ערעור היציבות של המניסקוס המדיאלי ושריטה הסחוס מודל מורין של דלקת מפרקים ניוונית מואצת
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שריטות המיקרובלייד המבוקרות על פני השטח של הסחוס המפרקי לאחר ערעור היציבות של ברך העכבר על ידי חיתוך הרצועה המיניסקוטיבית המדיאלית. מודל חייתי זה מציג צורה מואצת של דלקת מפרקים ניוונית (OA) המתאימה לחקר היווצרות אוסטאופיטים, אוסטאוסקלרוזיס וכאבים בשלב מוקדם.
Abstract
דלקת מפרקים ניוונית היא מחלת השלד-שריר השכיחה ביותר בקרב אנשים מעל גיל 45, מה שמוביל לעלות כלכלית וחברתית הולכת וגדלה. מודלים של בעלי חיים משמשים לחיקויים היבטים רבים של המחלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את מודל שריטת היציבות והסחוס (DCS) של דלקת מפרקים ניוונית פוסט טראומטית. בהתבסס על התערערות היציבות הנפוצה של מודל המניסקוס המדיאלי (DMM), DCS מציג שלוש שריטות על משטח הסחוס. המאמר הנוכחי מדגיש את השלבים לערעור היציבות של הברך על ידי מעבר הרצועה המניסקוטיביאלית המדיאלית ואחריה שלוש שריטות שטחיות מכוונות על הסחוס המפרקי. שיטות הניתוח האפשריות על ידי נשיאת משקל דינמית, טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת והיסטולוגיה מודגמות גם הן. בעוד שמודל DCS אינו מומלץ למחקרים המתמקדים בהשפעת דלקת מפרקים ניוונית על הסחוס, הוא מאפשר לחקור את התפתחות דלקת מפרקים ניוונית בחלון זמן קצר יותר, עם דגש מיוחד על (1) היווצרות אוסטאופיטים, (2) כאבים אוסטאוארתריטיים ופציעות, ו-(3) השפעת פגיעה בסחוס בכל המפרק.
Introduction
דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא המחלה השכיחה ביותר של שלד-שריר בקרב אנשים מעל גיל 45, עם יותר מ-8.75 מיליון פונים לטיפול בבריטניה1. השכיחות הגוברת של המחלה הובילה לעלייה במחיר הכלכלי והחברתי, תורמת רבות למוגבלות ומפחיתה את איכות החיים של החולים1. ללא טיפולים זמינים, יש צורך דחוף להאיץ את המחקר כדי להבין את התפתחות המחלה והתקדמותה. המחלה מורכבת וגם רב גורמית באופיה. המדדים הקליניים העיקריים של המחלה הם כאב ותנועתיות מפרקים2, ו- OA משפיע על כל הרקמות במפרק, לא רק על הסחוס3. אחד האתגרים העיקריים בהבנת OA הוא שזה יכול לקחת שנים, לפעמים עשרות שנים, מהצגה ראשונית / פציעה ועד התקדמות מחלה סימפטומטית עם כאב וחוסר תנועה.
מידול אוסטאוארתריטיס במכרסמים שיפר את הידע שלנו על פתופיזיולוגיה של OA בכך שאיפשר לנו להבין את הייזום וההתקדמות במסגרת זמן קצרה בהרבה ועם בדיקה מפורטת של הרקמות המעורבות. ישנם מודלים רבים של מורין של דלקת מפרקים ניוונית, מבעלי חיים מהונדסים גנטית ועד מודלים של התערבות כירורגית. מודל המורין הנפוץ ביותר של OA פוסט טראומטי הוא ערעור היציבות של המניסקוס המדיאלי (DMM)4,5. אזהרה של המודל היא השונות בין אופרטורים שונים. מנתחים מנוסים יכולים לבצע את ההליך עם נזק מינימלי למפרק, בעוד מפעילים לא מנוסים חושפים את קפסולת המפרק לפרקי זמן ארוכים יותר וגורמים נזק לסחוס. שונות זו בתהליך משפיעה על חומרת המודל, כאשר נזק ראשוני רב יותר מוביל לעלייה בציוני הנזק לסחוס ולהיווצרות אוסטאופיטים. מתוך כוונה לצמצם את השונות בין המפעילים ולחקות נזקי סחוס כתוצאה מהתערבות קלינית, מפותחת גרסה שונה של מודל זה, שבמסגרתה נגרם נזק נוסף מבוקר על פני הסחוס בצורה של שלוש שריטות שטחיות6. זה גם מאפשר למדל את התקדמות OA הנובעת מנזק לסחוס שנגרם על ידי כמה התערבויות קליניות. בהשוואה למודל DMM הסטנדרטי, הפגיעה הישירה בסחוס גורמת להיווצרות אוסטאופיטים בולטים המואצת באופן עקבי, לפגיעה מוגברת בסחוס ולדלקת, ולכאבים פונדקאיים הניתנים למדידה בעכברים זכרים.
