زعزعة استقرار الغضروف المفصلي الإنسي والغضروف نموذج خدش الفئران من هشاشة العظام المتسارعة
Summary
يصف البروتوكول الحالي خدوش الشفرة الدقيقة التي يتم التحكم فيها على سطح الغضروف المفصلي بعد زعزعة استقرار ركبة الفأر عن طريق قطع الرباط الظنبوبي الإنسي. يقدم هذا النموذج الحيواني شكلا متسارعا من هشاشة العظام (OA) مناسبا لدراسة تكوين هشاشة العظام وتصلب العظام وآلام المرحلة المبكرة.
Abstract
هشاشة العظام هو أكثر الأمراض العضلية الهيكلية انتشارا لدى الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 45 عاما ، مما يؤدي إلى زيادة التكلفة الاقتصادية والمجتمعية. تستخدم النماذج الحيوانية لتقليد العديد من جوانب المرض. يصف البروتوكول الحالي نموذج زعزعة الاستقرار وخدش الغضروف (DCS) لالتهاب المفاصل العظمي بعد الصدمة. استنادا إلى زعزعة استقرار نموذج الغضروف المفصلي الإنسي (DMM) المستخدم على نطاق واسع ، يقدم DCS ثلاث خدوش على سطح الغضروف. تسلط المقالة الحالية الضوء على خطوات زعزعة استقرار الركبة عن طريق عبور الرباط الغضروفي الإنسي متبوعا بثلاث خدوش سطحية متعمدة على الغضروف المفصلي. كما يتم توضيح طرق التحليل الممكنة عن طريق حمل الوزن الديناميكي والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق وعلم الأنسجة. في حين أن نموذج DCS غير موصى به للدراسات التي تركز على تأثير هشاشة العظام على الغضروف ، إلا أنه يتيح دراسة تطور هشاشة العظام في نافذة زمنية أقصر ، مع التركيز بشكل خاص على (1) تكوين هشاشة العظام ، (2) التهاب المفاصل وآلام الإصابة ، و (3) تأثير تلف الغضروف في المفصل بأكمله.
Introduction
هشاشة العظام (OA) هو أكثر أمراض العضلات والعظام انتشارا لدى الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 45 عاما ، حيث يسعى أكثر من 8.75 مليون شخص للعلاج في المملكة المتحدة1. أدى الانتشار المتزايد للمرض إلى زيادة التكلفة الاقتصادية والمجتمعية ، وهو مساهم رئيسي في الإعاقة ، ويقلل من نوعية حياة المرضى1. بدون العلاجات المتاحة ، هناك حاجة ملحة لتسريع البحث لفهم تطور المرض وتطوره. المرض معقد ومتعدد العوامل بطبيعته. القياسات السريرية الرئيسية للمرض هي الألم وحركة المفاصل2 ، ويؤثر OA على جميع الأنسجة في المفصل ، وليس فقط الغضروف3. أحد التحديات الرئيسية في فهم هشاشة العظام هو أنه قد يستغرق سنوات ، وأحيانا عقودا ، من العرض الأولي / الإصابة إلى تطور المرض المصحوب بأعراض مع الألم وعدم الحركة.
عززت نمذجة هشاشة العظام في القوارض معرفتنا بالفيزيولوجيا المرضية OA من خلال السماح لنا بفهم البدء والتقدم في إطار زمني أقصر بكثير ومع فحص مفصل للأنسجة المعنية. هناك العديد من نماذج الفئران من هشاشة العظام ، من الحيوانات المعدلة وراثيا إلى نماذج التدخل الجراحي. نموذج الفئران الأكثر استخداما على نطاق واسع من الزراعة العضوية بعد الصدمة هو زعزعة استقرار الغضروف المفصلي الإنسي (DMM)4،5. تحذير النموذج هو التباين بين المشغلين المختلفين. يمكن للجراحين ذوي الخبرة إجراء العملية بأقل قدر من تلف المفاصل ، بينما يعرض المشغلون عديمي الخبرة كبسولة المفصل لفترات أطول من الوقت ويلحقون الضرر بالغضروف. يؤثر هذا التباين في العملية على شدة النموذج ، مع المزيد من الضرر الأولي الذي يؤدي إلى زيادة درجات تلف الغضروف وتكوين العظم. بهدف تقليل التباين بين المشغلين وتقليد تلف الغضروف الناتج عن التدخل السريري ، تم تطوير نسخة معدلة من هذا النموذج ، حيث يتم إلحاق أضرار إضافية يتم التحكم فيها على سطح الغضروف في شكل ثلاثة خدوش سطحية6. يسمح هذا أيضا بنمذجة تطور الزراعة العضوية الناتج عن تلف الغضروف الناجم عن بعض التدخلات السريرية. بالمقارنة مع نموذج DMM القياسي ، يؤدي تلف الغضروف المستحث مباشرة إلى تسارع تكوين هشاشة العظام باستمرار ، وزيادة تلف الغضروف والتهابه ، وألم بديل قابل للقياس في ذكور الفئران.
