Nippostrongylus brasiliensis Enfeksiyon Modelinde IL-9 Üreten Lenfoid Hücrelerin İncelenmesi İçin Bir Strateji
Summary
IL-9 eksprese eden T ve ILC2 hücreleri, N. brasiliensis enfeksiyonu sırasında indüklenir, ancak düşük frekansları ve diferansiyel kinetik olmaları nedeniyle enfekte bağırsakta karakterizasyonları büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Bu protokol, bu hücrelerin farklı hedef organlardan izole edilmesini ve farklı enfeksiyon aşamalarında akış sitometrisi yoluyla kimliklerinin doğrulanmasını açıklar.
Abstract
IL-9, antitümör bağışıklığı, alerjik patolojilerin indüklenmesi ve parazitin atılmasında önemli bir rol oynadığı helmint enfeksiyonlarına karşı bağışıklık tepkisi dahil olmak üzere çeşitli süreçlerle ilişkili pleiotropik bir sitokindir. Nippostrongylus brasiliensis enfeksiyonunun murin modelinde, IL-9 esas olarak CD4 + T lenfositleri ve akciğer, ince bağırsak ve drenaj lenf düğümlerinde bulunan doğuştan gelen lenfoid hücreler tarafından üretilir. IL-9’un hücre içi boyanmasında yer alan teknik zorlukların yanı sıra hematopoetik hücrelerin enfeksiyon üzerine ince bağırsaktan izole edilmesinin karmaşıklığı göz önüne alındığında, bu modelde farklı lenfoid ve lenfoid olmayan dokularda IL-9 ekspresyonunu analiz etmek için kapsamlı ama basit bir protokole acil bir ihtiyaç vardır. Burada tarif edilen protokol, CD4 + T hücreleri tarafından üretilen IL-9’un kinetiğini ve enfeksiyon boyunca N. brasiliensis tarafından hedeflenen ana organlar olan akciğer ve ince bağırsaktaki doğuştan gelen lenfoid hücrelerin, ayrıca mediastinal ve mezenterik lenf düğümlerinin ana hatlarını çizmektedir. Ek olarak, hücre tipine ve ilgilenilen organa bağlı olarak enfeksiyon için gerekli larva sayısını detaylandırır. Bu protokol, N. brasiliensis enfeksiyon modelinde ilgi çekici spesifik hücrelere, organlara ve hastalık aşamalarına odaklanma fırsatı sunarak zamandan ve kaynaklardan tasarruf etmek için tahlillerin standardizasyonuna yardımcı olmayı amaçlamaktadır.
Introduction
Kancalı kurtlar, çoğunlukla az gelişmiş ülkelerdeki tropikal bölgelerde, dünya çapında yaklaşık 700 milyon insanı enfekte eden bağırsak parazitleridir. İnsanlarda en sık görülen kancalı kurt parazitleri olan Ancylostoma duodenale ve Necator americanus ile yüksek yoğunluklu enfeksiyonlar, gecikmiş büyüme ve zihinsel gelişime neden olabilecek anemi ve proteineksikliğine neden olur 1. N. americanus ve kemirgen paraziti Nippostrongylus brasiliensis, konakçılarında prototipik bir tip 2 immün yanıtı indükler ve yaşam döngülerinde benzerlikleri paylaşırlar. Bu nedenle, farelerin N. brasiliensis ile enfeksiyonu, insan kancalı kurt enfeksiyonları için en yaygın kullanılan modeldir. Evre 3 (L3) N. brasiliensis enfektif larvaları, enfeksiyondan sonraki ilk birkaç saat içinde deriden akciğere hareket eder. Akciğere girdikten sonra, L4 olurlar ve yutulmak, mideden geçmek ve 4-5 gün içinde yetişkin olmak için bağırsağa ulaşmak için trakeadan yukarı göç ederler (L5). Bağırsakta, L5 solucanları, parazit yaşam döngüsünü2 yeniden başlatmak için dışkıda atılan yumurtaları bırakır.