מודל זה מתאים במיוחד לחקר OA פוסט-טראומטי בשלב מוקדם, תוך התמקדות בהיווצרות אוסטאופיטים, הצגת כאב (בעכברים זכרים), סינוביטיס ושינויים מוקדמים בפרמטרים של העצם. העקביות של היווצרות אוסטאופיטים במודל זה הופכת את זה לרלוונטי לחקר תיקון עצם ואוסיפיקציה אנדוכונדרלית מכיוון שהיווצרות אוסטאופיטים היא תהליך של תיקון באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית7. המודל גם מחקה נזק הנגרם ישירות לסחוס במהלך התערבויות קליניות, כגון ניתוחים ארתרוסקופיים, ולכן הוא מתאים גם לחקר ההשפעה של פגיעה בסחוס על המפרק כולו.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לבצע אינדוקציה כירורגית של דלקת מפרקים ניוונית פוסט טראומטית (PTOA), מומלץ מאוד לתמוך בעוזר (למשל, להכין את העכברים בזמן שהמפעיל מתמקד בניתוח). זה מקל על ניתוח אספטי, ובכך להפחית את הסיכונים של זיהומים ולהפוך את ההתערבות יעילה יותר בניסויים גדולים. קל לאבד את מישור המיקוד במהלך הניתוח, ולכן מיקרוסקופ הכולל דוושות למיקוד הוא תכונה חשובה בשמירה על סטריליות לאורך כל הניתוח. מיקום העכבר והברך הוא קריטי. הברך חייבת להיות פונה כלפי מעלה וכפופה מספיק כדי למקסם את הפתח של שטח מפרק הברך, מה שמקל על הגישה לרצועה להחדרת המיקרובלייד כדי לגרד את משטח הקונדיל. זיהוי ה- MMTL יכול להיות מאתגר, במיוחד כאשר כרית השומן גדולה מהרגיל או שיש דימום קטן. כדי למנוע דימום, יש לדחוף את כרית השומן כלפי מעלה כדי למנוע קרעים ודימום לאחר מכן. אם כרית השומן גדולה, זה עשוי לקחת קצת יותר זמן, אבל בסבלנות להמשיך לדחוף אותו כלפי מעלה.
ה- MMTL קרוב למדי לקונדיל הטיביאלי, ולכן יש להיזהר שלא לפגוע בסחוס בעת מיקום הלהב התחתון של מספריים הקפיצים המעוקלים מתחת ל- MMTL. הלהבים המעוקלים צריכים להצביע לכיוון הצד המדיאלי ומעט כלפי מעלה, במקביל לקונדיל. לחיתוך הטוב ביותר של ה-MMTL, ודא שהמספריים חדים. בדקו כי המניסקוס יכול לנוע באופן מדיאלי לאחר חיתוך הרצועה, שכן לעיתים נשאר חיבור קטן הדורש חיתוך נוסף. כאשר מציגים את המיקרובלייד כדי לגרד את הקונדיל, הוא חייב להיות בניצב לקונדיל. מקרבים את השריטה הראשונה לאמצע המפרק אך נזהרים שלא לפגוע ברצועה הצולבת הקדמית. לאחר מכן לנוע לכיוון הצד המדיאלי ואז מאחורי המניסקוס. השריטות עשויות להיראות כקווים לבנים קלושים על הסחוס. מכיוון שאנו משתמשים בדרך כלל בקליפים, החתך הראשוני מבוצע בצד הצדדי, כך שהתפסים ממוקמים בצד הרגל לאחר סגירת הפצע. פעולה זו מונעת מהקליפסים לשפשף את הברך כשהעכבר חוזר לתנועה. בעת שימוש בתפרים, מומלץ מאוד להשתמש בתפרים תת-עוריים. אם משתמשים בתפרים חיצוניים, העכברים צפויים לכרסם בתפרים ולפתוח את הפצע שלהם, מה שיגדיל את הסיכויים לזיהום. כאשר ניתוח זה נעשה נכון, אסור שייקח יותר מ-5-10 דקות, מהחתך ועד לסגירת הפצע, ובכך למזער את החשיפה של הסחוס וכל נזק בלתי מבוקר נוסף שעלול להתרחש. לאחר הניתוח, העכברים מתאוששים מהר מאוד וכמעט מיד יכולים לטפס לתוך הכלוב ולנוע כרגיל. אם העכברים אינם פעילים, יש להתייעץ עם המומחה המתאים ביחידה.
