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Medicine

Déstabilisation du ménisque médial et du modèle murin de grattage du cartilage de l’arthrose accélérée

Published: July 06, 2022
doi:
10.3791/64159
, , , ,
1Institute of Biomedical and Environmental Health Research,University of the West of Scotland, 2Institute of Infection, Immunity and Inflammation,University of Glasgow

Summary

Le présent protocole décrit les rayures contrôlées des microlames à la surface du cartilage articulaire après avoir déstabilisé le genou de la souris en coupant le ligament miniscotibial médial. Ce modèle animal présente une forme accélérée d’arthrose (OA) adaptée à l’étude de la formation d’ostéophytes, de l’ostéosclérose et de la douleur à un stade précoce.

Abstract

L’arthrose est la maladie musculo-squelettique la plus répandue chez les personnes de plus de 45 ans, entraînant un coût économique et sociétal croissant. Les modèles animaux sont utilisés pour imiter de nombreux aspects de la maladie. Le présent protocole décrit le modèle de déstabilisation et de grattage cartilagineux (MDD) de l’arthrose post-traumatique. Basé sur la déstabilisation largement utilisée du modèle du ménisque médial (DMM), DCS introduit trois rayures sur la surface du cartilage. Le présent article met en évidence les étapes pour déstabiliser le genou en transectant le ligament méniscotibial médial suivi de trois égratignures superficielles intentionnelles sur le cartilage articulaire. Les méthodes d’analyse possibles par mise en charge dynamique, microtomographie et histologie sont également démontrées. Bien que le modèle DCS ne soit pas recommandé pour les études qui se concentrent sur l’effet de l’arthrose sur le cartilage, il permet d’étudier le développement de l’arthrose dans une fenêtre de temps plus courte, avec un accent particulier sur (1) la formation d’ostéophytes, (2) la douleur arthrosique et les blessures, et (3) l’effet des lésions cartilagineuses dans l’ensemble de l’articulation.

Introduction

L’arthrose est la maladie musculo-squelettique la plus répandue chez les personnes de plus de 45 ans, avec plus de 8,75 millions de personnes cherchant un traitement au Royaume-Uni1. La prévalence croissante de la maladie a entraîné une augmentation des coûts économiques et sociétaux, contribue grandement à l’invalidité et réduit la qualité de vie des patients1. Sans traitements disponibles, il est urgent d’accélérer la recherche pour comprendre le développement et la progression de la maladie. La maladie est complexe et aussi multifactorielle dans sa nature. Les principales mesures cliniques de la maladie sont la douleur et la mobilité articulaire2, et l’arthrose affecte tous les tissus de l’articulation, pas seulement le cartilage3. L’un des principaux défis dans la compréhension de l’arthrose est qu’elle peut prendre des années, parfois des décennies, entre la présentation initiale ou la blessure et la progression symptomatique de la maladie avec douleur et immobilité.

La modélisation de l’arthrose chez les rongeurs a amélioré nos connaissances sur la physiopathologie de l’arthrose en nous permettant de comprendre l’initiation et la progression dans un laps de temps beaucoup plus court et avec un examen détaillé des tissus impliqués. Il existe de nombreux modèles murins d’arthrose, des animaux génétiquement modifiés aux modèles d’intervention chirurgicale. Le modèle murin le plus largement utilisé d’arthrose post-traumatique est la déstabilisation du ménisque médial (DMM)4,5. Une mise en garde du modèle est la variabilité entre les différents opérateurs. Les chirurgiens expérimentés peuvent effectuer la procédure avec un minimum de dommages articulaires, tandis que les opérateurs inexpérimentés exposent la capsule articulaire pendant de plus longues périodes et infligent des dommages au cartilage. Cette variabilité dans le processus influence la gravité du modèle, avec plus de dommages initiaux conduisant à une augmentation des scores de dommages au cartilage et à la formation d’ostéophytes. Dans le but de réduire la variabilité entre les opérateurs et d’imiter les dommages cartilagineux causés par une intervention clinique, une version modifiée de ce modèle est développée, dans laquelle des dommages supplémentaires contrôlés sur la surface du cartilage sous la forme de trois égratignures superficielles sont infligés6. Cela permet également de modéliser la progression de l’arthrose résultant des lésions cartilagineuses causées par certaines interventions cliniques. Par rapport au modèle DMM standard, les lésions cartilagineuses directement induites entraînent une accélération constante de la formation d’ostéophytes saillants, une augmentation des lésions et de l’inflammation du cartilage et une douleur de substitution mesurable chez les souris mâles.

