10 (controlli positivi) – log medio10 (tagliandi di prova) (Eqn. 1) Figura 3. Modifica delle dimensioni dei DPI in base alla posizione. Δ = Misurazione pre-test – misurazione post-prova. Un valore Δ negativo corrisponde allo stiramento dell’articolo nella posizione specificata e un valore positivo corrisponde al restringimento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4. Efficacia del lavaggio con acqua calda nella disinfezione di rivestimenti per il viso, denim e materiali DPI scrub di Phi6. Le stelle indicano che si è verificata una disinfezione completa (non rileva sui tagliandi di prova). Le barre di errore indicano la deviazione standard (n = 3). Le lettere di posizione corrispondono al posizionamento illustrato nella Figura 2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Tabella 1. Ricette di soluzione. Ingredienti e quantità necessarie per preparare l’agar di soia triptico, il brodo di soia triptico e le soluzioni di estratto di manzo. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 2. Parte di esempio di un foglio dei risultati di diluizione/placcatura seriale. Modello per la segnalazione di dati microbici grezzi. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 3. Risultati microbici per la copertura del viso. Esempio di foglio di riepilogo per i dati elaborati dell’unità formante placca (PFU). Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 4. Controllo qualità scrub e registro di valutazione dei materiali. Modello per la segnalazione della taratura della sonda di pH, del pH della soluzione detergente, delle misurazioni pre e post-lavaggio e dei tempi di ciclo di lavaggio. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Questo protocollo è stato sviluppato per eseguire test di laboratorio sistematici per valutare l’efficacia del lavaggio della disinfezione virale da DPI / capi di abbigliamento di dimensioni standard. Le procedure delineano le fasi critiche per la preparazione del virus, l’inoculazione del materiale di prova, la valutazione delle modifiche agli articoli dovute al processo di lavaggio e la quantificazione della riduzione della carica virale a seguito del processo di lavaggio (lavaggio e asciugatura in lavatrice). Inoltre, il protocollo delinea i campioni di controllo di qualità necessari per garantire che gli esperimenti non siano influenzati dalla contaminazione e dalle misurazioni / osservazioni che dovrebbero essere registrate per monitorare l’integrità materiale degli articoli DPI dopo più cicli di lavaggio. I risultati utilizzando Phi6 indicano che il processo di lavaggio dell’acqua calda utilizzato in questo protocollo ha ottenuto una riduzione superiore a 3 log della carica virale per tutti i campioni (copertura per il viso, scrub e pantaloni in denim). La riduzione della carica virale è stata uniforme anche in diverse posizioni sui DPI / capi di abbigliamento. Per dimostrare la riduzione di 3 log, questo protocollo richiede l’uso di un’elevata carica virale e di un agente stabilizzante (estratto di carne bovina) che potrebbe non essere rappresentativo del carico del suolo per tutte le situazioni.

Sono state selezionate mini lavatrici e asciugatrici compatte per ottimizzare il numero di esperimenti replicati che potrebbero essere condotti in un ambiente con vincoli di spazio e per mantenere la sterilizzazione delle apparecchiature e il volume d’acqua utilizzati durante gli esperimenti gestibili per il personale di laboratorio. Come risultato dell’utilizzo della mini lavatrice, le fasi di risciacquo erano manuali rispetto alla maggior parte delle applicazioni di lavaggio domestico completamente automatizzate. È anche importante ricordare che il lavaggio in lavatrice predomina nei paesi sviluppati, ma il lavaggio delle mani è ancora praticato in tutto il mondo15. Inoltre, alcuni potrebbero non avere accesso all’acqua calda per il lavaggio e altri asciugano manualmente i vestiti all’aria piuttosto che asciugare in lavatrice. Queste differenze nelle pratiche di lavaggio non sono state affrontate in questo protocollo attuale, ma potrebbero essere facilmente indagate con piccole modifiche, come la sostituzione delle fasi di lavaggio e asciugatura con l’utilizzo di un secchio e di una linea ravvicinata.