לצורך הערכה התנהגותית של כאב, הוערך נושא משקל דינמי. עם זאת, שיטה זו עשויה להיחשב פחות רגישה ממבחני כאב מעוררים אחרים, כגון בדיקת פון פריי15. מומלץ להשתמש ביותר משיטה אחת כדי לפקח ולהעריך כאב. השינויים שנצפו שבועיים לאחר התערבות ב- DCS, למרות שהם חולפים, מצביעים על ירידה כללית בהעמסה של רגל OA בהשוואה לרגל הבריאה. לכן, ניתן להשתמש בשבועיים לאחר התערבות DCS כדי להעריך כאבים אוסטאו-ארתריטיים מוקדמים או כאבים בפציעות במודלים של עכברים. הדמיה של אוסטאופיטים שעברו מינרליזציה על ידי μCT מאפשרת כימות תלת מימדי, אשר ניתן להתאים גם לסעיפים ההיסטולוגיים12, ומוסיפה ממד נוסף לחקר הופעת אוסטאופיטים ואבולוציה. בקבוצה שלנו, נוכחות אוסטאופיטים הייתה משתנה במודל DMM בין ובתוך אופרטורים (2.3 ± 1 לעומת 1.2 ± 1, n > 7, P = 0.0183), בעוד שאינדוקציה של DCS הובילה בחוזקה ליצירת אוסטאופיטים בכל המקרים ללא קשר לאופרטור (2.6 ± 0.7 לעומת 2.4 ± 0.5, n > 7, P = 0.711). כמו כן, ישנם באופן משמעותי יותר ויותר אוסטאופיטים במודל DCS בהשוואה ל- DMM. לפיכך, DCS הוא מודל אידיאלי לחקר היווצרות אוסטאופיטים. כימות של אוסטאוסקלרוזיס המוגבל לאזור ההעמסה של העצם התת-כונדרלית הוא גם שיפור באיתור שינויים קטנים. השוואת התא המדיאלי של הרגל המופעלת לרגל הנגדית מציעה גם דרך לנרמל כנגד פנוטיפ העצם הפנימי של אותו עכבר מסוים12. הוספת שריטות הסחוס במודל DCS היא אמצעי מבוקר לגרימת נזק סחוס ממוקד במהלך הניתוח המאיץ רבים מההיבטים של המחלה. אחת ההשלכות של ההליך הניסיוני הכולל פגיעה מכוונת בסחוס עצמו היא שיש לשלול או להתאים את הנזק הארטפכלי הזה במערכת דירוג הסחוס. בגלל מגבלה זו, איננו ממליצים על מודל זה אם מטרתו העיקרית של המחקר היא להבין את ההשפעה של דלקת מפרקים ניוונית על הסחוס עצמו. לבסוף, מומלץ מאוד גם שלפחות שני ציונים עיוורים ידרגו את נזקי הסחוס ואת ציוני הסינוביטיס. זה מאמת ומשפר את הסטנדרטיזציה של מערכות הניקוד.
מגבלה של מחקר זה היא שמידת השונות בכל הפרמטרים המשווים בין מודלי DCS ו- DMM לא הוערכה במלואה. נושא זה יטופל בעתיד במחקרים מקיפים יותר, שיוכלו לכלול גם הערכה של השונות בין מפעילים ממוסדות שונים.
לסיכום, הפתוגנזה המואצת של OA במודל DCS הנוכחי מאפשרת ייצוג של OA פוסט טראומטי ומספקת כלי מחקר רב עוצמה וחזק לחקור ולהבהיר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים הבסיסיים של OA המניעים את מחלת המפרקים הכרונית המתישה הזו. בנוסף, הוא מאפשר לחקור את OA בחלון זמן קצר יותר, תוך התמקדות באוסטיאופיטוגנזה, כאבי OA והשפעת פגיעה בסחוס על המפרק כולו.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות על עבודתם של ג’מה צ’רלסוורת’ ומנדי פריור מאוניברסיטת ליברפול, שרכשו את תמונות ה- μCT המשמשות בפרסום זה. העבודה מומנה על ידי Versus Arthritis (מענקים 20199 ו-22483). לינט דאנינג מומנה על ידי Versus Arthritis (מענק 20199). קנדל מק’קולוך מומן על ידי מלגת דוקטורט של UWS. כרמן הוזה מומנה על ידי Versus Arthritis (מענקים 20199 ו-22483).
