加速変形性関節症の内側半月板および軟骨スクラッチマウスモデルの不安定化

すべての実験手順は、グラスゴー大学とスコットランド西部大学の倫理審査委員会によって承認され、1986年動物(科学的手順)法(英国)のガイドラインに従って実施されました。体重約25gの10週齢のC57Bl6/J雄マウスを本研究に用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。 1.動物の準備 注:心的外傷後OAモデルは性別によって重要な違いを示すため、研究の目的に関してマウスの性別を考慮してください8,9,10。 麻酔試薬(2%イソフルラン)の準備ができていることを確認してください。注:注射可能な麻酔も使用できます11。手術の時間が短いことを考えると、吸入麻酔の使用が推奨されます。 外科的コントロールとして、別の偽手術の年齢一致グループを使用します。.注:反対側の膝を外科的コントロール(反対側の脚の偽の手術)として使用してはなりません。これは動物福祉の面で問題があるかもしれません、そしてそれは歩行と歩行測定に影響を与える可能性があります。反対側の膝は、内因性骨パラメータ12 を正常化し、誘発性疼痛試験13の対比較として機能する。 骨格成熟マウスを使用する。注:ほとんどの文献は8〜12週齢でOAを誘発します。本研究では、マウスは10週齢である。 2.術前ケア(外科助手が実施) 別の施設から輸送する場合は、マウスが新しい環境に順応するための外科的介入の少なくとも1週間前に待ちます。 適切に指定された無菌室で手術を行い、すべての表面が無菌であることを確認します(たとえば、手術の領域を覆うために滅菌ドレープを使用します)。注:手術は無菌です。 滅菌器具を滅菌ドレープに配置して配置します。 マウスの重量を量ります。 麻酔ケージにマウスを導入し、次に標準的な麻酔リグを使用して2%イソフルオランを最大15分間導入することにより、麻酔を誘発します(材料の表を参照)。注意: ケージには、マウスを導入する前に「残留」麻酔があってはなりません。 麻酔をかけたら、マウスを麻酔室から取り出し、小さなバリカンで膝、すねの中部から太ももの中央までの前面、側面に毛皮をクリップします。注:後肢の膝の選択は、手術を行うのが簡単だと思う側のオペレーターの好み次第です。このプロトコルは左脚で作動した。 マウスが完全に麻酔をかけられていることを確認します(足をつまんでも反応しません)。 剃毛された露出した皮膚に抗菌性皮膚洗浄剤(例えば、クロルヘキシジンまたはヨードフォアを含む、 材料の表を参照)を適用して皮膚を消毒する。 鎮痛の場合は、0.05 mg / kgのブプレノルフィンを皮下投与します。. マウスを背側に置き、膝を上向きに操作し、麻酔リグに接続されたノズルにマウスの鼻を置きます。 小さな鍵穴開口部のある滅菌ドレープでマウスを覆います。 膝蓋骨靭帯を上に向けて、手術する脚を90°未満に曲げ、足をサージカルテープで固定します。 3.内側半月板手術の不安定化とそれに続く軟骨の引っかき傷 顕微鏡を調整して、膝蓋骨靭帯に焦点を合わせます。 鋸歯状の鉗子で外側の膝の皮膚をつまみ( 材料の表を参照)、外科用ハサミを使用して遠位膝蓋腱に平行に小さな切り込みを入れ、はさみを導入して切り込みを約1 cmに広げます。皮膚を内側に移動し、膝蓋骨靭帯と近位脛骨プラトーを露出させます(図1)。 11番の刃で、膝蓋靭帯の内側に沿って、靭帯の上から下に切開します(図1A)。膝蓋靭帯の底に達したら、ブレードを90°回転させ、切開部を膝蓋靭帯から内側に向かって伸ばして、関節包にアクセスします。注意: 出血は、このステップまたは後続のステップで発生する可能性があります。出血が発生した場合は、滅菌綿棒を使用し、数秒(5〜30秒)圧力をかけます。 鈍い先端鉗子で膝蓋靭帯をつまみ、手首を回転させて膝蓋骨靭帯を外側に移動し、膝蓋骨下脂肪パッド(IFP)を露出させるのに十分です。注意: 膝蓋靭帯への損傷を最小限に抑えるために、ピンセットをきつく締めすぎず、靭帯を横に保つのに十分な量です。 膝蓋靭帯を軽く持ちながら、IFPをマイクロピンセット( 材料表を参照)でつまんで持ち上げ、少し上に動かします。これにより、内側半月板靭帯を視覚化できます。 内側半月板の頭蓋角を前脛骨プラトーに固定する内側半月板の内側半月板靭帯(MMTL)を特定します(図1B)。 脛骨プラトーまたは大腿骨顆での損傷および長期の軟骨曝露を避けてください。 