هذا النموذج مناسب بشكل خاص لدراسة الزراعة العضوية في مرحلة مبكرة بعد الصدمة ، مع التركيز على تكوين العظم ، وعرض الألم (في الفئران الذكور) ، والتهاب الغشاء المفصلي ، والتغيرات المبكرة في معلمات العظام. إن اتساق تكوين العظم في هذا النموذج يجعل من المناسب دراسة إصلاح العظام والتعظم داخل الغضروف لأن تكوين العظم هو عملية إصلاح عن طريق التعظم الغضروفي7. يحاكي النموذج أيضا الضرر الذي يحدث مباشرة إلى الغضروف أثناء التدخلات السريرية ، مثل العمليات الجراحية بالمنظار ، وبالتالي فهو مناسب أيضا لدراسة تأثير تلف الغضروف على المفصل بأكمله.
Protocol
Representative Results
Discussion
لإجراء الحث الجراحي لالتهاب المفاصل بعد الصدمة (PTOA) ، يوصى بشدة بالدعم من مساعد (على سبيل المثال ، لإعداد الفئران بينما يركز المشغل على الجراحة). هذا يسهل الجراحة المعقمة ، وبالتالي تقليل مخاطر العدوى وجعل التدخل أكثر كفاءة في التجارب الكبيرة. من السهل أن تفقد مستوى التركيز أثناء الجراحة ، لذا فإن المجهر الذي يتضمن دواسات للتركيز هو ميزة قيمة في المساعدة في الحفاظ على العقم طوال الجراحة. موقف الفأر والركبة أمر بالغ الأهمية. يجب أن تكون الركبة متجهة لأعلى ومثنية بدرجة كافية لزيادة فتحة مساحة مفصل الركبة إلى أقصى حد ، مما يسهل الوصول إلى الرباط لإدخال الشفرة الدقيقة لخدش سطح اللقمة. قد يكون تحديد MMTL أمرا صعبا ، خاصة عندما تكون وسادة الدهون أكبر من المعتاد أو يكون هناك نزيف صغير. لتجنب النزيف ، ادفع وسادة الدهون لأعلى لمنع التمزقات والنزيف اللاحق. إذا كانت وسادة الدهون كبيرة ، فقد يستغرق ذلك وقتا أطول قليلا ، ولكن استمر بصبر في دفعها لأعلى.
MMTL قريب جدا من اللقمة الظنبوبية ، لذلك يجب على المرء أن يحرص على عدم إصابة الغضروف عند وضع الشفرة السفلية لمقص الزنبرك المنحني تحت MMTL. يجب أن تشير الشفرات المنحنية نحو الجانب الإنسي وإلى الأعلى قليلا ، بالتوازي مع اللقمة. للحصول على أفضل تقسيم ل MMTL ، تأكد من أن المقص حاد. تأكد من أن الغضروف المفصلي يمكن أن يتحرك وسطيا بعد قطع الرباط ، حيث يبقى في بعض الأحيان ملحق صغير يحتاج إلى مزيد من القطع. عند إدخال الشفرة الدقيقة لخدش اللقمة ، يجب أن تكون متعامدة مع اللقمة. اجعل الخدش الأول أقرب إلى منتصف المفصل ولكن احرص على عدم تلف الرباط الصليبي الأمامي. ثم تحرك نحو الجانب الإنسي ثم خلف الغضروف المفصلي. قد تكون الخدوش مرئية كخطوط بيضاء باهتة على الغضروف. نظرا لأننا عادة ما نستخدم المشابك ، يتم إجراء الشق الأولي على الجانب الجانبي ، بحيث يتم وضع المشابك على جانب الساق بعد إغلاق الجرح. هذا يتجنب المشابك التي تفرك الركبة بينما يستعيد الماوس الحركة. عند استخدام الغرز ، يوصى بشدة باستخدام غرز تحت الجلد. في حالة استخدام غرز خارجية ، من المرجح أن تقضم الفئران الغرز وتفتح جرحها ، مما يزيد من فرص الإصابة. عند القيام بها بشكل صحيح ، يجب ألا تستغرق هذه الجراحة أكثر من 5-10 دقائق ، من شق إلى إغلاق الجرح ، وبالتالي تقليل تعرض الغضروف وأي ضرر إضافي غير منضبط قد يحدث. بعد الجراحة ، تتعافى الفئران بسرعة كبيرة وعلى الفور تقريبا يمكن أن تصعد إلى القفص وتتحرك بشكل طبيعي. إذا لم تكن الفئران نشطة ، فيجب استشارة الخبير المناسب في الوحدة.
