Стратегия изучения IL-9-продуцирующих лимфоидных клеток в модели инфекции Nippostrongylus brasiliensis
Summary
IL-9-экспрессирующие Т- и ILC2-клетки индуцируются во время инфекции N. brasiliensis , однако их характеристика в значительной степени упускается из виду в инфицированном кишечнике из-за их низкой частоты и дифференциальной кинетики. Этот протокол описывает выделение этих клеток из разных органов-мишеней и подтверждение их идентичности с помощью проточной цитометрии на разных стадиях инфекции.
Abstract
IL-9 представляет собой плейотропный цитокин, связанный с различными процессами, включая противоопухолевый иммунитет, индукцию аллергических патологий и иммунный ответ против гельминтозных инфекций, где он играет важную роль в изгнании паразита. В мышиной модели инфекции Nippostrongylus brasiliensis IL-9 продуцируется в основном CD4+ Т-лимфоцитами и врожденными лимфоидными клетками, обнаруженными в легких, тонкой кишке и дренирующих лимфатических узлах. Учитывая технические трудности, связанные с внутриклеточным окрашиванием IL-9, а также сложность выделения гемопоэтических клеток из тонкой кишки при инфекции, существует острая необходимость во всеобъемлющем, но простом протоколе для анализа экспрессии IL-9 в различных лимфоидных и нелимфоидных тканях в этой модели. Описанный здесь протокол описывает кинетику IL-9, продуцируемого CD4+ Т-клетками и врожденными лимфоидными клетками в легких и тонкой кишке, основных органах, на которые нацелен N. brasiliensis, а также в средостении и брыжеечных лимфатических узлах, на протяжении всей инфекции. Кроме того, в нем подробно описывается количество личинок, необходимых для заражения, в зависимости от типа клеток и интересующего органа. Этот протокол направлен на то, чтобы помочь в стандартизации анализов, чтобы сэкономить время и ресурсы, предлагая возможность сосредоточиться на конкретных клетках, органах и стадиях заболевания, представляющих интерес в модели инфекции N. brasiliensis.
Introduction
Анкилостомы — это кишечные паразиты, которые заражают около 700 миллионов человек во всем мире, в основном в тропических районах слаборазвитых стран. Инфекции высокой интенсивности, вызванные анкилостомой двенадцатиперстной кишки и Necator americanus, наиболее распространенными паразитами анкилостомы у людей, вызывают анемию и дефицит белка, что может привести к задержке роста и умственного развития1. N. americanus и паразит грызунов Nippostrongylus brasiliensis индуцируют прототип иммунного ответа типа 2 у своего хозяина и имеют сходство в своем жизненном цикле. Следовательно, заражение мышей N. brasiliensis является наиболее часто используемой моделью для инфекций анкилостомы человека. Стадия 3 (L3): Инфекционные личинки N. brasiliensis перемещаются из кожи в легкие в первые несколько часов после заражения. Попав в легкое, они становятся L4 и мигрируют вверх по трахее, чтобы проглотиться, пройти через желудок и достичь кишечника, чтобы стать взрослыми (L5) в течение 4-5 дней. В кишечнике черви L5 откладывают яйца, которые выделяются с фекалиями, чтобы перезапустить жизненный циклпаразита 2.
Иммунный ответ, индуцированный N. brasiliensis , характеризуется увеличением нескольких цитокинов типа 2, включая IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 и IL-13, наряду с эозинофилией, базофилией, гиперплазией бокаловидных и тучных клеток, а также повышенной продукцией IgG1 и IgE. Большинство исследований, пытающихся идентифицировать и определить иммунные реакции, вызванные инфекцией N. brasiliensis, сосредоточены на роли IL-4 или IL-13 в этой модели3. Тем не менее, идентификация и характеристика клеток, экспрессирующих IL-9, и функция этого цитокина были в значительной степени упущены из виду, пока Licona-Limón et al. не опубликовали первое исследование, демонстрирующее критическую роль IL-9 в иммунном ответе против N. brasiliensis. Используя репортерных мышей, это исследование описало Т-клетки (в основном Т-хелперы 9) и врожденные лимфоидные клетки 2 типа (ILC2) в качестве основных клеточных подмножеств, экспрессирующих IL-9 при инфекции4.
Выделение и характеристика иммунных клеток из легких, инфицированных гельминтами, возможны, и об этом широко сообщалось 3,4. Однако из-за присущего ремоделирования тканей и производства слизи сделать это в инфицированном кишечнике оказалось технической проблемой до недавней публикации Ferrer-Font et al.5. Группа изложила протокол для выделения и анализа одноклеточных суспензий иммунных подмножеств из кишечника мышей, инфицированных Heligmosomoides polygyrus. На его основе мы стандартизировали протокол выделения и цитометрического анализа IL-9-экспрессирующих лимфоидных клеток из кишечника, инфицированного N. brasiliensis. Кроме того, мы установили кинетику IL-9 из различных клеточных источников и анатомических мест на протяжении всей инфекции.
Характеристика различных клеточных популяций, участвующих в этой инфекции, жизненно важна для более широкого понимания иммунного ответа на паразита и его взаимодействия с хозяином. Этот всеобъемлющий протокол обеспечивает четкий путь для выделения и анализа клеток, продуцирующих IL-9, из желаемых органов на интересующих стадиях заболевания, что позволяет значительно улучшить знания о роли этих клеток в инфекции N. brasiliensis и паразитарных инфекциях в целом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Полное понимание взаимодействия кишечного паразита и хозяина и иммунных реакций на гельминтную инфекцию требует идентификации и анализа различных клеточных популяций и эффекторных молекул, которые являются ключевыми для индукции ремоделирования тканей и изгнания червя. Гельминтоз?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают признательность Хосе Луису Рамосу-Бальдерасу за его техническую поддержку. Эта работа была поддержана следующим грантом PLL от CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P и EO-M получили стипендию от CONACYT (соответственно 736162 и 481437). MCM-M получил стипендию от CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).
Materials
| ACK buffer | Homemade | ||
| Attune Nxt cytometer | Thermofisher | ||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 | Biolegend | 100404 | |
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | Specific activity: ≥10 000 units/mg |
| Facs ARIA II sorter | BD Biosciences | ||
| FACS Melody cell sorter | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| FcεRI | eBioscience | 13589885 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | Flow cytometry analysis data software | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Homemade | ||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108704 | |
| Nylon mesh | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Phosphate-buffered saline | Homemade | ||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Streptavidin | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-γδ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tricine buffer | Homemade | ||
| Zombie Aqua Fixable Viability Dye | Biolegend | 423101 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. . Parasites – Hookworm. , (2022).
- Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
- Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
- Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
- Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
- Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
- Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
- Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
- Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
- Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
- Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
- old Spring Harbor Protocols. Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
- Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
- Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
- Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
- Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
- Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).
