Summary

Eine Strategie für die Untersuchung von IL-9-produzierenden lymphatischen Zellen im Nippostrongylus brasiliensis-Infektionsmodell

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

IL-9-exprimierende T- und ILC2-Zellen werden während einer N. brasiliensis-Infektion induziert, ihre Charakterisierung wurde jedoch im infizierten Darm aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und differentiellen Kinetik weitgehend übersehen. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung dieser Zellen aus verschiedenen Zielorganen und die Bestätigung ihrer Identität mittels Durchflusszytometrie in verschiedenen Infektionsstadien.

Abstract

IL-9 ist ein pleiotropes Zytokin, das mit verschiedenen Prozessen assoziiert ist, einschließlich der Antitumorimmunität, der Induktion allergischer Pathologien und der Immunantwort gegen Helmintheninfektionen, wo es eine wichtige Rolle bei der Vertreibung des Parasiten spielt. In einem murinen Modell der Nippostrongylus brasiliensis-Infektion wird IL-9 hauptsächlich von CD4+ T-Lymphozyten und angeborenen lymphatischen Zellen produziert, die in der Lunge, im Dünndarm und in drainierenden Lymphknoten vorkommen. Angesichts der technischen Schwierigkeiten, die mit der intrazellulären Färbung von IL-9 verbunden sind, sowie der Komplexität der Isolierung hämatopoetischer Zellen aus dem Dünndarm nach einer Infektion besteht ein dringender Bedarf an einem umfassenden, aber unkomplizierten Protokoll zur Analyse der Expression von IL-9 in verschiedenen lymphatischen und nicht-lymphatischen Geweben in diesem Modell. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Kinetik von IL-9, die von CD4+ T-Zellen und angeborenen lymphatischen Zellen in der Lunge und im Dünndarm, den Hauptorganen, auf die N. brasiliensis abzielt, sowie in den mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten während der gesamten Infektion produziert wird. Darüber hinaus gibt es die Anzahl der Larven an, die für die Infektion benötigt werden, abhängig vom Zelltyp und dem interessierenden Organ. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Standardisierung von Assays zu unterstützen, um Zeit und Ressourcen zu sparen, indem es die Möglichkeit bietet, sich auf die spezifischen Zellen, Organe und Krankheitsstadien zu konzentrieren, die im N. brasiliensis-Infektionsmodell von Interesse sind.

Introduction

Hakenwürmer sind Darmparasiten, die weltweit etwa 700 Millionen Menschen infizieren, meist in tropischen Gebieten in unterentwickelten Ländern. Hochintensive Infektionen mit Ancylostoma duodenale und Necator americanus, den häufigsten Hakenwurmparasiten beim Menschen, verursachen Anämie und Proteinmangel, die zu verzögertem Wachstum und geistiger Entwicklung führen können1. N. americanus und der Nagetierparasit Nippostrongylus brasiliensis induzieren in ihrem Wirt eine prototypische Typ-2-Immunantwort und weisen Ähnlichkeiten in ihrem Lebenszyklus auf. Daher ist die Infektion von Mäusen mit N. brasiliensis das am häufigsten verwendete Modell für menschliche Hakenwurminfektionen. Stadium 3 (L3) infektiöse Larven von N. brasiliensis wandern in den ersten Stunden nach der Infektion von der Haut in die Lunge. Sobald sie in der Lunge sind, werden sie zu L4 und wandern die Luftröhre hinauf, um verschluckt zu werden, den Magen zu passieren und den Darm zu erreichen, um innerhalb von 4-5 Tagen erwachsen zu werden (L5). Im Darm legen L5-Würmer Eier, die mit dem Kot ausgeschieden werden, um den Lebenszyklus des Parasiten neu zu starten2.

