استراتيجية لدراسة الخلايا اللمفاوية المنتجة ل IL-9 في نموذج عدوى Nippostrongylus brasiliensis
Summary
يتم تحفيز الخلايا التائية و ILC2 المعبرة عن IL-9 أثناء عدوى N. brasiliensis ، ومع ذلك فقد تم التغاضي عن توصيفها إلى حد كبير في الأمعاء المصابة بسبب ترددها المنخفض وحركيتها التفاضلية. يصف هذا البروتوكول عزل هذه الخلايا عن الأعضاء المستهدفة المختلفة وتأكيد هويتها عن طريق قياس التدفق الخلوي في مراحل العدوى المختلفة.
Abstract
IL-9 هو سيتوكين متعدد الاتجاهات مرتبط بعمليات مختلفة ، بما في ذلك المناعة المضادة للأورام ، وتحريض أمراض الحساسية ، والاستجابة المناعية ضد عدوى الديدان الطفيلية ، حيث يلعب دورا مهما في طرد الطفيلي. في نموذج الفئران لعدوى Nippostrongylus brasiliensis ، يتم إنتاج IL-9 بشكل أساسي بواسطة الخلايا الليمفاوية التائية CD4 + والخلايا اللمفاوية الفطرية الموجودة في الرئة والأمعاء الدقيقة والغدد الليمفاوية المستنزفة. نظرا للصعوبات التقنية التي ينطوي عليها تلطيخ IL-9 داخل الخلايا ، فضلا عن تعقيد عزل الخلايا المكونة للدم من الأمعاء الدقيقة عند الإصابة ، هناك حاجة ملحة لبروتوكول شامل ولكن مباشر لتحليل تعبير IL-9 في الأنسجة اللمفاوية وغير اللمفاوية المختلفة في هذا النموذج. يحدد البروتوكول الموصوف هنا حركية IL-9 التي تنتجها الخلايا التائية CD4 + والخلايا اللمفاوية الفطرية في الرئة والأمعاء الدقيقة ، وهي الأعضاء الرئيسية التي تستهدفها N. brasiliensis ، وكذلك في الغدد الليمفاوية المنصفية والمساريقية ، طوال فترة العدوى. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يفصل عدد اليرقات اللازمة للعدوى ، اعتمادا على نوع الخلية والعضو محل الاهتمام. يهدف هذا البروتوكول إلى المساعدة في توحيد المقايسات لتوفير الوقت والموارد من خلال إتاحة الفرصة للتركيز على الخلايا والأعضاء المحددة ومراحل المرض ذات الأهمية في نموذج عدوى N. brasiliensis.
Introduction
الديدان الخطافية هي طفيليات معوية تصيب ما يقرب من 700 مليون شخص في جميع أنحاء العالم ، معظمهم في المناطق الاستوائية في البلدان المتخلفة. تسبب العدوى عالية الكثافة مع Ancylostoma duodenale و Necator americanus ، وهي طفيليات الدودة الشصية الأكثر شيوعا في البشر ، فقر الدم ونقص البروتين الذي يمكن أن يؤدي إلى تأخر النمو والنمو العقلي1. N. americanus وطفيلي القوارض Nippostrongylus brasiliensis يحفزان استجابة مناعية نموذجية من النوع 2 في مضيفهما ويتشاركان أوجه التشابه في دورة حياتهما. وبالتالي ، فإن إصابة الفئران ب N. brasiliensis هي النموذج الأكثر استخداما لعدوى الدودة الشصية البشرية. المرحلة 3 (L3) تنتقل اليرقات المعدية N. brasiliensis من الجلد إلى الرئة في الساعات القليلة الأولى بعد الإصابة. بمجرد دخولها إلى الرئة ، تصبح L4 وتهاجر إلى القصبة الهوائية لتبتلعها ، وتمر عبر المعدة ، وتصل إلى القناة الهضمية لتصبح بالغين (L5) في غضون 4-5 أيام. في القناة الهضمية ، تضع ديدان L5 بيضا يفرز في البراز لإعادة تشغيل دورة حياة الطفيلي2.
