Summary

אסטרטגיה לחקר תאי לימפה מייצרי IL-9 במודל זיהום Nippostrongylus brasiliensis

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

תאי T ו-ILC2 המבטאים IL-9 מושרים במהלך זיהום ב-N. brasiliensis , אך האפיון שלהם התעלם במידה רבה במעי הנגוע בשל התדירות הנמוכה והקינטיקה הדיפרנציאלית שלהם. פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאים אלה מאיברי מטרה שונים ואישור זהותם באמצעות ציטומטריית זרימה בשלבי זיהום שונים.

Abstract

IL-9 הוא ציטוקין פליוטרופי הקשור לתהליכים שונים, כולל חסינות אנטי-סרטנית, השראת פתולוגיות אלרגיות והתגובה החיסונית נגד זיהומי הלמינת’ס, שם הוא ממלא תפקיד חשוב בגירוש הטפיל. במודל מוריני של זיהום Nippostrongylus brasiliensis, IL-9 מיוצר בעיקר על ידי לימפוציטים מסוג CD4+ T ותאי לימפה מולדים הנמצאים בריאה, במעי הדק ובבלוטות הלימפה המנקזות. בהתחשב בקשיים הטכניים הכרוכים בצביעה תוך-תאית של IL-9, כמו גם המורכבות של בידוד תאים המטופויטיים מהמעי הדק בעת זיהום, יש צורך דחוף בפרוטוקול מקיף אך פשוט לניתוח הביטוי של IL-9 ברקמות לימפואידיות ולא לימפואידיות שונות במודל זה. הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את הקינטיקה של IL-9 המיוצרת על ידי תאי T CD4+ ותאי לימפה מולדים בריאה ובמעי הדק, האיברים העיקריים הממוקדים על ידי N. brasiliensis, כמו גם בבלוטות הלימפה mediastinal ו mesenteric, לאורך כל הזיהום. בנוסף, הוא מפרט את מספר הזחלים הדרושים לזיהום, בהתאם לסוג התא והאיבר המעניין. פרוטוקול זה נועד לסייע בסטנדרטיזציה של בדיקות כדי לחסוך זמן ומשאבים על ידי מתן הזדמנות להתמקד בתאים, איברים ושלבי מחלה ספציפיים של עניין במודל זיהום N. brasiliensis.

Introduction

תולעי קרס הן טפילי מעיים המדביקים כ-700 מיליון בני אדם ברחבי העולם, בעיקר באזורים טרופיים במדינות לא מפותחות. זיהומים בעוצמה גבוהה עם Ancylostoma duodenale ו – Necator americanus, טפילי תולעי הקרס הנפוצים ביותר בבני אדם, גורמים לאנמיה ומחסור בחלבון שעלולים לגרום לעיכוב בגדילה ובהתפתחות הנפשית1. N. americanus וטפיל המכרסם Nippostrongylus brasiliensis גורמים לתגובה חיסונית טיפוסית מסוג 2 אצל הפונדקאי שלהם וחולקים קווי דמיון במחזור החיים שלהם. לפיכך, זיהום של עכברים עם N. brasiliensis הוא המודל הנפוץ ביותר עבור זיהומים תולעי קרס אנושיים. שלב 3 (L3) זחלים זיהומיים N. brasiliensis עוברים מהעור לריאה בשעות הראשונות שלאחר ההדבקה. ברגע שהם בריאה, הם הופכים ל-L4 ונודדים במעלה קנה הנשימה כדי להיבלע, לעבור דרך הקיבה ולהגיע למעיים כדי להפוך למבוגרים (L5) תוך 4-5 ימים. במעיים, תולעי L5 מטילות ביצים המופרשות בצואה כדי להפעיל מחדש את מחזור החיים של הטפיל2.

