Una guía para examinar la formación de grasa intramuscular y su origen celular en el músculo esquelético

Todos los protocolos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Florida. 1. Rastreo genético del linaje de los FAPs NOTA: Si no se desea el rastreo genético del linaje de los FAP, se puede omitir el paso 1. Para realizar el rastreo de linaje de FAPs, obtenga los alelos de ratón necesarios.NOTA: Se han generado varias líneas de Cre inducibles por tamoxifeno, bajo el control del promotor Pdgfrα , para apuntar con éxito a los FAP, incluidos los laboratorios Hogan29, Rando27 y Bergles32 . Como reportero genético de la actividad de Cre, numerosos alelos reporteros Rosa26 están disponibles, como Rosa26EYFP33. Si bien se sugiere que cada laboratorio determine qué combinación cre-reportera es más efectiva, cruzando ratones PdgfrαCreERT2 (29 y Jax # 032770) al reportero Rosa26EYFP (33 y Jax # 006148), el PdgfrαCreERT2 resultante; Los ratonesRosa26 EYFPse pueden utilizar para marcar de manera eficiente y específica FAPs20. Para rastrear el destino de los FAP maduros, se recomienda esperar hasta que los ratones hayan alcanzado al menos ~ 10 semanas de edad antes de administrar tamoxifeno. Los experimentos de rastreo de linaje se pueden realizar tanto en machos como en hembras. Administración de tamoxifeno a través de gavaging oral Prepare 40 mg / ml de tamoxifeno en aceite de maíz y vórtice bien para mezclar 1 día antes de la gavaging. Incubar O/N a 37 °C en un horno de hibridación giratorio.PRECAUCIÓN: El tamoxifeno es un carcinógeno y debe manipularse con cuidado. Siempre use guantes cuando manipule y use una máscara cuando la pese como polvo, ya que existe el peligro de inhalación. Limpie el área de acuerdo con el protocolo y conecte una aguja de gavaging a una jeringa de 1 ml. Extraiga 200 μL de tamoxifeno en la jeringa. Scruff PdgfrαCreERT2 ; RatonesRosa26 EYFP (10 semanas de edad; ambos sexos utilizados) colocándolos sobre una superficie plana y agarrando firmemente la base de la cola. Use una mano libre para agarrar el centro del mouse con el pulgar y el dedo índice, luego suavemente y con una ligera presión deslice el agarre hasta que pase los hombros. Pellizque la piel hacia atrás con el pulgar y el dedo índice, levante el mouse y voltee la mano para que el mouse esté mirando hacia el usuario, y coloque la cola entre el dedo meñique y anular de la mano que sostiene el mouse. En este punto, asegúrese de que el ratón esté bien inmovilizado y no pueda mover la cabeza o los brazos. Inserte la aguja de gavaging en la boca y úsela para inclinar ligeramente la cabeza del mouse hacia atrás; esto permite que el esófago sea más accesible. Inserte la aguja con cuidado y lentamente en el esófago. No fuerce la aguja si se encuentra alguna resistencia; la aguja debe deslizarse hacia abajo fácilmente. Inyecte lentamente el tamoxifeno. Monitoree a los ratones durante 15-20 minutos para asegurarse de que no ocurran problemas durante el gavaging.NOTA: La administración de tamoxifeno en 2 días consecutivos generalmente resulta en ~ 75% -85% de eficiencia de recombinación de FAPs sin causar ningún efecto adverso. Se recomienda que el usuario espere 1-2 semanas antes de inducir la lesión, lo que permitirá que el tamoxifeno restante se elimine del sistema y que se entregue cualquier proteína restante. 2. Lesión del músculo tibial anterior (TA) NOTA: Para estudiar la grasa intramuscular, se recomienda utilizar un modelo de lesión a base de glicerol (50% de glicerol en solución salina estéril), lo que resulta en la formación masiva de grasa intramuscular 34,35,36,37. Prepare la máquina anestésica agregando isoflurano y asegurándose de que los tubos tanto de la cámara del ratón como del cono de la nariz estén abiertos. Limpie la cámara y el área de trabajo con etanol al 70% o solución de peróxido (dependiendo de los protocolos). Ajuste el caudal de oxígeno a 2,5 L/min y la concentración de isoflurano al 2,5%. Coloque un ratón en la cámara de anestesia y espere ~ 5 minutos para que sea anestesiado. Coloque el ratón en decúbito supino sobre una almohadilla térmica limpia e inserte la nariz en el cono de la nariz. Aplique suavemente ungüento oftálmico veterinario en los ojos con un aplicador con punta de algodón para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia. Controle continuamente la anestesia y realice un pellizco en el dedo del pie en el ratón antes de la lesión para asegurarse de que el ratón esté completamente anestesiado. Limpie la pierna para inyectarla con una toallita con alcohol fresco para desinfectar. Extraiga 30-50 μL de glicerol al 50% (dependiendo del tamaño de los ratones) en la jeringa de insulina. Cepille suavemente el cabello en la espinilla para exponer la ubicación de la AT.NOTA: Es más fácil mover el cabello y lograr una mejor visualización cuando todavía está mojado por la toallita con alcohol. Después de localizar la AT (justo lateral a la tibia, sobresale ligeramente a través de la piel y se puede sentir con una palpación suave), inserte la aguja en la TA distalmente, cerca del tobillo. Inserte completamente la aguja en el músculo e inyecte lentamente glicerol mientras retira gradualmente la aguja, lo que ayuda a lesionar la mayor parte del músculo.NOTA: Es mejor insertar la aguja paralela a la pierna, con solo un ángulo ligeramente elevado. Una buena lesión generalmente causa dorsiflexión a medida que la AT se contrae después de retirar la aguja. Si los dedos de los pies del ratón se extendieron, es probable que se inyectara el músculo extensor digitorum longus (EDL). Coloque el ratón de nuevo en la jaula y monitoree durante unos 15-20 minutos para garantizar la recuperación de la anestesia. Deseche la aguja en un recipiente para objetos punzantes. Nunca recapitule una aguja.NOTA: La analgesia después de la inyección de glicerol debe proporcionarse según lo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Los adipocitos se pueden observar tan pronto como 5 días después de la lesión (dpi). A los 7 dpi, todos los adipocitos se han formado, y a los 21 dpi, han madurado completamente. 