تتميز الاستجابة المناعية التي تسببها N. brasiliensis بزيادة في العديد من السيتوكينات من النوع 2 ، بما في ذلك IL-4 و IL-5 و IL-9 و IL-10 و IL-13 ، جنبا إلى جنب مع فرط الحمضات ، و basophilia ، وتضخم الخلايا البدينة والكأس ، وزيادة إنتاج IgG1 و IgE. تتركز معظم الدراسات التي تحاول تحديد وتعريف الاستجابات المناعية المستمدة من عدوى N. brasiliensis على دور IL-4 أو IL-13 في هذا النموذج3. ومع ذلك ، فقد تم التغاضي إلى حد كبير عن تحديد وتوصيف الخلايا المعبرة عن IL-9 ووظيفة هذا السيتوكين ، حتى نشر Licona-Limón et al. أول دراسة توضح دورا حاسما ل IL-9 في الاستجابة المناعية ضد N. brasiliensis. باستخدام الفئران المراسلة ، وصفت هذه الدراسة الخلايا التائية (معظمها T helper 9) والخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 2 (ILC2s) كمجموعات فرعية خلوية رئيسية تعبر عن IL-9 عند الإصابة4.
من الممكن عزل وتوصيف الخلايا المناعية من الرئتين المصابة بالديدان الطفيلية ، وقد تم الإبلاغ عنها على نطاق واسع 3,4. ومع ذلك ، بسبب إعادة تشكيل الأنسجة المتأصلة وإنتاج المخاط ، ثبت أن القيام بذلك في الأمعاء المصابة يمثل تحديا تقنيا ، حتى نشر Ferrer-Font et al.5 مؤخرا. حددت المجموعة بروتوكولا لعزل وتحليل معلقات الخلية المفردة لمجموعات فرعية مناعية من أمعاء الفئران المصابة ب Heligmosomoides polygyrus. بناء على ذلك ، قمنا الآن بتوحيد بروتوكول للعزل والتحليل الخلوي للخلايا اللمفاوية المعبرة عن IL-9 من الأمعاء المصابة ب N. brasiliensis. بالإضافة إلى ذلك ، أنشأنا حركية IL-9 من مصادر خلوية مختلفة ومواقع تشريحية طوال فترة العدوى.
يعد توصيف مجموعات الخلايا المتميزة المشاركة في هذه العدوى أمرا حيويا لفهم أوسع للاستجابة المناعية للطفيلي وتفاعله مع المضيف. يوفر هذا البروتوكول الشامل طريقا واضحا لعزل وتحليل الخلايا المنتجة ل IL-9 من الأعضاء المرغوبة في مراحل المرض ذات الاهتمام ، مما يسمح بتحسن حاد في المعرفة حول دور هذه الخلايا في عدوى N. brasiliensis وعدوى الطفيليات بشكل عام.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتطلب الفهم الكامل للتفاعلات بين الطفيليات المعوية والمضيف والاستجابات المناعية لعدوى الديدان الطفيلية تحديد وتحليل مجموعات الخلايا المختلفة وجزيئات المستجيبات التي تعتبر أساسية لتحريض إعادة تشكيل الأنسجة وطرد الديدان. تمثل عدوى الديدان الطفيلية المنقولة بالتربة مشكلة كبيرة في البل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود أصحاب البلاغ أن يعربوا عن تقديرهم لخوسيه لويس راموس – بالديراس لما قدمه من دعم تقني. تم دعم هذا العمل من خلال المنحة التالية ل PLL من CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). وحصل كل من OM-P وEO-M على زمالة من المجلس الوطني للخلايا (736162 و 481437 على التوالي). حصلت MCM-M على زمالة من CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).
Materials
| ACK buffer | Homemade | ||
| Attune Nxt cytometer | Thermofisher | ||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 | Biolegend | 100404 | |
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | Specific activity: ≥10 000 units/mg |
| Facs ARIA II sorter | BD Biosciences | ||
| FACS Melody cell sorter | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| FcεRI | eBioscience | 13589885 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | Flow cytometry analysis data software | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Homemade | ||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108704 | |
| Nylon mesh | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Phosphate-buffered saline | Homemade | ||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Streptavidin | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-γδ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tricine buffer | Homemade | ||
| Zombie Aqua Fixable Viability Dye | Biolegend | 423101 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. . Parasites – Hookworm. , (2022).
- Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
- Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
- Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
- Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
- Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
- Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
- Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
- Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
- Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
- Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
- old Spring Harbor Protocols. Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
- Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
- Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
- Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
- Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
- Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).
