Hızlandırılmış Osteoartritin Medial Menisküs ve Kıkırdak Çizik Murin Modelinin Destabilizasyonu
Summary
Mevcut protokol, medial miniskotibial ligamenti keserek fare dizinin dengesini bozduktan sonra eklem kıkırdağının yüzeyindeki kontrollü mikrobıçak çiziklerini tanımlamaktadır. Bu hayvan modeli, osteofit oluşumunu, osteosklerozu ve erken evre ağrıyı incelemek için uygun hızlandırılmış bir osteoartrit (OA) formu sunar.
Abstract
Osteoartrit, 45 yaşın üzerindeki kişilerde en yaygın kas-iskelet sistemi hastalığıdır ve artan ekonomik ve toplumsal maliyete yol açmaktadır. Hayvan modelleri, hastalığın birçok yönünü taklit etmek için kullanılır. Mevcut protokol, travma sonrası osteoartritin destabilizasyonu ve kıkırdak çizik modelini (DCS) tanımlamaktadır. Medial menisküs (DMM) modelinin yaygın olarak kullanılan destabilizasyonuna dayanarak, DCS kıkırdak yüzeyinde üç çizik oluşturur. Bu makalede, medial meniskotiyal ligamentin transeksiyonu ile dizin destabilize edilmesi ve ardından eklem kıkırdağında üç kasıtlı yüzeysel çizik vurgulanmaktadır. Dinamik ağırlık taşıma, mikrobilgisayarlı tomografi ve histoloji ile olası analiz yöntemleri de gösterilmiştir. DCS modeli, osteoartritin kıkırdak üzerindeki etkisine odaklanan çalışmalar için önerilmese de, (1) osteofit oluşumu, (2) osteoartritik ve yaralanma ağrısı ve (3) kıkırdak hasarının tüm eklemdeki etkisine özel olarak odaklanarak osteoartrit gelişiminin daha kısa sürede incelenmesini sağlar.
Introduction
Osteoartrit (OA), 45 yaşın üzerindeki kişilerde en yaygın kas-iskelet sistemi hastalığıdır ve İngiltere’de tedavi arayan 8.75 milyondan fazlakişi 1. Hastalığın artan prevalansı, ekonomik ve toplumsal maliyetin artmasına neden olmuş, engelliliğe önemli bir katkıda bulunmakta ve hastalar için yaşam kalitesini düşürmektedir1. Mevcut tedaviler olmadan, hastalığın gelişimini ve ilerlemesini anlamak için araştırmayı hızlandırmak için acil bir ihtiyaç vardır. Hastalık karmaşık ve aynı zamanda doğası gereği çok faktörlüdür. Hastalığın ana klinik ölçümleri ağrı ve eklem hareketliliği2’dir ve OA sadece kıkırdak3’ü değil, eklemdeki tüm dokuları etkiler. OA’nın anlaşılmasındaki temel zorluklardan biri, ilk sunum / yaralanmadan ağrı ve hareketsizlik ile semptomatik hastalık ilerlemesine kadar yıllar, bazen on yıllar alabilmesidir.
Kemirgenlerde osteoartritin modellenmesi, OA patofizyolojisi hakkındaki bilgimizi, başlangıç ve ilerlemeyi çok daha kısa bir zaman diliminde ve ilgili dokuların ayrıntılı bir incelemesiyle anlamamızı sağlayarak geliştirmiştir. Genetiği değiştirilmiş hayvanlardan cerrahi müdahale modellerine kadar çok sayıda osteoartrit murin modeli vardır. Post-travmatik OA’nın en yaygın kullanılan murin modeli medial menisküsün (DMM) destabilizasyonudur4,5. Modelin bir uyarısı, farklı operatörler arasındaki değişkenliktir. Deneyimli cerrahlar prosedürü minimum eklem hasarı ile gerçekleştirebilirken, deneyimsiz operatörler eklem kapsülünü daha uzun süre maruz bırakır ve kıkırdakta hasara neden olur. Prosesteki bu değişkenlik, modelin ciddiyetini etkiler, daha fazla ilk hasar kıkırdak hasarı skorlarının artmasına ve osteofit oluşumuna yol açar. Operatörler arasındaki değişkenliği azaltmak ve klinik müdahaleden kaynaklanan kıkırdak hasarını taklit etmek amacıyla, bu modelin modifiye edilmiş bir versiyonu geliştirilmiştir, bu sayede kıkırdak yüzeyine üç yüzeysel çizik şeklinde kontrollü ek hasar verilir6. Bu aynı zamanda bazı klinik müdahalelerin neden olduğu kıkırdak hasarından kaynaklanan OA ilerlemesinin modellenmesine de izin verir. Standart DMM modeliyle karşılaştırıldığında, doğrudan indüklenen kıkırdak hasarı, sürekli olarak hızlandırılmış çıkıntılı osteofit oluşumuna, kıkırdak hasarının ve iltihabının artmasına ve erkek farelerde ölçülebilir vekil ağrıya neden olur.