للتقييم السلوكي للألم ، تم تقييم حمل الوزن الديناميكي. ومع ذلك ، يمكن اعتبار هذه الطريقة أقل حساسية من اختبارات الألم الأخرى المستثارة ، مثل اختبار فون فراي15. يوصى باستخدام أكثر من طريقة لمراقبة الألم وتقييمه. التغييرات التي لوحظت بعد 2 أسابيع من التدخل في DCS ، على الرغم من عابرة ، تشير إلى انخفاض تحميل الساق الزراعة العضوية بشكل عام مقارنة بالساق السليمة. لذلك ، يمكن استخدام 2 أسابيع بعد تدخل DCS لتقييم ألم التهاب المفاصل أو الإصابة المبكر في نماذج الفئران. يسمح تصور الخلايا العظمية المعدنية بواسطة μCT بالقياس الكمي ثلاثي الأبعاد ، والذي يمكن أيضا مطابقته مع الأقسام النسيجية12 ، مما يضيف بعدا آخر لدراسة ظهور العظم وتطوره. في مجموعتنا ، كان وجود العظم متغيرا في نموذج DMM بين وداخل المشغلين (2.3 ± 1 مقابل 1.2 ± 1 ، n > 7 ، P = 0.0183) ، في حين أدى تحريض DCS بقوة إلى توليد هشاشة العظام في جميع الحالات بغض النظر عن المشغل (2.6 ± 0.7 مقابل 2.4 ± 0.5 ، n > 7 ، P = 0.711). أيضا ، هناك نباتات عظمية أكثر وأكبر بكثير في نموذج DCS مقارنة ب DMM. وبالتالي ، فإن DCS هو نموذج مثالي لدراسة تكوين العظم. القياس الكمي لتصلب العظام يقتصر على منطقة التحميل من العظم تحت الغضروف هو أيضا تحسن في الكشف عن التغييرات الصغيرة. توفر مقارنة المقصورة الإنسية للساق التي تم تشغيلها بالساق المقابلة أيضا طريقة للتطبيع ضد النمط الظاهري العظمي الداخلي لهذا الفأرالمعين 12. تعد إضافة خدوش الغضروف في نموذج DCS وسيلة خاضعة للرقابة لإحداث تلف غضروفي مركز أثناء الجراحة التي تسرع العديد من جوانب المرض. تتمثل إحدى عواقب الإجراء التجريبي الذي ينطوي على تلف متعمد للغضروف نفسه في أن هذا الضرر المصطنع يحتاج إلى استبعاده أو تعديله في نظام تصنيف الغضروف. بسبب هذا القيد ، لا نوصي بهذا النموذج إذا كان الهدف الرئيسي للدراسة هو فهم تأثير هشاشة العظام على الغضروف نفسه. أخيرا ، يوصى بشدة أيضا بتصنيف اثنين على الأقل من الهدافين المكفوفين لتلف الغضروف ودرجات التهاب الغشاء المفصلي. هذا يتحقق ويعزز توحيد أنظمة التسجيل.
أحد قيود هذه الدراسة هو أن مدى التباين عبر جميع المعلمات التي تقارن نماذج DCS و DMM لم يتم تقييمه بالكامل. وسيتم تناول ذلك في المستقبل من خلال دراسات أكثر شمولا، والتي يمكن أن تشمل أيضا تقييما للتباين بين المشغلين من مختلف المؤسسات.
في الختام ، يسمح التسبب في هشاشة العظام المتسارع في نموذج DCS الحالي بتمثيل الزراعة العضوية بعد الصدمة ويوفر أداة بحث قوية وقوية للتحقيق وتوضيح الآليات الفيزيولوجية المرضية الأساسية للهشاشة العضوية التي تقود مرض المفاصل المنهك المزمن. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يتيح استكشاف هشاشة العظام في نافذة زمنية أقصر ، مع التركيز على تكوين العظم ، وألم هشاشة العظام ، وتأثير تلف الغضروف على المفصل بأكمله.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعرب عن تقديرنا لعمل جيما تشارلزوورث وماندي بريور في جامعة ليفربول ، اللذين حصلا على صور μCT المستخدمة في هذا المنشور. تم تمويل العمل من قبل Versus Arthritis (منح 20199 و 22483). تم تمويل Lynette Dunning من قبل Versus Arthritis (منحة 20199). تم تمويل كندال مكولوتش من خلال منحة دكتوراه UWS. تم تمويل كارمن هويسا من قبل Versus Arthritis (منح 20199 و 22483).