Ce modèle est particulièrement adapté à l’étude de l’arthrose post-traumatique à un stade précoce, en mettant l’accent sur la formation d’ostéophytes, la présentation de la douleur (chez les souris mâles), la synovite et les modifications précoces des paramètres osseux. La cohérence de la formation d’ostéophytes dans ce modèle rend pertinent l’étude de la réparation osseuse et de l’ossification endochondrale puisque la formation d’ostéophytes est un processus de réparation par ossification endochondrale7. Le modèle imite également les dommages introduits directement sur le cartilage lors d’interventions cliniques, telles que les interventions chirurgicales arthroscopiques, et convient donc également à l’étude de l’effet des lésions cartilagineuses sur l’ensemble de l’articulation.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le comité d’examen éthique de l’Université de Glasgow et de l’Université de l’Ouest de l’Écosse, et réalisées conformément aux directives de la loi de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) (Royaume-Uni). Des souris mâles C57Bl6/J âgées de 10 semaines, pesant environ 25 g, ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux). 1. Préparation des animaux REMARQUE : Tenez compte du sexe de la souris en ce qui concerne le but de l’étude, car les modèles d’arthrose post-traumatique présentent des différences importantes selon le sexe 8,9,10. Assurez-vous que le réactif anesthésique (isoflurane à 2 %) est prêt.REMARQUE: L’anesthésie injectable peut également être utilisée11. Compte tenu de la durée rapide de la chirurgie, l’utilisation d’une anesthésie par inhalation est recommandée. Utilisez un groupe séparé apparié selon l’âge opéré fictif comme contrôle chirurgical.NOTE: Le genou controlatéral ne doit pas être utilisé comme contrôle chirurgical (opération simulée sur la jambe controlatérale). Cela peut avoir des problèmes en termes de bien-être animal, et cela affectera probablement la démarche et les mesures de la marche. Le genou controlatéral normalise les paramètres osseux intrinsèques12 et agit comme une comparaison par paires sur les tests de douleur évoqués13. Utilisez des souris matures squelettiques.NOTE: La plupart de la littérature induit l’arthrose à l’âge de 8 à 12 semaines. Dans la présente étude, les souris ont 10 semaines. 2. Soins préopératoires (effectués par un assistant chirurgical) En cas de transport à partir d’un autre établissement, attendez au moins 1 semaine avant l’intervention chirurgicale pour que les souris s’adaptent à leur nouvel environnement. Effectuer la chirurgie dans une salle stérile désignée de façon appropriée, en s’assurant que toutes les surfaces sont stériles (p. ex., utiliser des champs stériles pour couvrir les zones de chirurgie).NOTE: La chirurgie est aseptique. Disposer et placer les instruments stériles sur des champs stériles. Pesez la souris. Induire l’anesthésie en introduisant la souris dans une cage anesthésique, puis en introduisant 2 % d’isofluorane pendant 15 minutes à l’aide d’un appareil anesthésique standard (voir le tableau des matériaux).REMARQUE: La cage ne doit pas subir d’anesthésie « résiduelle » avant l’introduction de la souris. Une fois anesthésiée, sortez la souris de la chambre anesthésique et coupez la fourrure sur le genou, les côtés avant et latéraux du milieu du tibia à mi-cuisse avec de petites tondeuses à cheveux.REMARQUE: Le choix du genou des membres postérieurs dépend de la préférence de l’opérateur quant au côté qu’il trouve le plus facile de procéder à la chirurgie. Ce protocole fonctionnait sur la jambe gauche. Assurez-vous que la souris est complètement anesthésiée (ne répond pas au pincement du pied). Désinfecter la peau en appliquant un nettoyant antibactérien pour la peau (p. ex. contenant de la chlorhexidine ou de l’iodophor, voir le tableau des matières) sur la peau rasée exposée. Pour l’analgésie, administrer 0,05 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée. Placez la souris sur la face dorsale, en laissant le genou être opéré vers le haut, et placez le nez de la souris dans la buse reliée à la plate-forme anesthésique. Couvrez la souris avec un rideau stérile avec une petite ouverture en trou de serrure. Positionnez la jambe à opérer avec le genou fléchi à moins de 90°, le ligament rotulien tourné vers le haut et le pied immobilisé avec du ruban chirurgical. 