Summary

Стратегия изучения IL-9-продуцирующих лимфоидных клеток в модели инфекции Nippostrongylus brasiliensis

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

IL-9-экспрессирующие Т- и ILC2-клетки индуцируются во время инфекции N. brasiliensis , однако их характеристика в значительной степени упускается из виду в инфицированном кишечнике из-за их низкой частоты и дифференциальной кинетики. Этот протокол описывает выделение этих клеток из разных органов-мишеней и подтверждение их идентичности с помощью проточной цитометрии на разных стадиях инфекции.

Abstract

IL-9 представляет собой плейотропный цитокин, связанный с различными процессами, включая противоопухолевый иммунитет, индукцию аллергических патологий и иммунный ответ против гельминтозных инфекций, где он играет важную роль в изгнании паразита. В мышиной модели инфекции Nippostrongylus brasiliensis IL-9 продуцируется в основном CD4+ Т-лимфоцитами и врожденными лимфоидными клетками, обнаруженными в легких, тонкой кишке и дренирующих лимфатических узлах. Учитывая технические трудности, связанные с внутриклеточным окрашиванием IL-9, а также сложность выделения гемопоэтических клеток из тонкой кишки при инфекции, существует острая необходимость во всеобъемлющем, но простом протоколе для анализа экспрессии IL-9 в различных лимфоидных и нелимфоидных тканях в этой модели. Описанный здесь протокол описывает кинетику IL-9, продуцируемого CD4+ Т-клетками и врожденными лимфоидными клетками в легких и тонкой кишке, основных органах, на которые нацелен N. brasiliensis, а также в средостении и брыжеечных лимфатических узлах, на протяжении всей инфекции. Кроме того, в нем подробно описывается количество личинок, необходимых для заражения, в зависимости от типа клеток и интересующего органа. Этот протокол направлен на то, чтобы помочь в стандартизации анализов, чтобы сэкономить время и ресурсы, предлагая возможность сосредоточиться на конкретных клетках, органах и стадиях заболевания, представляющих интерес в модели инфекции N. brasiliensis.

Introduction

Анкилостомы — это кишечные паразиты, которые заражают около 700 миллионов человек во всем мире, в основном в тропических районах слаборазвитых стран. Инфекции высокой интенсивности, вызванные анкилостомой двенадцатиперстной кишки и Necator americanus, наиболее распространенными паразитами анкилостомы у людей, вызывают анемию и дефицит белка, что может привести к задержке роста и умственного развития1. N. americanus и паразит грызунов Nippostrongylus brasiliensis индуцируют прототип иммунного ответа типа 2 у своего хозяина и имеют сходство в своем жизненном цикле. Следовательно, заражение мышей N. brasiliensis является наиболее часто используемой моделью для инфекций анкилостомы человека. Стадия 3 (L3): Инфекционные личинки N. brasiliensis перемещаются из кожи в легкие в первые несколько часов после заражения. Попав в легкое, они становятся L4 и мигрируют вверх по трахее, чтобы проглотиться, пройти через желудок и достичь кишечника, чтобы стать взрослыми (L5) в течение 4-5 дней. В кишечнике черви L5 откладывают яйца, которые выделяются с фекалиями, чтобы перезапустить жизненный циклпаразита 2.

Иммунный ответ, индуцированный N. brasiliensis , характеризуется увеличением нескольких цитокинов типа 2, включая IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 и IL-13, наряду с эозинофилией, базофилией, гиперплазией бокаловидных и тучных клеток, а также повышенной продукцией IgG1 и IgE. Большинство исследований, пытающихся идентифицировать и определить иммунные реакции, вызванные инфекцией N. brasiliensis, сосредоточены на роли IL-4 или IL-13 в этой модели3. Тем не менее, идентификация и характеристика клеток, экспрессирующих IL-9, и функция этого цитокина были в значительной степени упущены из виду, пока Licona-Limón et al. не опубликовали первое исследование, демонстрирующее критическую роль IL-9 в иммунном ответе против N. brasiliensis. Используя репортерных мышей, это исследование описало Т-клетки (в основном Т-хелперы 9) и врожденные лимфоидные клетки 2 типа (ILC2) в качестве основных клеточных подмножеств, экспрессирующих IL-9 при инфекции4.

Выделение и характеристика иммунных клеток из легких, инфицированных гельминтами, возможны, и об этом широко сообщалось 3,4. Однако из-за присущего ремоделирования тканей и производства слизи сделать это в инфицированном кишечнике оказалось технической проблемой до недавней публикации Ferrer-Font et al.5. Группа изложила протокол для выделения и анализа одноклеточных суспензий иммунных подмножеств из кишечника мышей, инфицированных Heligmosomoides polygyrus. На его основе мы стандартизировали протокол выделения и цитометрического анализа IL-9-экспрессирующих лимфоидных клеток из кишечника, инфицированного N. brasiliensis. Кроме того, мы установили кинетику IL-9 из различных клеточных источников и анатомических мест на протяжении всей инфекции.

Характеристика различных клеточных популяций, участвующих в этой инфекции, жизненно важна для более широкого понимания иммунного ответа на паразита и его взаимодействия с хозяином. Этот всеобъемлющий протокол обеспечивает четкий путь для выделения и анализа клеток, продуцирующих IL-9, из желаемых органов на интересующих стадиях заболевания, что позволяет значительно улучшить знания о роли этих клеток в инфекции N. brasiliensis и паразитарных инфекциях в целом.

Protocol

Все эксперименты на животных, описанные здесь, были одобрены Внутренним комитетом по обращению с животными (CICUAL) Института клеточной физиологии Национального автономного университета Мексики. ПРИМЕЧАНИЕ: Блок-схема всего протокола показана на рисунке 1….

Representative Results

Мышам подкожно вводили 200 личинок L3 стадии N. brasiliensis или PBS для фиктивного контроля. Количество личинок, используемых в этом протоколе, было скорректировано, чтобы изолировать жизнеспособные клетки из легких, лимфоидной ткани и тонкой кишки, в отличие от предыдущих отчетов, где боле?…

Discussion

Полное понимание взаимодействия кишечного паразита и хозяина и иммунных реакций на гельминтную инфекцию требует идентификации и анализа различных клеточных популяций и эффекторных молекул, которые являются ключевыми для индукции ремоделирования тканей и изгнания червя. Гельминтоз?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы выражают признательность Хосе Луису Рамосу-Бальдерасу за его техническую поддержку. Эта работа была поддержана следующим грантом PLL от CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P и EO-M получили стипендию от CONACYT (соответственно 736162 и 481437). MCM-M получил стипендию от CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. . Parasites – Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

Play Video

Cite This Article
Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

View Video