MMTLを小さな2mmブレードのバンナススプリングはさみで慎重に切断し、内側半月板やその他の靭帯をそのまま残します。この時点で、DMMモデルの外科的処置は完了です(図1C)。 3 mmの顕微手術ナイフを使用して、脛骨関節軟骨の3つの等間隔のくぼみを後部から前部への方向にマークします。注意: スコアの長さは約1 mmで、軟骨の表面のみを損傷します(図2D)。ブレードを軟骨に無理な力を加えないでください(つまり、引っかき傷が表面的であることを確認してください)。この追加のステップは軟骨損傷を与え、DCSモデルを誘発します。 2つまたは3つの小さな7 mm創傷閉鎖金属クリップまたは吸収性6-0皮下外科用縫合糸で皮膚を閉じます( 材料の表を参照)。注:皮下外科用縫合糸は、それ以上の介入を避けるため優れていますが、手術期間を延長します。外部縫合糸は、マウスのかじりによる創傷開放のリスクを高める。 偽手術のために内側半月板の内側半月板靭帯を特定しますが、切断しないでください。 軟骨の傷のみを受けたマウスの場合は、靭帯を切断せずに3つの表面的な引っかき傷を作ります。注:各マウスの間で、手袋を交換し、オートクレーブ を介して 器具を滅菌します。再利用する前に、機器が冷えていることを確認することを忘れないでください。 4.術後のケア 出血が発生した場合(>50 uL)、500 μLの温かい滅菌生理食塩水を皮下(マウスの背面)に注射します。.注:私たちの経験では、マウスにはわずかな出血がありますが、それは小さな滴を超えることはないため、水分を補充する必要はありません。 手術後、マウスを清潔な紙ティッシュの回復ケージに入れ、麻酔からの回復(5〜10分)させます。 手術後、完全に意識のあるマウスを新鮮な寝具のある清潔なケージに移します。 外科的介入後72時間以内に、痛みや苦痛の兆候がないか監視します。.次の点に注意してください。体重の変化。体重は1日目と2日目に減少する可能性がありますが、これは通常、術前の体重の5%以下です。 切開部の周りのグルーミングまたは過剰なグルーミングの一般的な欠如。 猫背姿勢、顔をしかめ、異常な呼吸など、一般的な健康状態の悪化の兆候。 創傷の腫脹、分泌物、または開口部によって示される創傷感染。注:手術創が開くと感染が起こることがあります。外科的創傷修復(欠落している金属クリップの交換や再縫合など)は規制された手順であるため、修復を行う前に関連する承認が得られていることを確認してください。 手術後5〜7日の間に金属クリップを取り外します。 マウスは、研究デザインに応じて、術後2〜52週間で通常維持します。 研究中の任意の時点で痛み/歩行を評価します。注:本研究では、ステップ5.1で説明されているように動的体重負荷を使用します。 国内のライセンス契約、地域のガイドライン、および実験的承認に従って、承認された方法で動物を安楽死させます。注:本研究では、動物は終末麻酔下での放血(心臓穿刺)とそれに続く頸部脱臼 によって 安楽死させました14。 5.変形性関節症の評価 以下の手順に従って、痛みの代理測定として動的体重負荷を測定します。注:マウスは獲物であるため、痛みの行動を隠す傾向があります。これは痛みの測定を困難にします。誘発性疼痛を測定するには、フォン・フレイ15 や歩行分析16など、多くの方法があります。本研究では、マウスがケージに入っている間に、圧力マット上で手術された変形性関節炎の脚と操作されていないコントロールレッグの間の差荷重を測定しました( 材料の表、 図2Aを参照)。マウスの重量を量ります。メーカーの特定の指示に従って、圧力マットを風袋引きして校正します( 材料表の動的重量負荷装置を参照)。ケージにマウスを入れます。 ケージ内のマウスの動きと足の圧力を5分間記録します。取得したデータを分析して、製造元の指示に従って1分間検証します。注意: DWBソフトウェアに関するメーカーの自動分析( 材料表の動的体重負荷機器を参照)は、総体重、各足がマットに留まった検証時間、および各足が占めるマット面積の推定に比例して各足の測定値を提供します。これにより、2つの後足間の差動荷重、前足と後足の間の差荷重、前足荷重の増加(同じマウスが一定期間にわたって測定された場合)、反対側の脚および足の表面と比較してOA脚を持ち上げるのに費やされた時間の計算が可能になります。 マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)による石灰化組織の定量化。