3. Déstabilisation de l’intervention du ménisque médial suivie d’une égratignure du cartilage Ajustez le microscope pour qu’il se concentre sur le ligament rotulien. Pincez la peau du genou sur le côté latéral avec une pince dentelée (voir le tableau des matériaux), faites une petite coupe parallèle au tendon rotulien distal à l’aide de ciseaux chirurgicaux, introduisez les ciseaux et élargissez la coupe à environ 1 cm. Déplacez la peau du côté médial, en exposant le ligament rotulien et le plateau tibial proximal (Figure 1). Avec une lame numéro 11, faites une incision le long du côté médial du ligament rotulien, du haut vers le bas du ligament (Figure 1A). Lorsque vous atteignez le bas du ligament rotulien, tournez la lame de 90° et étendez l’incision loin du ligament rotulien vers le côté médial pour accéder à la capsule articulaire.REMARQUE: Des saignements peuvent survenir dans cette étape ou les suivantes. En cas de saignement, utilisez un coton-tige stérile et appliquez une pression de quelques secondes (5 à 30 s). Pincez le ligament rotulien avec une pince à pointe émoussée et faites pivoter le poignet pour déplacer le ligament rotulien du côté latéral, juste assez pour exposer le coussinet adipeux infra-patellaire (IFP).REMARQUE: Pour minimiser les dommages au ligament rotulien, ne tenez pas la pince à épiler trop serrée, juste assez pour garder le ligament sur le côté. Tout en tenant légèrement le ligament rotulien, pincez l’IFP avec une micro-pince à épiler (voir Tableau des matières) pour le soulever et le déplacer légèrement vers le haut. Cela permet de visualiser le ligament du ménisque médial. Identifier le ligament méniscoticien médial (LTM) du ménisque médial, qui ancre la corne crânienne du ménisque médial au plateau tibial antérieur (Figure 1B). Évitez les dommages et l’exposition prolongée du cartilage au plateau tibial ou au condyle fémoral. Coupez soigneusement le MMTL avec de petits ciseaux à ressort Vannas à lame de 2 mm, en laissant le ménisque médial et les autres ligaments intacts. À ce stade, l’intervention chirurgicale pour le modèle DMM est terminée (Figure 1C). À l’aide d’un couteau microchirurgical de 3 mm, marquez trois empreintes régulièrement espacées sur le cartilage articulaire tibial dans une direction allant de la partie postérieure à la partie antérieure.NOTE: Les scores mesurent environ 1 mm de long et n’endommagent que la surface du cartilage (Figure 2D).N’utilisez pas une force excessive avec la lame sur le cartilage (c.-à-d. assurez-vous que les égratignures sont superficielles). Cette étape supplémentaire inflige des dommages au cartilage, induisant le modèle DCS. Fermez la peau à l’aide de deux ou trois petits clips métalliques de fermeture de la plaie de 7 mm ou de sutures chirurgicales sous-cutanées résorbables 6-0 (voir le tableau des matériaux).REMARQUE: Les sutures chirurgicales sous-cutanées sont meilleures car elles évitent d’autres interventions, mais elles prolongent la durée de la chirurgie. Les sutures externes augmentent le risque d’ouverture de la plaie par le rongement des souris. Identifiez le ligament méniscotibial médial du ménisque médial pour une chirurgie simulée, mais ne le coupez pas. Pour les souris qui ne reçoivent que des égratignures cartilagineuses, faites les trois égratignures superficielles sans couper le ligament.REMARQUE: Entre chaque souris, changez de gants et stérilisez les instruments via un autoclave. N’oubliez pas de vérifier que les instruments ont refroidi avant de les réutiliser. 4. Soins postopératoires En cas de saignement (>50 uL), injecter 500 μL de solution saline stérile chaude par voie sous-cutanée (sur le dos de la souris).REMARQUE: D’après notre expérience, bien que les souris aient des saignements mineurs, ce n’est jamais plus qu’une petite goutte, et donc les liquides n’ont pas besoin d’être reconstitués. Après la chirurgie, placez la souris dans une cage de récupération sur un mouchoir en papier propre et laissez la récupération de l’anesthésie (5-10 min). Transférez les souris pleinement conscientes dans une cage propre avec une litière fraîche après la chirurgie. Dans les 72 heures suivant l’intervention