Eine Strategie für die Untersuchung von IL-9-produzierenden lymphatischen Zellen im Nippostrongylus brasiliensis-Infektionsmodell
Summary
IL-9-exprimierende T- und ILC2-Zellen werden während einer N. brasiliensis-Infektion induziert, ihre Charakterisierung wurde jedoch im infizierten Darm aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und differentiellen Kinetik weitgehend übersehen. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung dieser Zellen aus verschiedenen Zielorganen und die Bestätigung ihrer Identität mittels Durchflusszytometrie in verschiedenen Infektionsstadien.
Abstract
IL-9 ist ein pleiotropes Zytokin, das mit verschiedenen Prozessen assoziiert ist, einschließlich der Antitumorimmunität, der Induktion allergischer Pathologien und der Immunantwort gegen Helmintheninfektionen, wo es eine wichtige Rolle bei der Vertreibung des Parasiten spielt. In einem murinen Modell der Nippostrongylus brasiliensis-Infektion wird IL-9 hauptsächlich von CD4+ T-Lymphozyten und angeborenen lymphatischen Zellen produziert, die in der Lunge, im Dünndarm und in drainierenden Lymphknoten vorkommen. Angesichts der technischen Schwierigkeiten, die mit der intrazellulären Färbung von IL-9 verbunden sind, sowie der Komplexität der Isolierung hämatopoetischer Zellen aus dem Dünndarm nach einer Infektion besteht ein dringender Bedarf an einem umfassenden, aber unkomplizierten Protokoll zur Analyse der Expression von IL-9 in verschiedenen lymphatischen und nicht-lymphatischen Geweben in diesem Modell. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Kinetik von IL-9, die von CD4+ T-Zellen und angeborenen lymphatischen Zellen in der Lunge und im Dünndarm, den Hauptorganen, auf die N. brasiliensis abzielt, sowie in den mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten während der gesamten Infektion produziert wird. Darüber hinaus gibt es die Anzahl der Larven an, die für die Infektion benötigt werden, abhängig vom Zelltyp und dem interessierenden Organ. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Standardisierung von Assays zu unterstützen, um Zeit und Ressourcen zu sparen, indem es die Möglichkeit bietet, sich auf die spezifischen Zellen, Organe und Krankheitsstadien zu konzentrieren, die im N. brasiliensis-Infektionsmodell von Interesse sind.
Introduction
Hakenwürmer sind Darmparasiten, die weltweit etwa 700 Millionen Menschen infizieren, meist in tropischen Gebieten in unterentwickelten Ländern. Hochintensive Infektionen mit Ancylostoma duodenale und Necator americanus, den häufigsten Hakenwurmparasiten beim Menschen, verursachen Anämie und Proteinmangel, die zu verzögertem Wachstum und geistiger Entwicklung führen können1. N. americanus und der Nagetierparasit Nippostrongylus brasiliensis induzieren in ihrem Wirt eine prototypische Typ-2-Immunantwort und weisen Ähnlichkeiten in ihrem Lebenszyklus auf. Daher ist die Infektion von Mäusen mit N. brasiliensis das am häufigsten verwendete Modell für menschliche Hakenwurminfektionen. Stadium 3 (L3) infektiöse Larven von N. brasiliensis wandern in den ersten Stunden nach der Infektion von der Haut in die Lunge. Sobald sie in der Lunge sind, werden sie zu L4 und wandern die Luftröhre hinauf, um verschluckt zu werden, den Magen zu passieren und den Darm zu erreichen, um innerhalb von 4-5 Tagen erwachsen zu werden (L5). Im Darm legen L5-Würmer Eier, die mit dem Kot ausgeschieden werden, um den Lebenszyklus des Parasiten neu zu starten2.