注:軟骨下骨硬化症と骨棘形成は組織学的切片で測定できますが、μCTは3次元で定量する機会を提供します。5μmのμCTでの画像キャプチャの解像度は、骨棘などの小さな構造の視覚化を可能にするため十分ですが、解像度が高いほど優れています。膝関節を4%パラホルムアルデヒド溶液で24時間固定し、70%EtOHに移します。 μCTスキャナーで膝関節をスキャンします。注:本研究では、サンプルはμCTスキャナー( 材料表を参照)でスキャンされ、50kVおよび200μAに設定された0.5アルミニウムフィルターを使用してスキャンされました。 サンプルは4.5μmのボクセルサイズで検査されました。2 μm、イメージング用の回転角度は0.2°、定量用の回転角度は0.5°です。 スキャンを再構築して、3Dビジュアライゼーションを可能にします。ここに示すスキャンは、互換性のあるソフトウェアを使用して再構築されました(材料表を参照)。 以下の手順に従って、軟骨下骨硬化症(図2B)を分析します。内側脛骨プラトー17の荷重の中心にある0.5 mm×0.9 mm×0.9 mmの関心体積(VOI)を選択します。 マウスの内因性骨表現型に対して、手術を受けていない脚を分析することによって正規化します。 CTanソフトウェアを使用して、脛骨骨端、軟骨下プレート、またはスタックの2次元冠状ビュー内の軟骨下骨全体の構造を描写する関心領域(ROI)を選択することにより、軟骨下骨密度とマイクロアーキテクチャを決定します( 材料の表を参照)。注:疾患が進行するにつれて、軟骨下プレートと軟骨下小柱領域との間の分離は区別がより困難になる。次に、関節腔から成長板まで選択された軟骨下骨の領域を分析することをお勧めします。 以下の手順に従って骨棘を定量します(図2C)。CTvolソフトウェアを使用して、再構築された3次元画像スタック内の骨棘を特定します( 材料の表を参照)。注:石灰化骨棘は、軟骨下骨18の内側に見える織骨に似た突起である。これらの例は、 図2Cに黄色の矢印で示されています。 膝関節の内側で識別された骨棘の数を手動で数えます。 2Dシーケンシャル画像解析(CTアナライザーを使用)で骨棘の体積を測定し、骨棘のエッジを手動で描写し、分析用の関心領域(ROI)として軟骨下プレートから突き出します。 CTアナライザーソフトウェアを使用して、骨棘の体積に対する骨の体積の比率として骨棘の骨密度を計算します( 材料の表を参照)。 パラフィン包埋6μm切片のOARSI軟骨損傷スコア19および滑膜炎スコア20に従って、軟骨損傷および滑膜炎(図2D)を評価します。スキャン後、膝関節を10TAで4°Cで最低2週間脱灰し、週に2回溶液を交換します。 サンプルをパラフィンに埋め込みます。治療と潜伏期間については、 補足ファイル1を参照してください。 パラフィン包埋サンプルの5 μmコロナ切片を回転式ミクロトーム上で切断します( 材料表を参照)。 脛骨と大腿骨の顆が出会う領域のセクションを選択します(図2D)。ジョイントの 3 つの等距離の領域で 2 つの断面を選択します。注:本研究で採点されたセクションは、80〜100μm離れた領域で選択されました。 以下の手順に従って、サフラニン-Oとファストグリーン( 材料表を参照)でセクションを染色します。切片をキシレンに5分間(2x)、100%エタノールで2分間、95%エタノールで2分間、80%エタノールで2分間、70%エタノールで2分間沈めることにより、切片を脱パラフィンします。 ろ過したヘマトキシリン( 材料の表を参照)で30秒間染色します。その後、水道水で5分間(3回)すすいでください。 スコット緩衝液(1 Lの蒸留水に2 gの重炭酸ナトリウムと10 gの硫酸マグネシウム)で2分間洗浄します。「水道水」で5分間(3回)すすぎます。 0.2%ファストグリーンで4分間染色します。1%氷酢酸に5回浸します(各セッションで作りたて)。水道水ですばやくすすいでください。 0.5%サフラニン-Oで5分間染色します。95%エタノールですすいでください。切片を100%エタノールで3分間脱水した後、キシレンで3分間脱水します。 軟骨19 についてはGlassonら、滑膜炎についてはJacksonらに記載されているスコアセクション20。注:Pinamontらによるコンピュータベースの定量など、他の定量方法も存在します21。 実験を知らされていない2つの異なるスコアラーでスコアリングシステムを検証します。