Die durch N. brasiliensis induzierte Immunantwort ist gekennzeichnet durch einen Anstieg mehrerer Typ-2-Zytokine, darunter IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 und IL-13, zusammen mit Eosinophilie, Basophilie, Becher- und Mastzellhyperplasie und erhöhter IgG1- und IgE-Produktion. Die meisten Studien, die versuchen, die Immunantworten zu identifizieren und zu definieren, die bei einer Infektion mit N. brasiliensis ausgelöst werden, konzentrieren sich auf die Rolle von IL-4 oder IL-13 in diesem Modell3. Die Identifizierung und Charakterisierung von IL-9-exprimierenden Zellen und die Funktion dieses Zytokins wurden jedoch weitgehend übersehen, bis Licona-Limón et al. die erste Studie veröffentlichten, die eine entscheidende Rolle von IL-9 bei der Immunantwort gegen N. brasiliensis zeigte. Unter Verwendung von Reportermäusen wurden in dieser Studie T-Zellen (meist T-Helfer 9) und angeborene lymphatische Typ-2-Zellen (ILC2s) als die wichtigsten zellulären Untergruppen beschrieben, die IL-9 bei einer Infektion exprimieren4.

Die Isolierung und Charakterisierung von Immunzellen aus Helminthen-infizierten Lungen ist machbar und wurde ausführlich beschrieben 3,4. Aufgrund des inhärenten Gewebeumbaus und der Schleimproduktion erwies sich dies im infizierten Darm jedoch als technische Herausforderung, bis zur jüngsten Veröffentlichung von Ferrer-Font et al.5. Die Gruppe skizzierte ein Protokoll zur Isolierung und Analyse von Einzelzellsuspensionen von Immununtergruppen aus Heligmosomoides polygyrus-infizierten murinen Därmen. Darauf aufbauend haben wir nun ein Protokoll zur Isolierung und zytometrischen Analyse von IL-9-exprimierenden lymphatischen Zellen aus dem mit N. brasiliensis infizierten Darm standardisiert. Darüber hinaus haben wir die IL-9-Kinetik aus verschiedenen zellulären Quellen und anatomischen Lokalisationen während der gesamten Infektion festgestellt.

Die Charakterisierung der verschiedenen Zellpopulationen, die an dieser Infektion beteiligt sind, ist entscheidend für ein breiteres Verständnis der Immunantwort auf den Parasiten und seiner Interaktion mit dem Wirt. Dieses umfassende Protokoll bietet einen klaren Weg zur Isolierung und Analyse von IL-9-produzierenden Zellen aus gewünschten Organen in interessierenden Krankheitsstadien, was eine deutliche Verbesserung des Wissens über die Rolle dieser Zellen bei N. brasiliensis-Infektionen und Parasiteninfektionen im Allgemeinen ermöglicht.

Protocol

Alle hier beschriebenen Tierversuche wurden vom Internal Committee for Animal Handling (CICUAL) des Instituts für Zellphysiologie der Nationalen Autonomen Universität von Mexiko genehmigt. HINWEIS: Ein Flussdiagramm des gesamten Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Unterbringung von Mäusen Verwenden Sie 8-10 Wochen alte, weibliche oder männliche Gruppen von Mäusen, die in Tiereinrichtungen mit ko…

Representative Results

Mäusen wurden subkutan 200 L3-Larven im Stadium N. brasiliensis oder PBS zur Scheinkontrolle injiziert. Die Anzahl der Larven, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurde angepasst, um lebensfähige Zellen aus der Lunge, dem lymphatischen Gewebe und dem Dünndarm zu isolieren, im Gegensatz zu früheren Berichten, in denen nur höhere Würmer zum Nachweis von Zellen in lymphatischen Geweben und Lungen verwendet wurden4. Lunge, mediastinale Lymphknoten, mesenteriale Lymphknoten und der…

Discussion

Ein vollständiges Verständnis der intestinalen Parasiten-Wirt-Interaktionen und Immunantworten auf Helmintheninfektionen erfordert die Identifizierung und Analyse der verschiedenen Zellpopulationen und Effektormoleküle, die für die Induktion des Gewebeumbaus und der Wurmvertreibung entscheidend sind. Bodenübertragene Helmintheninfektionen stellen in Entwicklungsländern auf der ganzen Welt ein großes Problem dar. Bis vor kurzem war jedoch kein Protokoll verfügbar, das die Analyse seltener Zellpopulationen im Dünn…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken José Luis Ramos-Balderas für seine technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch den folgenden Zuschuss an PLL von CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027) unterstützt. OM-P und EO-M erhielten ein Stipendium von CONACYT (736162 bzw. 481437). MCM-M erhielt ein Stipendium von CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

References

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Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

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