Summary

ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス感染モデルにおけるIL-9産生リンパ系細胞研究戦略

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

IL-9発現TおよびILC2細胞は、 N. brasiliensis 感染中に誘導されますが、その特性評価は、その低頻度および異なる動態のために、感染した腸ではほとんど見過ごされてきました。このプロトコルは、異なる標的臓器からのこれらの細胞の単離と、異なる感染段階でのフローサイトメトリー による それらの同一性の確認について説明しています。

Abstract

IL-9は、抗腫瘍免疫、アレルギー病理の誘導、および寄生虫の排除に重要な役割を果たす蠕虫感染に対する免疫応答を含む様々な過程に関連する多面的サイトカインである。 ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス 感染症のマウスモデルでは、IL-9は主に肺、小腸、排液リンパ節に見られるCD4+ Tリンパ球と自然リンパ球によって産生されます。IL-9の細胞内染色に伴う技術的な困難、および感染時に小腸から造血細胞を単離することの複雑さを考えると、このモデルの異なるリンパ組織および非リンパ組織におけるIL-9の発現を分析するための包括的で簡単なプロトコルが差し迫っています。ここで説明するプロトコルは、CD4+ T細胞と自然リンパ球細胞によって産生されるIL-9の動態を概説しています 肺と小腸、ブラ ジリエンシス菌の標的となる主な臓器、ならびに縦隔と腸間膜リンパ節で、感染全体を通して。さらに、細胞の種類と目的の臓器に応じて、感染に必要な幼虫の数を詳しく説明します。このプロトコルは、 N. brasiliensis 感染モデルで関心のある特定の細胞、臓器、および疾患段階に焦点を当てる機会を提供することにより、時間とリソースを節約するためのアッセイの標準化を支援することを目的としています。

Introduction

鉤虫は、主に発展途上国の熱帯地域で、世界中で約7億人に感染する腸内寄生虫です。ヒトで最も一般的な鉤虫寄生虫である 十二指腸下腺腫ネクターアメリカヌスによる高強度感染症は、貧血とタンパク質欠乏症を引き起こし、成長と精神発達の遅延を引き起こす可能性があります1N. americanus とげっ歯類の寄生虫 Nippostrongylus brasiliensis は、宿主にプロトタイプの2型免疫応答を誘導し、ライフサイクルの類似点を共有しています。したがって、 N.ブラジリエンシス によるマウスの感染は、ヒト鉤虫感染の最も一般的に使用されるモデルです。ステージ3(L3) N.ブラジリエンシス 感染性幼虫は、感染後最初の数時間で皮膚から肺に移動します。肺に入ると、L4になり、気管を上って飲み込み、胃を通過し、腸に到達して4〜5日以内に成人(L5)になります。腸内では、L5ワームが糞便中に排泄される卵を産み、寄生虫のライフサイクルを再開します2

N. brasiliensisによって誘導される免疫応答は、好酸球増加症、好塩基球増加症、杯および肥満細胞の過形成、ならびにIgG1およびIgE産生の増加とともに、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、およびIL-13を含むいくつかのタイプ2サイトカインの増加によって特徴付けられる。N. brasiliensis感染時に誘発される免疫応答を特定および定義しようとする研究のほとんどは、このモデル3におけるIL-4またはIL-13の役割に集中しています。しかし、IL-9発現細胞の同定と特性評価、およびこのサイトカインの機能はほとんど見過ごされていましたが、Licona-Limónらは、N.ブラジリエンシスに対する免疫応答におけるIL-9の重要な役割を示す最初の研究を発表しました。レポーターマウスを用いて、この研究では、感染時にIL-9を発現する主要な細胞サブセットとして、T細胞(主にTヘルパー9)および2型自然リンパ系細胞(ILC2)について説明しました4

蠕虫感染肺からの免疫細胞の単離と特性評価は実行可能であり、広く報告されています3,4。しかし、固有の組織リモデリングと粘液産生のために、感染した腸でそうすることは、Ferrer-Fontらの最近の発表まで技術的な課題であることが証明されました5。このグループは、ヘリグモソモイデスポリギラスに感染したマウス腸からの免疫サブセットの単一細胞懸濁液を単離および分析するためのプロトコルの概要を説明しました。それに基づいて、我々は現在、N. brasiliensis感染腸からのIL-9発現リンパ系細胞の単離およびサイトメトリー分析のためのプロトコルを標準化しました。さらに、感染中のさまざまな細胞源および解剖学的位置からのIL-9動態を確立しました。

この感染に関与する異なる細胞集団を特徴付けることは、寄生虫に対する免疫応答および宿主との相互作用をより広く理解するために不可欠です。この包括的なプロトコルは、目的の疾患段階で目的の臓器からIL-9産生細胞を分離および分析するための明確なルートを提供し、 ブラジリエンス菌 感染症および寄生虫感染全般におけるこれらの細胞の役割に関する知識の大幅な向上を可能にします。

Protocol

ここに記載されているすべての動物実験は、メキシコ国立自治大学細胞生理学研究所の動物取り扱い内部委員会(CICUAL)によって承認されました。 メモ: プロトコル全体のフローチャートを 図1に示します。 1.マウスの飼育 8〜10週齢の雌または雄のマウス群を使用し、12時間の明暗サイクルで一定の温度と湿度?…

Representative Results

マウスに200匹のL3ステージ のN.ブラジリエンシス 幼虫、または偽対照用のPBSを皮下注射しました。このプロトコルで使用される幼虫の数は、リンパ組織および肺の細胞を検出するために高負荷のワームが使用された以前の報告とは異なり、肺、リンパ組織、および小腸から生細胞を分離するために調整されました4。肺、縦隔リンパ節、腸間膜リンパ節、および小腸は…

Discussion

腸の寄生虫と宿主の相互作用と蠕虫感染に対する免疫応答を完全に理解するには、組織のリモデリングと線虫の排出の誘導に鍵となるさまざまな細胞集団とエフェクター分子の同定と分析が必要です。土壌伝染性蠕虫感染症は、世界中の発展途上国で大きな問題となっています。しかし、最近まで、この感染症の影響を受ける主な臓器である小腸に存在する希少細胞集団の分析を可能にする?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、ホセ・ルイス・ラモス・バルデラスの技術サポートに感謝したいと思います。この研究は、CONACYTからPLLへの以下の助成金(FORDECYT-PRONACE-303027)によってサポートされました。OM-PとEO-MはCONACYTからフェローシップを受けました(それぞれ736162と481437)。MCM-MはCONACYTからフェローシップを受けました(Estancias Posdoctorales por México 2022 (3))。

Materials

ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

References

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Cite This Article
Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

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