C’è stata un’attenzione minima sulla pulizia / disinfezione dei rivestimenti per il viso e dell’abbigliamento da strada contaminati viralmente nella letteratura scientifica su vasta scala. Più comunemente, gli studi valutano le prestazioni di filtrazione dei rivestimenti per il viso dopo ripetuti lavaggi e asciugature, ma non valutano l’efficacia della disinfezione virale27,28. Ad esempio, Clapp et al. hanno valutato l’efficienza di filtrazione adattata delle maschere di stoffa e delle maschere di procedura modificate e hanno riscontrato un’ampia variazione nelle prestazioni, con semplici modifiche che forniscono una maggiore efficienza di adattamento e filtrazione29. Un altro studio ha esaminato l’efficienza di filtrazione di quattro maschere di stoffa di materiali diversi30, concentrandosi ancora una volta sul controllo della sorgente o sulla protezione personale. Ciò può essere dovuto a una mancanza di specializzazione sia per la porzione microbica che per i test meccanici nello stesso laboratorio. Il protocollo qui presentato fornisce una valutazione dell’efficacia della disinfezione e della degradazione del materiale.

Ci sono stati una serie di metodi di decontaminazione / disinfezione per la protezione respiratoria monouso (principalmente N95s) recentemente pubblicati nella letteratura scientifica31,32,33. L’attenzione principale sulle FFR (ad esempio, N95) è dovuta alla protezione respiratoria critica che forniscono agli operatori sanitari e ad altre occupazioni in prima linea. Le tecnologie primarie per la decontaminazione dei respiratori hanno coinvolto il perossido di idrogeno vaporizzato (VHP), la radiazione germicida ultravioletta (UVGI) e il calore umido (vapore) per l’inattivazione del virus. Viscusi et al. hanno valutato cinque metodi di decontaminazione per FFR e UVGI; L’ossido di etilene e il VHP sono risultati essere i metodi di decontaminazione più promettenti31. Fischer et al. hanno valutato quattro diversi metodi di decontaminazione – luce UV, calore secco, etanolo al 70% e VHP – per la loro capacità di ridurre la contaminazione con SARS-CoV-2 e il loro effetto sulla funzione del respiratore N9532. Esistono molti studi aggiuntivi sulle tecnologie di decontaminazione efficaci per le FFR che sono stati riassunti e pubblicati nel 202033. Tuttavia, questi metodi specializzati non sono accessibili o progettati per essere utilizzati in modo sicuro dal proprietario medio di una casa o di una piccola impresa.

Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando Phi6, un batteriofago avvolto che è simile a SARS-CoV-2, ha proteine spike ed è di dimensioni simili (80-100 nm)34, per tutti i test. Poiché Phi6 non è un patogeno noto, può essere manipolato in un laboratorio microbiologico generale di livello 1 di biosicurezza (BSL-1). L’efficacia contro Phi6 può indicare l’efficacia di altri virus con involucro, tuttavia, è necessaria una verifica empirica per ciascun virus di interesse35. Utilizzando un agente virale simile e non patogeno, si spera che questo protocollo possa essere ripetuto altrove e utilizzato per studiare future epidemie / pandemie virali. La ricerca futura potrebbe includere l’uso di disinfettanti (ad esempio, candeggina) oltre ai detergenti e un protocollo standardizzato per il lavaggio delle mani e l’asciugatura della linea.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L’Agenzia per la protezione dell’ambiente degli Stati Uniti (EPA) attraverso il suo ufficio di ricerca e sviluppo ha diretto la ricerca descritta nel presente documento sotto EP-C-15-008 con Jacobs Technology Inc. È stato riesaminato dall’Agenzia, ma non riflette necessariamente le opinioni dell’Agenzia. Nessuna approvazione ufficiale dovrebbe essere dedotta. L’EPA non approva l’acquisto o la vendita di prodotti o servizi commerciali. Gli autori desiderano ringraziare gli appaltatori dell’EPA Denise Aslett per la supervisione della microbiologia RTP dell’EPA, Brian Ford, Rachael Baartmans e Lesley Mendez Sandoval per il loro lavoro su questo progetto nel laboratorio di microbiologia RTP dell’EPA, Ramona Sherman per aver fornito la revisione della garanzia di qualità dell’EPA e Worth Calfee e Shannon Serre per aver fornito revisioni tecniche dell’EPA.