Bu model özellikle osteofit oluşumu, ağrı sunumu (erkek farelerde), sinovit ve kemik parametrelerindeki erken değişikliklere odaklanan erken evre travma sonrası OA çalışması için uygundur. Bu modelde osteofit oluşumunun tutarlılığı, kemik onarımı ve endokondral ossifikasyonun incelenmesini uygun kılar, çünkü osteofit oluşumu endokondral ossifikasyon yoluyla bir onarım sürecidir7. Model ayrıca artroskopik cerrahi prosedürler gibi klinik müdahaleler sırasında doğrudan kıkırdağa verilen hasarı taklit eder ve bu nedenle kıkırdak hasarının tüm eklem üzerindeki etkisinin incelenmesi için de uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Travma sonrası osteoartritin (PTOA) cerrahi indüksiyonunu gerçekleştirmek için, bir asistandan destek alınması şiddetle tavsiye edilir (örneğin, operatör ameliyata odaklanırken fareleri hazırlamak için). Bu, aseptik cerrahiyi kolaylaştırır, böylece enfeksiyon risklerini azaltır ve müdahaleyi büyük deneylerde daha verimli hale getirir. Ameliyat sırasında odak düzlemini kaybetmek kolaydır, bu nedenle odaklanma için pedallar içeren bir mikroskop, ameliyat boyunca sterilitenin korunmasına yardımcı olmak için değerli bir özelliktir. Farenin ve dizin konumu çok önemlidir. Diz, diz eklemi boşluğunun açılmasını en üst düzeye çıkarmak için yukarı bakacak ve yeterince bükülmüş olmalı, bu da kondil yüzeyini çizmek için mikrobıçağın sokulması için bağa daha kolay erişimi kolaylaştırmalıdır. MMTL’yi tanımlamak, özellikle yağ yastığı normalden daha büyük olduğunda veya küçük bir kanama olduğunda zor olabilir. Kanamayı önlemek için, gözyaşlarını ve ardından kanamayı önlemek için yağ yastığını yukarı doğru itin. Yağ yastığı büyükse, bu biraz daha uzun sürebilir, ancak sabırla yukarı doğru itmeye devam edin.
MMTL, tibial kondille oldukça yakındır, bu nedenle kavisli yay makasının alt bıçağını MMTL’nin altına yerleştirirken kıkırdağa zarar vermemeye dikkat edilmelidir. Kavisli bıçaklar medial tarafa doğru ve kondille paralel olarak hafifçe yukarı doğru işaret etmelidir. MMTL’nin en iyi şekilde kesilmesi için, makasın keskin olduğundan emin olun. Menisküsün bağı kestikten sonra medial olarak hareket edebildiğini kontrol edin, çünkü bazen daha fazla kesim gerektiren küçük bir ataşman kalır. Kondili çizmek için mikro bıçağı yerleştirirken, kondilin diline dik olmalıdır. İlk çiziği eklemin ortasına yaklaştırın, ancak ön çapraz bağa zarar vermemeye dikkat edin. Sonra medial tarafa doğru ve sonra menisküsün arkasına doğru ilerleyin. Çizikler kıkırdak üzerinde soluk beyaz çizgiler olarak görülebilir. Genellikle klips kullandığımız için ilk kesi lateral tarafta yapılır, bu nedenle klipsler yarayı kapattıktan sonra bacağın yan tarafına yerleştirilir. Bu, fare hareketi yeniden kazanırken klipslerin dizini ovalamasını önler. Dikiş kullanırken, subdermal dikişlerin kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Dış dikişler kullanılıyorsa, farelerin dikişleri kemirmesi ve yaralarını açması muhtemeldir, bu da enfeksiyon olasılığını artıracaktır. Doğru yapıldığında, bu ameliyat kesiden yara kapanmasına kadar 5-10 dakikadan fazla sürmemeli, böylece kıkırdağın maruz kalmasını ve oluşabilecek kontrolsüz hasarları en aza indirgemelidir. Ameliyattan sonra, fareler çok hızlı bir şekilde iyileşir ve neredeyse hemen kafese tırmanabilir ve normal şekilde hareket edebilir. Fareler aktif değilse, ünitedeki uygun uzmana danışılmalıdır.