chirurgicale, surveiller tout signe de douleur ou de détresse. Faites attention à :Changements dans le poids corporel. Bien que le poids corporel puisse diminuer le premier et le deuxième jour, il ne dépasse généralement pas 5% du poids corporel préopératoire. Manque général de toilettage ou toilettage excessif autour de l’incision. Signes de détérioration générale de la santé, tels qu’une posture voûtée, des grimaces faciales et / ou une respiration anormale. Infection de la plaie indiquée par tout gonflement, écoulement ou ouverture de la plaie.REMARQUE: Une infection peut survenir si la plaie chirurgicale s’ouvre. Étant donné que la réparation des plaies chirurgicales (p. ex., remplacement des clips métalliques manquants ou nouvelle suture) est une procédure réglementée, assurez-vous d’obtenir l’approbation pertinente avant d’effectuer les réparations. Retirez les clips métalliques entre 5 et 7 jours après la chirurgie. Maintenir les souris généralement 2 à 52 semaines après l’opération, selon la conception de l’étude. Évaluer la douleur et la démarche à tout moment au cours de l’étude.REMARQUE : La présente étude utilise la mise en charge dynamique telle que décrite à l’étape 5.1. Euthanasier l’animal par une méthode approuvée, conformément aux accords de licence nationaux, aux directives locales et à l’approbation expérimentale.NOTE: Dans la présente étude, les animaux ont été euthanasiés par exsanguination (ponction cardiaque) sous anesthésie terminale suivie d’une luxation cervicale14. 5. Évaluation de la maladie arthrosique Mesurez la mise en charge dynamique comme mesure de substitution de la douleur en suivant les étapes ci-dessous.REMARQUE: Comme les souris sont des proies, elles ont tendance à cacher les comportements douloureux. Cela rend la mesure de la douleur difficile. Il existe de nombreuses façons de mesurer la douleur évoquée, telles que Von Frey15 et l’analyse de la démarche16. La présente étude a mesuré la charge différentielle entre la jambe arthrosique opérée et la jambe témoin non opérée sur un tapis compressif alors que la souris était dans une cage (voir le tableau des matériaux, figure 2A).Pesez la souris. Tare et étalonnez le tapis de pression conformément aux instructions spécifiques du fabricant (voir Équipement porteur dynamique dans le tableau des matériaux). Introduisez la souris dans la cage. Enregistrez le mouvement et la pression des pattes de la souris dans la cage pendant 5 min. Analyser les données acquises pour valider 1 min, en suivant les instructions du fabricant.REMARQUE : L’analyse automatisée du fabricant sur le logiciel DWB (voir l’équipement porteur dynamique dans le tableau des matériaux) fournit des mesures sur chaque patte proportionnellement au poids corporel total, la quantité de temps validée pendant laquelle chaque patte est restée sur le tapis et une estimation de la surface du tapis occupée par chaque patte. Cela permet de calculer la charge différentielle entre les deux pattes arrière, la charge différentielle entre les pattes avant et arrière, une augmentation de la charge de la patte avant (si la même souris a été mesurée sur une période de temps), le temps passé à soulever la jambe OA par rapport à la jambe controlatérale et à la surface de la patte. Quantifier le tissu calcifié par microtomodensitométrie (μCT).NOTE: Bien que l’ostéosclérose osseuse sous-chondrale et la formation d’ostéophytes puissent être mesurées dans des coupes histologiques, μCT offre la possibilité de quantifier tridimensionnellement. La résolution de la capture d’image en μCT à 5 μm est suffisante, car elle permet de visualiser des structures plus petites telles que les ostéophytes, bien que plus la résolution est élevée, mieux c’est.Fixer les articulations du genou dans une solution de paraformaldéhyde à 4% pendant 24 h, puis transférer à 70% EtOH. Scanner les articulations du genou dans un scanner μCT.REMARQUE : Dans la présente étude, les échantillons ont été scannés sur un scanner μCT (voir le tableau des matériaux) avec un filtre en aluminium de 0,5 réglé à 50 kV et 200 μA. Les échantillons ont été examinés à une taille de voxel de 4,5 μm; 2 μm, angle de rotation de 0,2° pour l’imagerie et angle de rotation de 0,5° pour la quantification. Reconstruisez les scans pour