Materials

 Freezer (- 80 °C) ThermoFisher Scientific FDE30086FA
 Hot Plate VWR 97042-714
 Safety Pins (steel) Singer 319921
 Shaker Lab-Line Instruments, Inc. 3525
 SM buffer Teknova,  Hollister, CA S0249
 Syringe filter (0.2 μm) Corning, Corning, NY PES syringe filters, 431229
1X Phosphate Buffered Saline Teknova, Hollister, CA P0196, 10X PBS solution
Agar Becton Dickinson 214010
Autoclavable caps DWK Life Sciences, Millville, NJ KIM-KAP Caps, 73663-18
Autoclave Steris AMSCO 250LS Steam Sterilizer Model 20VS
Beef Extract Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA P/N B4888-100g
Calcium chloride Sigma-Aldrich 793639
Cell spreaders Busse Hospital Disposables 23600894
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75004271 Heraeus MegaFuge 16R Centrifuge
Certified Timer https://nist.time.gov/ Not Applicable
Conical tubes (50 mL) Corning Life Sciences 352098 Falcon 50-mL high-clarity polypropylene conical centrifuge tubes
Cryovials Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA AY509X33
Denim Wrangler Rustler Regular Fit Straight Leg Jean Four Pocket Jean with Scoop Front Pockets, PN:87619PW
Detergent Proctor and Gamble Tide Original Scent Liquid Laundry Detergent Product Number (PN): 003700023068
Dextrose Fisher BP350
Dey-Engley neutralizing broth Becton Dickinson DF0819172
Dryer Magic Chef MCSDRY15W
Face Coverings Felina Reusable Organic Cotton Face Masks, PN: 990121P4
Incubator (top agar) Symphony 414004-596
Laboratory Notebook Scientific Notebook Company 2001
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
Media sterilization and dispensing system Integra Media Clave/Media Jet
Petri Dishes (100 mm) VWR 25384-342
pH Meter Orion/Oakton STARA1110/EW-35634-35
pH Probe Orion 8157BNUMD
pH Standards Oakton 00654-(00/04/08)
Phi 6 and Pseudomonas syringae Battelle Memorial Institute, Columbus, OH Not Applicable
Pipette & Tips Rainin (Pipettes) 17014391, 17002921; (Pipette Tips) 30389239, 17014382
Refrigerator True Manufacturing Co., Inc. GDM-33
Scrubs Gogreen cool PN: WS19100PT
Sodium chloride Sigma-Aldrich 57656
Stir Bar Fisherbrand 16-800-512
Tape Measure Lufkin PS3425
Test Tubes for Soft agar (14 mL) Corning, Corning, NY 352059
Thermometer Fisherbrand 14-983-19B
Tryptone Sigma-Aldrich T9410
Vaporous hydrogen peroxide sterilization bags STERIS 62020TW
Vortex (during the plating process) Daigger Scientific, Inc 3030A Vortex Genie 2
Vortex (for sample extraction) Branson Ultrasonics 58816-115 Multi-Tube vortexer
Washer Kuppet KP1040600A
Washer Sterilization Steris STERIS VHP ED1000 generator
Yeast extract Gibco 212750
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References

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Mikelonis, A., Archer, J., Wyrzykowska-Ceradini, B., Morris, E., Sawyer, J., Chamberlain, T., Abdel-Hady, A., Monge, M., Touati, A. Determining Viral Disinfection Efficacy of Hot Water Laundering. J. Vis. Exp. (184), e64164, doi:10.3791/64164 (2022).
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