Ağrının davranışsal değerlendirmesi için, dinamik ağırlık taşıyan değerlendirildi. Bununla birlikte, bu yöntem, von Frey testi15 gibi diğer uyarılmış ağrı testlerinden daha az hassas olarak kabul edilebilir. Ağrıyı izlemek ve değerlendirmek için birden fazla yöntemin kullanılması önerilir. DCS’ye müdahaleden 2 hafta sonra gözlenen değişiklikler, geçici olsa da, OA bacağının sağlıklı bacağa kıyasla genel olarak azalmış bir yüklenmesini göstermektedir. Bu nedenle, DCS müdahalesinden 2 hafta sonra, fare modellerinde erken osteoartritik veya yaralanma ağrısını değerlendirmek için kullanılabilir. Mineralize osteofitlerin μCT ile görselleştirilmesi, histolojik bölüm12 ile de eşleştirilebilen üç boyutlu nicelemeye izin verir ve osteofit ortaya çıkışı ve evrimi çalışmasına başka bir boyut ekler. Bizim grubumuzda, osteofit varlığı operatörler arasında ve içinde DMM modelinde değişkendi (2.3 ± 1’e karşı 1.2 ± 1, n > 7, P = 0.0183), DCS’nin indüksiyonu operatörden bağımsız olarak tüm vakalarda osteofit oluşumuna güçlü bir şekilde yol açtı (2.6 ± 0.7’ye karşı 2.4 ± 0.5, n > 7, P = 0.711). Ayrıca, DCS modelinde DMM’ye kıyasla önemli ölçüde daha fazla ve daha büyük osteofitler vardır. Bu nedenle, DCS osteofit oluşumunun incelenmesi için ideal bir modeldir. Subkondral kemiğin yükleme alanıyla sınırlı osteosklerozun nicelleştirilmesi de küçük değişikliklerin saptanmasında bir gelişmedir. Ameliyat edilen bacağın medial bölmesini kontralateral bacakla karşılaştırmak, aynı zamanda o farenin intrinsik kemik fenotipine karşı normalleşmenin bir yolunu sunar12. DCS modelinde kıkırdak çiziklerinin eklenmesi, hastalığın birçok yönünü hızlandıran ameliyat sırasında odaklanmış kıkırdak hasarını indüklemenin kontrollü bir yoludur. Kıkırdağın kendisine kasıtlı hasar veren deneysel prosedürün sonuçlarından biri, bu artefolgusal hasarın kıkırdak derecelendirme sisteminde dışlanması veya ayarlanması gerektiğidir. Bu sınırlama nedeniyle, çalışmanın asıl amacı osteoartritin kıkırdağın kendisi üzerindeki etkisini anlamaksa, bu modeli önermiyoruz. Son olarak, en az iki kör skorerin kıkırdak hasarı ve sinovit skorlarını derecelendirmesi şiddetle tavsiye edilir. Bu, puanlama sistemlerinin standardizasyonunu doğrular ve geliştirir.
Bu çalışmanın bir sınırlaması, DCS ve DMM modellerini karşılaştıran tüm parametrelerdeki değişkenlik derecesinin tam olarak değerlendirilmemiş olmasıdır. Bu, gelecekte, farklı kurumlardan operatörler arasındaki değişkenliğin bir değerlendirmesini de içerebilecek daha kapsamlı çalışmalarla ele alınacaktır.
Sonuç olarak, mevcut DCS modelinde hızlandırılmış OA patogenezi, travma sonrası OA’nın temsiline izin vermekte ve bu kronik zayıflatıcı eklem hastalığını yönlendiren altta yatan OA patofizyolojik mekanizmalarını araştırmak ve aydınlatmak için güçlü ve sağlam bir araştırma aracı sağlamaktadır. Ek olarak, OA’nın osteofitogenez, OA ağrısı ve kıkırdak hasarının tüm eklem üzerindeki etkisine odaklanarak daha kısa sürede araştırılmasını sağlar.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yayında kullanılan μCT görüntülerini edinen Liverpool Üniversitesi’nden Gemma Charlesworth ve Mandie Before’un çalışmalarına teşekkür ederiz. Çalışma Versus Arthritis tarafından finanse edildi (hibeler 20199 ve 22483). Lynette Dunning, Versus Arthritis (hibe 20199) tarafından finanse edildi. Kendal McCulloch, UWS doktora bursu ile finanse edildi. Carmen Huesa, Versus Arthritis (hibeler 20199 ve 22483) tarafından finanse edildi.