permettre la visualisation 3D. Les numérisations présentées ici ont été reconstruites à l’aide d’un logiciel compatible (voir le tableau des matériaux). Analysez la sclérose osseuse sous-chondrale (Figure 2B) en suivant les étapes ci-dessous.Sélectionnez un volume d’intérêt (VOI) de 0,5 mm × 0,9 mm × 0,9 mm au centre de la charge du plateau tibial médian17. Normaliser contre le phénotype osseux intrinsèque de la souris en analysant la jambe non opérée. Déterminer la densité osseuse sous-chondrale et la microarchitecture en sélectionnant une région d’intérêt (ROI) délimitant la structure trabéculaire dans l’épiphyse tibiale, la plaque sous-chondrale ou l’os sous-chondral total dans la vue coronale bidimensionnelle de la pile à l’aide du logiciel CTan (voir Tableau des matériaux).NOTE: Au fur et à mesure que la maladie progresse, la séparation entre la plaque sous-chondrale et la région trabéculaire sous-chondrale devient plus difficile à distinguer. Il est alors recommandé d’analyser la zone de l’os sous-chondral choisie de l’espace articulaire à la plaque de croissance. Quantifier les ostéophytes (Figure 2C) en suivant les étapes ci-dessous.Identifier les ostéophytes dans les piles d’images tridimensionnelles reconstruites à l’aide du logiciel CTvol (voir Tableau des matériaux).NOTE: Les ostéophytes minéralisés sont des protubérances semblables à l’os tissé visible sur la face médiale de l’os sous-chondral18. Un exemple de ceux-ci est indiqué par des flèches jaunes à la figure 2C. Compter manuellement le nombre d’ostéophytes identifiés dans la face médiale de l’articulation du genou. Mesurer le volume des ostéophytes dans l’analyse d’images séquentielles 2D (à l’aide de l’analyseur CT) en délimitant manuellement le bord des ostéophytes, dépassant de la plaque sous-chondrale comme région d’intérêt (ROI) pour l’analyse. Calculez la densité osseuse des ostéophytes comme le rapport entre le volume osseux et le volume des ostéophytes à l’aide du logiciel d’analyse par tomodensitométrie (voir le tableau des matériaux). Évaluer les lésions cartilagineuses et la synovite (Figure 2D) selon le score OARSI de dommages au cartilage19 et le score de synovite20 sur les coupes de 6 μm incorporées dans la paraffine.Après le balayage, décalcifier les articulations du genou dans 10% d’EDTA à 4 °C pendant au moins 2 semaines, en changeant de solution deux fois par semaine. Incorporer des échantillons dans de la paraffine. Pour les traitements et les périodes d’incubation, voir le dossier supplémentaire 1. Couper des sections coronales de 5 μm d’échantillons incorporés à la paraffine sur un microtome rotatif (voir le tableau des matériaux). Sélectionnez des sections dans la zone où les condyles tibiaux et fémoraux se rencontrent (Figure 2D). Sélectionnez deux sections dans trois zones également éloignées de l’articulation.NOTE : Les sections notées dans la présente étude ont été sélectionnées dans des zones distantes de 80 à 100 μm. Colorer les sections avec Safranin-O et Fast green (voir le tableau des matériaux) en suivant les étapes ci-dessous.Déparaffiniser les sections en les immergeant (dans l’ordre mentionné) dans du xylène pendant 5 min (2x), 100% éthanol pendant 2 min, 95% éthanol pendant 2 min, 80% éthanol pendant 2 min, et 70% éthanol pendant 2 min. Coloration à l’hématoxyline filtrée (voir tableau des matières) pendant 30 s. Puis rincer à l’eau du robinet pendant 5 min (trois fois). Laver avec le tampon de Scott (2 g de bicarbonate de sodium et 10 g de sulfate de magnésium dans 1 L d’eau distillée) pendant 2 min. Rincer à l’eau du robinet pendant 5 min (trois fois). Colorer pendant 4 min avec 0,2% de vert rapide. Trempez cinq fois dans 1% d’acide acétique glacial (fraîchement préparé à chaque séance). Rincer rapidement à l’eau du robinet. Colorer pendant 5 min avec 0,5% de Safranin-O. Rincer dans de l’éthanol à 95%. Déshydrater les sections dans de l’éthanol à 100% pendant 3 min suivi de 3 min dans du xylène. Sections de score comme indiqué dans Glasson et al. pour le cartilage19 et Jackson et al. pour la synovite20.NOTE : Il existe d’autres méthodes de quantification, comme la quantification informatisée de Pinamont et coll.21. Validez le système de notation avec deux marqueurs différents, aveuglés par l’expérience.

