Uma estratégia para o estudo de células linfoides produtoras de IL-9 no modelo de infecção por Nippostrongylus brasiliensis
Summary
As células T e ILC2 que expressam IL-9 são induzidas durante a infecção por N. brasiliensis , mas sua caracterização tem sido amplamente negligenciada no intestino infectado devido à sua baixa frequência e cinética diferencial. Este protocolo descreve o isolamento dessas células de diferentes órgãos-alvo e a confirmação de sua identidade via citometria de fluxo em diferentes estágios de infecção.
Abstract
A IL-9 é uma citocina pleiotrópica associada a vários processos, incluindo imunidade antitumoral, indução de patologias alérgicas e resposta imune contra infecções por helmintos, onde desempenha um papel importante na expulsão do parasita. Em um modelo murino de infecção por Nippostrongylus brasiliensis, a IL-9 é produzida principalmente por linfócitos T CD4+ e células linfoides inatas encontradas no pulmão, intestino delgado e linfonodos drenantes. Dadas as dificuldades técnicas envolvidas na coloração intracelular da IL-9, bem como a complexidade de isolar células hematopoiéticas do intestino delgado após a infecção, há uma necessidade premente de um protocolo abrangente, mas direto, para analisar a expressão de IL-9 em diferentes tecidos linfoides e não linfoides neste modelo. O protocolo aqui descrito descreve a cinética da IL-9 produzida pelas células T CD4+ e pelas células linfoides inatas no pulmão e intestino delgado, os principais órgãos visados pelo N. brasiliensis, bem como nos linfonodos mediastinais e mesentéricos, durante toda a infecção. Além disso, detalha o número de larvas necessárias para a infecção, dependendo do tipo de célula e órgão de interesse. Este protocolo tem como objetivo auxiliar na padronização de ensaios para economizar tempo e recursos, oferecendo a oportunidade de focar nas células, órgãos e estágios específicos da doença de interesse no modelo de infecção por N. brasiliensis.
Introduction
Os ancilostomídeos são parasitas intestinais que infectam aproximadamente 700 milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente em áreas tropicais em países subdesenvolvidos. Infecções de alta intensidade por Ancylostoma duodenale e Necator americanus, os parasitas ancilostomídeos mais comuns em humanos, causam anemia e deficiência proteica que podem resultar em atraso no crescimento e desenvolvimento mental1. N. americanus e o parasita roedor Nippostrongylus brasiliensis induzem uma resposta imune prototípica tipo 2 em seu hospedeiro e compartilham semelhanças em seu ciclo de vida. Assim, a infecção de camundongos com N. brasiliensis é o modelo mais comumente utilizado para infecções por ancilostomídeos humanos. Larvas infecciosas de N. brasiliensis em estágio 3 (L3) movem-se da pele para o pulmão nas primeiras horas pós-infecção. Uma vez no pulmão, eles se tornam L4 e migram para cima da traqueia para serem engolidos, passam pelo estômago e atingem o intestino para se tornarem adultos (L5) dentro de 4-5 dias. No intestino, os vermes L5 põem ovos que são excretados nas fezes para reiniciar o ciclo de vida do parasita2.
A resposta imune induzida por N. brasiliensis é caracterizada por um aumento em várias citocinas tipo 2, incluindo IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13, juntamente com eosinofilia, basofilia, hiperplasia caliciforme e mastócitos e aumento da produção de IgG1 e IgE. A maioria dos estudos que tentam identificar e definir as respostas imunes provocadas na infecção por N. brasiliensis está centrada no papel da IL-4 ou IL-13 nesse modelo3. No entanto, a identificação e caracterização de células que expressam IL-9 e a função desta citocina foram amplamente negligenciadas, até que Licona-Limón et al. publicaram o primeiro estudo demonstrando um papel crítico para a IL-9 na resposta imune contra N. brasiliensis. Usando camundongos repórteres, este estudo descreveu as células T (principalmente o T helper 9) e as células linfoides inatas do tipo 2 (ILC2s) como os principais subconjuntos celulares que expressam IL-9 após a infecção4.
O isolamento e a caracterização de células imunes de pulmões infectados por helmintos são viáveis e têm sido amplamente relatados 3,4. No entanto, devido ao inerente remodelamento tecidual e à produção de muco, fazê-lo no intestino infectado mostrou-se um desafio técnico, até a recente publicação de Ferrer-Font et al.5. O grupo delineou um protocolo para isolar e analisar suspensões unicelulares de subconjuntos imunológicos de intestinos murinos infectados por Heligmosomoides polygyrus. Com base nisso, padronizamos agora um protocolo para isolamento e análise citométrica de células linfoides expressas de IL-9 do intestino infectado por N. brasiliensis. Além disso, estabelecemos a cinética da IL-9 a partir de diferentes fontes celulares e locais anatômicos durante toda a infecção.
Caracterizar as distintas populações celulares envolvidas nesta infecção é vital para uma compreensão mais ampla da resposta imune ao parasita e sua interação com o hospedeiro. Este protocolo abrangente fornece uma rota clara para isolar e analisar células produtoras de IL-9 dos órgãos desejados em estágios de doença de interesse, permitindo uma melhoria acentuada do conhecimento sobre o papel dessas células na infecção por N. brasiliensis e infecções parasitárias em geral.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma compreensão completa das interações parasita-hospedeiro intestinal e das respostas imunes à infecção por helmintos requer a identificação e análise das diferentes populações celulares e moléculas efetoras que são fundamentais para a indução da remodelação tecidual e expulsão de vermes. As infecções por helmintos transmitidas pelo solo representam um grande problema nos países em desenvolvimento em todo o mundo. No entanto, até recentemente, nãoestava disponível um proto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a José Luis Ramos-Balderas pelo seu apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pela seguinte subvenção à PLL da CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P e EO-M receberam uma bolsa da CONACYT (736162 e 481437, respectivamente). MCM-M recebeu uma bolsa da CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).
Materials
| ACK buffer | Homemade | ||
| Attune Nxt cytometer | Thermofisher | ||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 | Biolegend | 100404 | |
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | Specific activity: ≥10 000 units/mg |
| Facs ARIA II sorter | BD Biosciences | ||
| FACS Melody cell sorter | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| FcεRI | eBioscience | 13589885 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | Flow cytometry analysis data software | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Homemade | ||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108704 | |
| Nylon mesh | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Phosphate-buffered saline | Homemade | ||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Streptavidin | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-γδ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tricine buffer | Homemade | ||
| Zombie Aqua Fixable Viability Dye | Biolegend | 423101 |
References
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