Materials
| #11 scalpel blade (and scalpel handle). | World precision instruments | 500240 | access the joint capsule |
| 15° Cutting Angle microsurgical stab knife | MSP | REF7503 | scratch the cartilage |
| 6-0 vicryl rapide | Any medical supplies provider | – | alternative method to close wound |
| Anaesthetic rig | Generic (many different suppliers) | – | |
| Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) | Amazon | – | To sterilise surgical skin area |
| Applicator for 7 mm clips | World precision instruments | 500343 | close the wound |
| Balance | Generic (many different suppliers) | – | To weigh mouse |
| Blunt curved forceps | Fine science tools | 500232 | move the patellar ligament to the side |
| Buprenorphine (Vetergesic) | Supplied by unit as it is a prescription drug | – | Analgesia |
| CT analyser | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Ctvol | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Data viewer | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Dynamic weight bearing equipment | Bioseb | BIO-DWB-DUAL | Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis |
| EDTA | Merck | E9884 | 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4 |
| Ethanol | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
| Fast Green FCF | Merck | F7252 | For staining sections |
| Glacial acetic acid | Merck | 1005706 | For stianing sections |
| Haematoxylin solution | Merck | GHS132 | Nuclear staining in paraffin sections. |
| Hoskins #21 micro-tweezers. | Cameron surgical limited | PHF1085 | move the fat pad |
| Isofluorane | Supplied by unit as it is a prescription drug | – | |
| Mice | Charles river | – | C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit) |
| Microcomputed tomography scanner | Bruker | SKYSCAN 1272 CMOS | µCT |
| Micropore surgical paper tape | FisherScientific | 12787597 | hold leg in position |
| Paraffin wax | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
| Reflex 7 mm stainless steel wound clips or | Fine science tools | 12032-07 | close the wound |
| Remover for 7 mm clips | World precision instruments | 500347 | remove wound clips |
| Rotary Microtome | Generic (many different suppliers) | – | To cut section of Paraffin embedded tissue. |
| Safranin-O | Merck | S2255 | For staining sections |
| Serrated curved forceps | Fine science tools | 15915 | hold the skin |
| Sterile Drape | Generic (many different suppliers) | – | To ensure sterility of surgical area |
| Sterile Drape with key hole | Generic (many different suppliers) | – | To cover mouse and expose leg |
| Sterile saline | Generic (many different suppliers) | ||
| Sterile surgical drape | Generic (many different suppliers) | – | maintain sterile environment for surgical tools |
| Sterile surgical drape with key hole | Generic (many different suppliers) | – | cover the mouse and keep leg through key hole |
| Straight Scissors | World precision instruments | 14393 | open the wound |
| Surgical microscope. | Generic (many different suppliers) | – | Adjustable focus. |
| Vannas spring scissors with 2 mm blades. | Fine science tools | 15000-04 | cut the MMTL |
| Xylene | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
References
- Arthritis Research UK. The State of Musculoskeletal Health 2018. Arthritis Research UK. , (2018).
- Mahir, L., et al. Impact of knee osteoarthritis on the quality of life. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59, 159 (2016).
- Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2016).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Sophocleous, A., Huesa, C. Osteoarthritis mouse model of destabilization of the medial meniscus. Methods in Molecular Biology. 1914, 281-293 (2019).
- McCulloch, K., et al. Accelerated post traumatic osteoarthritis in a dual injury murine model. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (12), 1800-1810 (2019).
- Fan, X., Wu, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. Macro, micro, and molecular changes of the osteochondral interface in osteoarthritis development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 659654 (2021).
- Hwang, H. S., Park, I. Y., Hong, J. I., Kim, J. R., Kim, H. A. Comparison of joint degeneration and pain in male and female mice in DMM model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (5), 728-738 (2021).
- Loga, I. S., et al. Does pain at an earlier stage of chondropathy protect female mice against structural progression after surgically induced osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 72 (12), 2083-2093 (2020).
- Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Huesa, C., et al. Proteinase-activated receptor 2 modulates OA-related pain, cartilage and bone pathology. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (11), 1989-1997 (2016).
- Tappe-Theodor, A., King, T., Morgan, M. M. Pros and cons of clinically relevant methods to assess pain in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 100, 335-343 (2019).
- Stewart, K., Schroeder, V. A. Lab animal research. blood withdrawal I. JoVE Science Education Database. , (2018).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Das Neves Borges, P., Forte, A. E., Vincent, T. L., Dini, D., Marenzana, M. Rapid, automated imaging of mouse articular cartilage by microCT for early detection of osteoarthritis and finite element modelling of joint mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (10), 1419-1428 (2014).
- vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. Osteophytes: relevance and biology. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (3), 237-244 (2007).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative – recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
- Pinamont, W. J., et al. Standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model. Journal of Visualized Experiments. (159), e60991 (2020).