Representative Results

Le pourcentage de charge par poids total du corps de la jambe arrière actionnée/OA a été comparé à l’étape controlatérale/témoin. Bien que d’autres paramètres puissent également donner des différences significatives, comme l’augmentation de la charge de la patte avant après une intervention chirurgicale, un changement constant de la charge de la patte arrière indique une préférence pour utiliser une jambe plutôt que l’autre et est un indicateur plus direct d’un inconfort important pour la souris en raison du développement de l’arthrose. Il n’y a pas eu de changements significatifs dans la charge de la jambe arrière dans le modèle DMM dans les 8 semaines suivant l’induction, tandis que les souris MDS préfèrent significativement la jambe conlatérale/témoin 2 semaines après l’intervention (Figure 3A). L’os sous-chondral a été analysé en se concentrant sur le volume sous la région chargée médiale du condyle tibial. Ici, nous avons évalué la densité osseuse de cette zone en déterminant le pourcentage d’os minéralisé dans la région d’intérêt et calculé le rapport entre la jambe controlatérale et la jambe ipsilatérale. Le rapport indique que les deux modèles ont augmenté la densité osseuse dans le membre affecté (rapport supérieur à 1) 4 semaines après l’induction (Figure 3B). L’émergence d’ostéophytes est plus importante dans le modèle MDS, où il y a une augmentation significative du nombre et du volume par rapport au modèle DMM 2 semaines après l’intervention (Figure 3C,D). La MDD présente des lésions cartilagineuses élevées dans les compartiments tibial et fémoral médian et une synovite (Figure 3E,F) 4 semaines après l’induction. Figure 1 : Intervention chirurgicale pour induire une arthrose post-traumatique chez la souris. Les images séquentielles représentent les différentes étapes de la procédure. (A) Exposition de la capsule articulaire coupant la membrane superficielle autour du genou en insérant une lame de scalpel numéro 11 sur la face médiale du ligament rotulien et loin du ligament. Cela exposera le coussinet graisseux infrapatellar. (B) Identification et transsection du ligament méniscotabial médial. Pour identifier le ligament, déplacez le ligament rotulien vers le côté latéral, puis poussez le coussinet graisseux vers le haut. Cela permet de visualiser le ligament sous la forme d’une petite ligne blanche horizontale juste au-dessus du condyle tibial (indiquée ici par une flèche noire). Pour couper le ligament, la lame inférieure des ciseaux à ressort est placée sous le ligament, en prenant soin de ne pas endommager le cartilage. Déplacez le ménisque vers le côté médial pour visualiser le condyle tibial. (C) Grattage de la surface du cartilage exposé et fermeture de la plaie. Pour gratter le cartilage, la microlame est insérée vers le côté postérieur, où elle entre en contact avec le cartilage, puis se déplace vers l’avant vers la partie antérieure de l’articulation. Une fois les égratignures terminées, tirez la peau sur le genou et fermez la plaie soit par suture sous-cutanée, soit avec des clips de plaie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Évaluation de l’arthrose chez la souris. (A) La mise en charge dynamique consiste à faire correspondre la charge sur un tapis compressif à la patte correspondante. La charge est ensuite exprimée en pourcentage du poids total. (B) L’os sous-chondral est mesuré en sélectionnant un volume d’intérêt dans la région de charge du condyle tibial médian et en sélectionnant la plaque sous-chondrale ou l’os trabéculaire. Ces images sont à une résolution de 4,5 μm. (C) Les ostéophytes sont identifiés et quantifiés dans une vue tridimensionnelle des images μCT acquises. Le volume d’ostéophytes est mesuré en sélectionnant un ROI délimitant le bord de l’ostéophyte. La densité osseuse est calculée comme le volume osseux par volume ostéophyte. Les images présentées ici ont été prises à une résolution de 2 μm, mais la quantification se fait généralement avec une résolution de 4,5 μm. (D) Les scores de cartilage et de synovite sont prélevés sur des coupes de 6 μm colorées à la safranine-O et au vert rapide. Une section coronale du genou de la souris où tous les quadrants, marqués d’une boîte noire, sont visibles pour marquer et un grossissement du côté médial est montré. La synovite entourant le côté médial de l’articulation du genou est également visible, en particulier au-dessus et au-dessous du ménisque déplacé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Évaluation représentative de l’arthrose dans les modèles DMM et DCS. (A) DWB mesuré jusqu’à 8 semaines après l’induction sur des expériences effectuées par le même opérateur expert. La charge est exprimée en rapport entre la charge exploitée/OA et la charge controlatérale/témoin. Les tests t appariés des deux jambes sont également présentés dans les modèles Sham (gris), DMM (bleu) et DCS (rose). Analyse μCT 4 semaines après l’intervention chirurgicale. (B) L’os sous-chondral a été analysé 4 semaines après l’intervention chirurgicale et exprimé comme le rapport de l’ipsilatéral sur le % VPH/TV controlatéral. (C) Le nombre d’ostéophytes et (D) le volume d’ostéophytes ont été analysés 2 semaines après l’induction. L’évaluation histologique 4 semaines après l’induction de (E) lésion cartilagineuse du cartilage tibial médial et fémoral articulaire et (F) synovite ont été notées avec des méthodes standardisées19,20. Les données sont exprimées sous forme d’écart type moyen ±, n ≥ 5. Les données ont été comparées par ANOVA à mesures répétées avec une correction de test de Šídák (A), un test t apparié (A) ou un test t de Student standard (B-F). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ns = non significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Fichier supplémentaire 1 : Condition de traitement et d’incubation pour l’enrobage de paraffine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Pour effectuer l’induction chirurgicale de l’arthrose post-traumatique (PTOA), le soutien d’un assistant est fortement recommandé (par exemple, pour préparer les souris pendant que l’opérateur se concentre sur la chirurgie). Cela facilite la chirurgie aseptique, réduisant ainsi les risques d’infections et rendant l’intervention plus efficace dans les grandes expériences. Il est facile de perdre le plan de mise au point pendant la chirurgie, donc un microscope qui comprend des pédales pour la mise au point est une caractéristique précieuse pour aider à maintenir la stérilité tout au long de la chirurgie. La position de la souris et du genou est cruciale. Le genou doit être orienté vers le haut et suffisamment plié pour maximiser l’ouverture de l’espace articulaire du genou, facilitant ainsi l’accès au ligament pour introduire la microlame pour gratter la surface du condyle. L’identification du MMTL peut être difficile, surtout lorsque le coussinet adipeux est plus gros que d’habitude ou qu’il y a un petit saignement. Pour éviter les saignements, poussez le coussinet adipeux vers le haut pour éviter les déchirures et les saignements subséquents. Si le coussinet adipeux est grand, cela peut prendre un peu plus de temps, mais continuez patiemment à le pousser vers le haut.