Die durch N. brasiliensis induzierte Immunantwort ist gekennzeichnet durch einen Anstieg mehrerer Typ-2-Zytokine, darunter IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 und IL-13, zusammen mit Eosinophilie, Basophilie, Becher- und Mastzellhyperplasie und erhöhter IgG1- und IgE-Produktion. Die meisten Studien, die versuchen, die Immunantworten zu identifizieren und zu definieren, die bei einer Infektion mit N. brasiliensis ausgelöst werden, konzentrieren sich auf die Rolle von IL-4 oder IL-13 in diesem Modell3. Die Identifizierung und Charakterisierung von IL-9-exprimierenden Zellen und die Funktion dieses Zytokins wurden jedoch weitgehend übersehen, bis Licona-Limón et al. die erste Studie veröffentlichten, die eine entscheidende Rolle von IL-9 bei der Immunantwort gegen N. brasiliensis zeigte. Unter Verwendung von Reportermäusen wurden in dieser Studie T-Zellen (meist T-Helfer 9) und angeborene lymphatische Typ-2-Zellen (ILC2s) als die wichtigsten zellulären Untergruppen beschrieben, die IL-9 bei einer Infektion exprimieren4.
Die Isolierung und Charakterisierung von Immunzellen aus Helminthen-infizierten Lungen ist machbar und wurde ausführlich beschrieben 3,4. Aufgrund des inhärenten Gewebeumbaus und der Schleimproduktion erwies sich dies im infizierten Darm jedoch als technische Herausforderung, bis zur jüngsten Veröffentlichung von Ferrer-Font et al.5. Die Gruppe skizzierte ein Protokoll zur Isolierung und Analyse von Einzelzellsuspensionen von Immununtergruppen aus Heligmosomoides polygyrus-infizierten murinen Därmen. Darauf aufbauend haben wir nun ein Protokoll zur Isolierung und zytometrischen Analyse von IL-9-exprimierenden lymphatischen Zellen aus dem mit N. brasiliensis infizierten Darm standardisiert. Darüber hinaus haben wir die IL-9-Kinetik aus verschiedenen zellulären Quellen und anatomischen Lokalisationen während der gesamten Infektion festgestellt.
Die Charakterisierung der verschiedenen Zellpopulationen, die an dieser Infektion beteiligt sind, ist entscheidend für ein breiteres Verständnis der Immunantwort auf den Parasiten und seiner Interaktion mit dem Wirt. Dieses umfassende Protokoll bietet einen klaren Weg zur Isolierung und Analyse von IL-9-produzierenden Zellen aus gewünschten Organen in interessierenden Krankheitsstadien, was eine deutliche Verbesserung des Wissens über die Rolle dieser Zellen bei N. brasiliensis-Infektionen und Parasiteninfektionen im Allgemeinen ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein vollständiges Verständnis der intestinalen Parasiten-Wirt-Interaktionen und Immunantworten auf Helmintheninfektionen erfordert die Identifizierung und Analyse der verschiedenen Zellpopulationen und Effektormoleküle, die für die Induktion des Gewebeumbaus und der Wurmvertreibung entscheidend sind. Bodenübertragene Helmintheninfektionen stellen in Entwicklungsländern auf der ganzen Welt ein großes Problem dar. Bis vor kurzem war jedoch kein Protokoll verfügbar, das die Analyse seltener Zellpopulationen im Dünn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken José Luis Ramos-Balderas für seine technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch den folgenden Zuschuss an PLL von CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027) unterstützt. OM-P und EO-M erhielten ein Stipendium von CONACYT (736162 bzw. 481437). MCM-M erhielt ein Stipendium von CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).
Materials
| ACK buffer | Homemade | ||
| Attune Nxt cytometer | Thermofisher | ||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 | Biolegend | 100404 | |
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | Specific activity: ≥10 000 units/mg |
| Facs ARIA II sorter | BD Biosciences | ||
| FACS Melody cell sorter | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| FcεRI | eBioscience | 13589885 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | Flow cytometry analysis data software | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Homemade | ||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108704 | |
| Nylon mesh | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Phosphate-buffered saline | Homemade | ||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Streptavidin | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-γδ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tricine buffer | Homemade | ||
| Zombie Aqua Fixable Viability Dye | Biolegend | 423101 |
References
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