Materials
| #11 scalpel blade (and scalpel handle). | World precision instruments | 500240 | access the joint capsule |
| 15° Cutting Angle microsurgical stab knife | MSP | REF7503 | scratch the cartilage |
| 6-0 vicryl rapide | Any medical supplies provider | – | alternative method to close wound |
| Anaesthetic rig | Generic (many different suppliers) | – | |
| Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) | Amazon | – | To sterilise surgical skin area |
| Applicator for 7 mm clips | World precision instruments | 500343 | close the wound |
| Balance | Generic (many different suppliers) | – | To weigh mouse |
| Blunt curved forceps | Fine science tools | 500232 | move the patellar ligament to the side |
| Buprenorphine (Vetergesic) | Supplied by unit as it is a prescription drug | – | Analgesia |
| CT analyser | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Ctvol | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Data viewer | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Dynamic weight bearing equipment | Bioseb | BIO-DWB-DUAL | Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis |
| EDTA | Merck | E9884 | 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4 |
| Ethanol | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
| Fast Green FCF | Merck | F7252 | For staining sections |
| Glacial acetic acid | Merck | 1005706 | For stianing sections |
| Haematoxylin solution | Merck | GHS132 | Nuclear staining in paraffin sections. |
| Hoskins #21 micro-tweezers. | Cameron surgical limited | PHF1085 | move the fat pad |
| Isofluorane | Supplied by unit as it is a prescription drug | – | |
| Mice | Charles river | – | C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit) |
| Microcomputed tomography scanner | Bruker | SKYSCAN 1272 CMOS | µCT |
| Micropore surgical paper tape | FisherScientific | 12787597 | hold leg in position |
| Paraffin wax | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
| Reflex 7 mm stainless steel wound clips or | Fine science tools | 12032-07 | close the wound |
| Remover for 7 mm clips | World precision instruments | 500347 | remove wound clips |
| Rotary Microtome | Generic (many different suppliers) | – | To cut section of Paraffin embedded tissue. |
| Safranin-O | Merck | S2255 | For staining sections |
| Serrated curved forceps | Fine science tools | 15915 | hold the skin |
| Sterile Drape | Generic (many different suppliers) | – | To ensure sterility of surgical area |
| Sterile Drape with key hole | Generic (many different suppliers) | – | To cover mouse and expose leg |
| Sterile saline | Generic (many different suppliers) | ||
| Sterile surgical drape | Generic (many different suppliers) | – | maintain sterile environment for surgical tools |
| Sterile surgical drape with key hole | Generic (many different suppliers) | – | cover the mouse and keep leg through key hole |
| Straight Scissors | World precision instruments | 14393 | open the wound |
| Surgical microscope. | Generic (many different suppliers) | – | Adjustable focus. |
| Vannas spring scissors with 2 mm blades. | Fine science tools | 15000-04 | cut the MMTL |
| Xylene | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
References
- Arthritis Research UK. The State of Musculoskeletal Health 2018. Arthritis Research UK. , (2018).
- Mahir, L., et al. Impact of knee osteoarthritis on the quality of life. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59, 159 (2016).
- Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2016).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Sophocleous, A., Huesa, C. Osteoarthritis mouse model of destabilization of the medial meniscus. Methods in Molecular Biology. 1914, 281-293 (2019).
- McCulloch, K., et al. Accelerated post traumatic osteoarthritis in a dual injury murine model. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (12), 1800-1810 (2019).
- Fan, X., Wu, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. Macro, micro, and molecular changes of the osteochondral interface in osteoarthritis development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 659654 (2021).
- Hwang, H. S., Park, I. Y., Hong, J. I., Kim, J. R., Kim, H. A. Comparison of joint degeneration and pain in male and female mice in DMM model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (5), 728-738 (2021).
- Loga, I. S., et al. Does pain at an earlier stage of chondropathy protect female mice against structural progression after surgically induced osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 72 (12), 2083-2093 (2020).
- Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Huesa, C., et al. Proteinase-activated receptor 2 modulates OA-related pain, cartilage and bone pathology. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (11), 1989-1997 (2016).
- Tappe-Theodor, A., King, T., Morgan, M. M. Pros and cons of clinically relevant methods to assess pain in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 100, 335-343 (2019).
- Stewart, K., Schroeder, V. A. Lab animal research. blood withdrawal I. JoVE Science Education Database. , (2018).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Das Neves Borges, P., Forte, A. E., Vincent, T. L., Dini, D., Marenzana, M. Rapid, automated imaging of mouse articular cartilage by microCT for early detection of osteoarthritis and finite element modelling of joint mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (10), 1419-1428 (2014).
- vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. Osteophytes: relevance and biology. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (3), 237-244 (2007).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative – recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
- Pinamont, W. J., et al. Standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model. Journal of Visualized Experiments. (159), e60991 (2020).