N. brasiliensis tarafından indüklenen immün yanıt, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 ve IL-13 dahil olmak üzere çeşitli tip 2 sitokinlerde bir artışın yanı sıra eozinofili, bazofili, kadeh ve mast hücresi hiperplazisi ve artmış IgG1 ve IgE üretimi ile karakterizedir. N. brasiliensis enfeksiyonu üzerine ortaya çıkan immün yanıtları tanımlamaya ve tanımlamaya çalışan çalışmaların çoğu, IL-4 veya IL-13’ün bu model3’teki rolüne odaklanmıştır. Bununla birlikte, IL-9 eksprese eden hücrelerin tanımlanması ve karakterizasyonu ve bu sitokinin işlevi, Licona-Limón ve ark., IL-9’un N. brasiliensis’e karşı bağışıklık tepkisinde kritik bir rol oynadığını gösteren ilk çalışmayı yayınlayana kadar büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Muhabir fareleri kullanan bu çalışma, T hücrelerini (çoğunlukla T yardımcı 9) ve tip 2 doğuştan gelen lenfoid hücreleri (ILC2’ler), enfeksiyon4 üzerine IL-9’u eksprese eden ana hücresel alt kümeler olarak tanımlamıştır.
Helmint ile enfekte akciğerlerden immün hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu mümkündür ve kapsamlı bir şekilde rapor edilmiştir 3,4. Bununla birlikte, doğal doku yeniden şekillenmesi ve mukus üretimi nedeniyle, Ferrer-Font ve ark.5’in yakın zamanda yayınlanmasına kadar, enfekte bağırsakta bunu yapmanın teknik bir zorluk olduğu kanıtlanmıştır. Grup, Heligmosomoides poligyrus ile enfekte murin bağırsaklarından immün alt kümelerin tek hücreli süspansiyonlarını izole etmek ve analiz etmek için bir protokol özetledi. Buna dayanarak, şimdi N. brasiliensis ile enfekte olmuş bağırsaktan IL-9 eksprese eden lenfoid hücrelerin izolasyonu ve sitometrik analizi için bir protokol standartlaştırdık. Ek olarak, enfeksiyon boyunca farklı hücresel kaynaklardan ve anatomik konumlardan IL-9 kinetiği oluşturduk.
Bu enfeksiyonda yer alan farklı hücre popülasyonlarını karakterize etmek, parazite karşı bağışıklık tepkisinin ve konakçı ile etkileşiminin daha geniş bir şekilde anlaşılması için hayati öneme sahiptir. Bu kapsamlı protokol, IL-9 üreten hücreleri ilgilenilen hastalık aşamalarında istenen organlardan izole etmek ve analiz etmek için net bir yol sağlar ve bu hücrelerin N. brasiliensis enfeksiyonu ve genel olarak parazit enfeksiyonlarındaki rolü hakkındaki bilgilerin keskin bir şekilde iyileştirilmesini sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
İntestinal parazit-konakçı etkileşimlerinin ve helmint enfeksiyonuna karşı immün yanıtların tam olarak anlaşılması, doku yeniden şekillenmesi ve solucan kovulmasının indüksiyonu için anahtar olan farklı hücre popülasyonlarının ve efektör moleküllerinin tanımlanmasını ve analiz edilmesini gerektirir. Topraktan bulaşan helmint enfeksiyonları, dünyadaki gelişmekte olan ülkelerde büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bununla birlikte, yakın zamana kadar, bu enfeksiyondan etkilenen ana organ o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, José Luis Ramos-Balderas’a teknik desteği için teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma, CONACYT’den (fordecyt-pronace-303027) PLL’ye aşağıdaki hibe ile desteklenmiştir. OM-P ve EO-M, CONACIST’ten (sırasıyla 736162 ve 481437) bir burs aldı. MCM-M, CONACIST’ten burs aldı (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).
Materials
| ACK buffer | Homemade | ||
| Attune Nxt cytometer | Thermofisher | ||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 | Biolegend | 100404 | |
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | Specific activity: ≥10 000 units/mg |
| Facs ARIA II sorter | BD Biosciences | ||
| FACS Melody cell sorter | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| FcεRI | eBioscience | 13589885 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | Flow cytometry analysis data software | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Homemade | ||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108704 | |
| Nylon mesh | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Phosphate-buffered saline | Homemade | ||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Streptavidin | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-γδ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tricine buffer | Homemade | ||
| Zombie Aqua Fixable Viability Dye | Biolegend | 423101 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. . Parasites – Hookworm. , (2022).
- Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
- Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
- Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
- Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
- Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
- Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
- Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
- Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
- Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
- Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
- old Spring Harbor Protocols. Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
- Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
- Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
- Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
- Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
- Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).