התגובה החיסונית הנגרמת על ידי N. brasiliensis מאופיינת על ידי עלייה במספר ציטוקינים מסוג 2, כולל IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 ו- IL-13, יחד עם אאוזינופיליה, בזופיליה, היפרפלזיה של גביע ותאי פיטום, וייצור מוגבר של IgG1 ו- IgE. רוב המחקרים המנסים לזהות ולהגדיר את התגובות החיסוניות המתעוררות על זיהום N. brasiliensis מתמקדים בתפקיד של IL-4 או IL-13 במודל זה3. עם זאת, הזיהוי והאפיון של תאים המבטאים IL-9 ותפקודו של ציטוקין זה התעלמו במידה רבה, עד שליקונה-לימון ועמיתיו פרסמו את המחקר הראשון שהוכיח תפקיד קריטי עבור IL-9 בתגובה החיסונית נגד N. brasiliensis. באמצעות עכברי דיווח, מחקר זה תיאר תאי T (בעיקר T עוזר 9) ותאי לימפה מולדים מסוג 2 (ILC2s) כתת-קבוצות התאיות העיקריות המבטאות IL-9 בעת זיהום4.

בידוד ואפיון של תאי מערכת החיסון מריאות נגועות בהלמינת’ס הוא אפשרי, ודווח בהרחבה 3,4. עם זאת, בגלל שיפוץ הרקמה האינהרנטית וייצור הריר, לעשות זאת במעיים הנגועים התגלה כאתגר טכני, עד לפרסום האחרון של Ferrer-Font et al.5. הקבוצה התוותה פרוטוקול לבידוד וניתוח תרחיפים חד-תאיים של תת-קבוצות חיסוניות ממעי מורין נגועים בפוליגירוס Heligmosomoides. בהתבסס על זה, יש לנו עכשיו סטנדרטיזציה פרוטוקול לבידוד וניתוח ציטוטומטרי של תאי לימפה המבטאים IL-9 מן המעי נגוע N. brasiliensis. בנוסף, ביססנו קינטיקה IL-9 ממקורות תאיים שונים וממיקומים אנטומיים שונים במהלך הזיהום.

אפיון אוכלוסיות התאים השונות המעורבות בזיהום זה חיוני להבנה רחבה יותר של התגובה החיסונית לטפיל והאינטראקציה שלו עם הפונדקאי. פרוטוקול מקיף זה מספק מסלול ברור לבידוד וניתוח תאים מייצרי IL-9 מאיברים רצויים בשלבי מחלה, ומאפשר שיפור חד של הידע על תפקידם של תאים אלה בזיהום N. brasiliensis ובזיהומים טפילים בכלל.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה הפנימית לטיפול בבעלי חיים (CICUAL) של המכון לפיזיולוגיה תאית, האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו. הערה: תרשים זרימה של הפרוטוקול כולו מוצג באיור 1. 1. דיור של עכברים השתמ?…

Representative Results

לעכברים הוזרקו תת עורית 200 זחלי L3 שלב N. brasiliensis , או PBS לבקרות דמה. מספר הזחלים המשמשים בפרוטוקול זה הותאם על מנת לבודד תאים בני קיימא מהריאות, מרקמת הלימפה ומהמעי הדק, בניגוד לדיווחים קודמים שבהם נעשה שימוש בעומסים גבוהים יותר של תולעים כדי לאתר תאים ברקמות הלימפה ובריאות, רק4</…

Discussion

הבנה מלאה של אינטראקציות טפיל-מארח במעי ותגובות חיסוניות לזיהום הלמינת’ס דורשת זיהוי וניתוח של אוכלוסיות התאים השונות ומולקולות ההשפעה שהן המפתח להשראת עיצוב מחדש של רקמות וסילוק תולעים. זיהומי הלמינת’ס המועברים בקרקע מהווים בעיה גדולה במדינות מתפתחות ברחבי העולם. עם זאת, עד לאחרונה, פרו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לחוסה לואיס ראמוס-בלדראס על תמיכתו הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי המענק הבא ל- PLL מ- CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P ו-EO-M קיבלו מלגה מ-CONACYT (736162 ו-481437, בהתאמה). MCM-M קיבל מלגה מ- CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. . Parasites – Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

Play Video

Cite This Article
Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

View Video