Materials
| #11 scalpel blade (and scalpel handle). | World precision instruments | 500240 | access the joint capsule |
| 15° Cutting Angle microsurgical stab knife | MSP | REF7503 | scratch the cartilage |
| 6-0 vicryl rapide | Any medical supplies provider | – | alternative method to close wound |
| Anaesthetic rig | Generic (many different suppliers) | – | |
| Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) | Amazon | – | To sterilise surgical skin area |
| Applicator for 7 mm clips | World precision instruments | 500343 | close the wound |
| Balance | Generic (many different suppliers) | – | To weigh mouse |
| Blunt curved forceps | Fine science tools | 500232 | move the patellar ligament to the side |
| Buprenorphine (Vetergesic) | Supplied by unit as it is a prescription drug | – | Analgesia |
| CT analyser | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Ctvol | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Data viewer | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Dynamic weight bearing equipment | Bioseb | BIO-DWB-DUAL | Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis |
| EDTA | Merck | E9884 | 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4 |
| Ethanol | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
| Fast Green FCF | Merck | F7252 | For staining sections |
| Glacial acetic acid | Merck | 1005706 | For stianing sections |
| Haematoxylin solution | Merck | GHS132 | Nuclear staining in paraffin sections. |
| Hoskins #21 micro-tweezers. | Cameron surgical limited | PHF1085 | move the fat pad |
| Isofluorane | Supplied by unit as it is a prescription drug | – | |
| Mice | Charles river | – | C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit) |
| Microcomputed tomography scanner | Bruker | SKYSCAN 1272 CMOS | µCT |
| Micropore surgical paper tape | FisherScientific | 12787597 | hold leg in position |
| Paraffin wax | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
| Reflex 7 mm stainless steel wound clips or | Fine science tools | 12032-07 | close the wound |
| Remover for 7 mm clips | World precision instruments | 500347 | remove wound clips |
| Rotary Microtome | Generic (many different suppliers) | – | To cut section of Paraffin embedded tissue. |
| Safranin-O | Merck | S2255 | For staining sections |
| Serrated curved forceps | Fine science tools | 15915 | hold the skin |
| Sterile Drape | Generic (many different suppliers) | – | To ensure sterility of surgical area |
| Sterile Drape with key hole | Generic (many different suppliers) | – | To cover mouse and expose leg |
| Sterile saline | Generic (many different suppliers) | ||
| Sterile surgical drape | Generic (many different suppliers) | – | maintain sterile environment for surgical tools |
| Sterile surgical drape with key hole | Generic (many different suppliers) | – | cover the mouse and keep leg through key hole |
| Straight Scissors | World precision instruments | 14393 | open the wound |
| Surgical microscope. | Generic (many different suppliers) | – | Adjustable focus. |
| Vannas spring scissors with 2 mm blades. | Fine science tools | 15000-04 | cut the MMTL |
| Xylene | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
References
- Arthritis Research UK. The State of Musculoskeletal Health 2018. Arthritis Research UK. , (2018).
- Mahir, L., et al. Impact of knee osteoarthritis on the quality of life. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59, 159 (2016).
- Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2016).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Sophocleous, A., Huesa, C. Osteoarthritis mouse model of destabilization of the medial meniscus. Methods in Molecular Biology. 1914, 281-293 (2019).
- McCulloch, K., et al. Accelerated post traumatic osteoarthritis in a dual injury murine model. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (12), 1800-1810 (2019).
- Fan, X., Wu, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. Macro, micro, and molecular changes of the osteochondral interface in osteoarthritis development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 659654 (2021).
- Hwang, H. S., Park, I. Y., Hong, J. I., Kim, J. R., Kim, H. A. Comparison of joint degeneration and pain in male and female mice in DMM model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (5), 728-738 (2021).
- Loga, I. S., et al. Does pain at an earlier stage of chondropathy protect female mice against structural progression after surgically induced osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 72 (12), 2083-2093 (2020).
- Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Huesa, C., et al. Proteinase-activated receptor 2 modulates OA-related pain, cartilage and bone pathology. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (11), 1989-1997 (2016).
- Tappe-Theodor, A., King, T., Morgan, M. M. Pros and cons of clinically relevant methods to assess pain in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 100, 335-343 (2019).
- Stewart, K., Schroeder, V. A. Lab animal research. blood withdrawal I. JoVE Science Education Database. , (2018).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Das Neves Borges, P., Forte, A. E., Vincent, T. L., Dini, D., Marenzana, M. Rapid, automated imaging of mouse articular cartilage by microCT for early detection of osteoarthritis and finite element modelling of joint mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (10), 1419-1428 (2014).
- vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. Osteophytes: relevance and biology. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (3), 237-244 (2007).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative – recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
- Pinamont, W. J., et al. Standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model. Journal of Visualized Experiments. (159), e60991 (2020).