Le MMTL est assez proche du condyle tibial, il faut donc veiller à ne pas blesser le cartilage lors du positionnement de la lame inférieure des ciseaux à ressort incurvés sous le MMTL. Les lames incurvées doivent pointer vers le côté médial et légèrement vers le haut, parallèlement au condyle. Pour une meilleure section du MMTL, assurez-vous que les ciseaux sont tranchants. Vérifiez que le ménisque peut bouger médialement après avoir coupé le ligament, car il reste parfois une petite attache qui nécessite une coupe supplémentaire. Lors de l’introduction de la microlame pour rayer le condyle, elle doit être perpendiculaire au condyle. Faites la première égratignure plus près du milieu de l’articulation mais veillez à ne pas endommager le ligament croisé antérieur. Déplacez-vous ensuite vers le côté médial, puis derrière le ménisque. Les rayures peuvent être visibles sous forme de légères lignes blanches sur le cartilage. Parce que nous utilisons habituellement des clips, l’incision initiale est effectuée sur le côté latéral, de sorte que les clips sont positionnés sur le côté de la jambe après la fermeture de la plaie. Cela évite aux clips de frotter le genou lorsque la souris reprend son mouvement. Lors de l’utilisation de sutures, l’utilisation de points de suture sous-cutanés est fortement recommandée. Si vous utilisez des points de suture externes, les souris sont susceptibles de ronger les points de suture et d’ouvrir leur plaie, ce qui augmentera les risques d’infection. Lorsqu’elle est bien faite, cette chirurgie ne doit pas prendre plus de 5 à 10 minutes, de l’incision à la fermeture de la plaie, minimisant ainsi l’exposition du cartilage et tout dommage supplémentaire incontrôlé pouvant survenir. Après la chirurgie, les souris se rétablissent très rapidement et peuvent presque immédiatement grimper dans la cage et se déplacer normalement. Si les souris ne sont pas actives, l’expert approprié de l’unité doit être consulté.

Pour l’évaluation comportementale de la douleur, la mise en charge dynamique a été évaluée. Cependant, cette méthode peut être considérée comme moins sensible que d’autres tests de douleur évoqués, tels que le test de von Frey15. Il est recommandé d’utiliser plus d’une méthode pour surveiller et évaluer la douleur. Les changements observés 2 semaines après l’intervention dans le MDD, même transitoires, indiquent une charge généralement réduite de la jambe d’arthrose par rapport à la jambe saine. Par conséquent, 2 semaines après l’intervention de MDD peuvent être utilisées pour évaluer la douleur arthrosique ou de blessure précoce dans des modèles murins. La visualisation des ostéophytes minéralisés par μCT permet une quantification tridimensionnelle, qui peut également être adaptée aux coupes histologiques12, ajoutant une autre dimension à l’étude de l’émergence et de l’évolution des ostéophytes. Dans notre groupe, la présence d’ostéophytes était variable dans le modèle DMM entre et au sein des opérateurs (2,3 ± 1 vs 1,2 ± 1, n > 7, P = 0,0183), tandis que l’induction de MDD a fortement conduit à la génération d’ostéophytes dans tous les cas, quel que soit l’opérateur (2,6 ± 0,7 vs 2,4 ± 0,5, n > 7, P = 0,711). En outre, il y a beaucoup plus d’ostéophytes et plus grands dans le modèle DCS par rapport au DMM. Ainsi, la MDD est un modèle idéal pour l’étude de la formation des ostéophytes. La quantification de l’ostéosclérose limitée à la zone de charge de l’os sous-chondral est également une amélioration dans la détection de petits changements. La comparaison du compartiment médial de la jambe opérée à la jambe controlatérale offre également un moyen de normaliser le phénotype osseux intrinsèque de cette sourisparticulière 12. L’ajout des égratignures cartilagineuses dans le modèle DCS est un moyen contrôlé d’induire des lésions cartilagineuses ciblées pendant la chirurgie qui accélère de nombreux aspects de la maladie. L’une des conséquences de la procédure expérimentale impliquant des dommages intentionnels au cartilage lui-même est que ces dommages artéfactuels doivent être exclus ou ajustés dans le système de classification du cartilage. En raison de cette limitation, nous ne recommandons pas ce modèle si l’objectif principal de l’étude est de comprendre l’effet de l’arthrose sur le cartilage lui-même. Enfin, il est également fortement recommandé d’avoir au moins deux marqueurs en aveugle pour noter les scores de lésions cartilagineuses et de synovite. Cela valide et améliore la normalisation des systèmes de notation.

L’une des limites de cette étude est que l’étendue de la variabilité de tous les paramètres comparant les modèles DCS et DMM n’a pas été entièrement évaluée. Cette question sera abordée à l’avenir par des études plus approfondies, qui pourraient également inclure une évaluation de la variabilité entre les opérateurs de différentes institutions.

En conclusion, la pathogenèse accélérée de l’arthrose dans le modèle actuel de MDD permet de représenter l’arthrose post-traumatique et fournit un outil de recherche puissant et robuste pour étudier et élucider les mécanismes physiopathologiques sous-jacents de l’arthrose à l’origine de cette maladie articulaire chronique débilitante. De plus, il permet d’explorer l’arthrose dans une fenêtre de temps plus courte, en se concentrant sur l’ostéophytogenèse, la douleur arthrose et l’effet des lésions cartilagineuses sur l’ensemble de l’articulation.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Gemma Charlesworth et Mandie Prior de l’Université de Liverpool pour leur travail, qui ont acquis les images μCT utilisées dans cette publication. Les travaux ont été financés par Versus Arthritis (subventions 20199 et 22483). Lynette Dunning a été financée par Versus Arthritis (subvention 20199). Kendal McCulloch a été financé par une bourse de doctorat de l’UWS. Carmen Huesa a été financée par Versus Arthritis (subventions 20199 et 22483).

Materials

#11 scalpel blade (and scalpel handle). World precision instruments 500240 access the joint capsule
15° Cutting Angle microsurgical stab knife MSP REF7503 scratch the cartilage
6-0 vicryl rapide Any medical supplies provider – alternative method to close wound
Anaesthetic rig Generic (many different suppliers) –
Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) Amazon – To sterilise surgical skin area
Applicator for 7 mm clips World precision instruments 500343 close the wound
Balance Generic (many different suppliers) – To weigh mouse
Blunt curved forceps Fine science tools 500232 move the patellar ligament to the side
Buprenorphine (Vetergesic) Supplied by unit as it is a prescription drug – Analgesia
CT analyser Bruker 3D.SUITE software Software
Ctvol Bruker 3D.SUITE software Software
Data viewer Bruker 3D.SUITE software Software
Dynamic weight bearing equipment Bioseb BIO-DWB-DUAL Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis
EDTA Merck E9884 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4
Ethanol Generic (many different suppliers) – for embedding decalcified bones
Fast Green FCF Merck F7252 For staining sections
Glacial acetic acid Merck 1005706 For stianing sections
Haematoxylin solution Merck GHS132 Nuclear staining in paraffin sections.
Hoskins #21 micro-tweezers. Cameron surgical limited PHF1085 move the fat pad
Isofluorane Supplied by unit as it is a prescription drug –
Mice Charles river – C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit)
Microcomputed tomography scanner Bruker SKYSCAN 1272 CMOS µCT
Micropore surgical paper tape FisherScientific 12787597 hold leg in position
Paraffin wax Generic (many different suppliers) – for embedding decalcified bones
Reflex 7 mm stainless steel wound clips or Fine science tools 12032-07 close the wound
Remover for 7 mm clips World precision instruments 500347 remove wound clips
Rotary Microtome Generic (many different suppliers) – To cut section of Paraffin embedded tissue.
Safranin-O Merck S2255 For staining sections
Serrated curved forceps Fine science tools 15915 hold the skin
Sterile Drape Generic (many different suppliers) – To ensure sterility of surgical area
Sterile Drape with key hole Generic (many different suppliers) – To cover mouse and expose leg
Sterile saline Generic (many different suppliers)
Sterile surgical drape Generic (many different suppliers) – maintain sterile environment for surgical tools
Sterile surgical drape with key hole Generic (many different suppliers) – cover the mouse and keep leg through key hole
Straight Scissors World precision instruments 14393 open the wound
Surgical microscope. Generic (many different suppliers) – Adjustable focus.
Vannas spring scissors with 2 mm blades. Fine science tools 15000-04 cut the MMTL
Xylene Generic (many different suppliers) – for embedding decalcified bones
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References

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Dunning, L., McCulloch, K., Lockhart, J. C., Goodyear, C. S., Huesa, C. Destabilization of the Medial Meniscus and Cartilage Scratch Murine Model of Accelerated Osteoarthritis. J. Vis. Exp. (185), e64159, doi:10.3791/64159 (2022).
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