3. Cosecha de tejidos Prepare 4% de PFA en 1x PBS y colóquelo en hielo antes de comenzar la cosecha. Coloque cualquier placa (12 o 24 pocillos) que se use para la fijación muscular en hielo y agregue 4% de PFA a cada pozo, asegurándose de que cada pozo tenga 10-20 veces más volumen de PFA que el tejido que se está fijando. Entre 7 y 21 días después de la lesión por glicerol, eutanasiar al ratón de acuerdo con las pautas institucionales (es decir, sobredosis de isoflurano seguida de dislocación cervical). Comience a cosechar cualquier tejido que se utilizará para la histología o el aislamiento de ARN.NOTA: Los tejidos deben congelarse a presión o colocarse en PFA dentro de los 10-15 minutos posteriores al sacrificio (Figura 2). Rocíe generosamente cualquier área del ratón que se corte con etanol al 70% para ayudar a mantener el cabello fuera del área de disección y los instrumentos. Use tijeras para cortar la piel alrededor de la parte superior de la pierna, cerca de la pelvis (Figura 3A). Tire suavemente de la piel de la pierna desde la parte superior hasta el tobillo (Figura 3B).NOTA: El TA es un músculo en forma de lágrima con un tendón distal claramente definido que se une al hueso cuneiforme medial y al primer metatarsiano. Es lateral a la tibia y se extiende hasta la parte inferior de la rodilla. Primero, retire la capa externa de tejido conectivo (epimisio) con pinzas de punta afilada antes de cosechar la TA (Figura 3C). Use un microscopio de disección para visualizar mejor el epimisio. Deslice las pinzas debajo de la TA desde la parte inferior del músculo, comenzando en el tendón distal, y tire suavemente hacia arriba hacia la rodilla (Figura 3D). Deténgase en el extremo del músculo; no empuje más allá de la resistencia que se siente en la parte inferior de la rodilla. Si hay una resistencia significativa antes de llegar a la parte inferior de la rodilla, deténgase y continúe eliminando las capas sobrantes de tejido conectivo.NOTA: Hay otro tendón distal justo lateral al tendón TA que se une al EDL, que es un músculo delgado lateral al TA. Tener cuidado de deslizar solo las pinzas debajo del tendón TA evita la recolección accidental del EDL, pero también se puede quitar fácilmente después de la fijación. Una vez que la AT se haya levantado parcialmente de la pierna con las pinzas, use el mismo movimiento con un bisturí para cortar la conexión de la TA a la parte inferior de la rodilla (Figura 3E). Corte el tendón en el tobillo con tijeras para eliminar completamente la AT. Solo maneje el músculo en el tendón para evitar dañar las fibras. Corte 1/3 de la TA en el extremo opuesto al tendón (Figura 3F), colóquela en un tubo de microcentrífuga y congele dejándola caer en nitrógeno líquido (Figura 3H). Sumergir los otros 2/3 del tejido en un pozo marcado con 4% de PFA para histología (Figura 3I). Asegúrese de realizar un seguimiento de cuándo se colocó el primer y último tejido en fijador. Colocar en una coctelera durante 2-2,5 h a 4 °C. La duración de la fijación depende del tejido y su tamaño. Determine la duración requerida para la fijación de los tejidos. La fijación de los AATT durante 2-2,5 h a 4 °C normalmente preserva bien la morfología de los adipocitos sin causar una fijación excesiva del tejido.NOTA: Si planea usar TA para la tinción inmunofluorescente de montaje completo, omita el resto de este protocolo hasta llegar a la Sección 7: “Tinción inmunofluorescente de montaje completo”. Después de la fijación, retire el PFA de los pocillos, enjuague los tejidos con 1x PBS frío 2-3 veces, y luego lave 2-3 veces con 1x PBS frío durante 5 min por lavado. Retire el PBS de los pocillos y agregue suficiente sacarosa al 30% en 1x PBS para permitir que el tejido flote. Colocar en la coctelera a 4 °C durante la noche. Figura 3: Resumen de la cosecha de tejidos. (A) La piel se corta en la base de la pierna y (B) los músculos de las extremidades posteriores están expuestos. (C) Una vez que se retira el epimisio de la AT, (D) se utilizan fórceps para separar parcialmente el músculo y garantizar que el epimisio se haya eliminado por completo. (E) La TA se corta de la pierna con un bisturí y se retira después de cortar el tendón. (G) Después de cortar el TA en una pieza de un tercio y dos tercios, (H) un tercio se congela a presión en nitrógeno líquido para el análisis RT-qPCR y (I) los otros dos tercios se fijan en PFA al 4% para histología. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 4. Incrustación Prepare los moldes de muestra que se utilizarán para incrustar etiquetando y llenando con suficiente medio de incrustación para sumergir completamente los tejidos. Retire los pañuelos de papel de los pozos, seque el exceso de sacarosa en una toalla de papel y muévase a los moldes de muestras llenos de medio de congelación.NOTA: Es útil saber en qué orientación se seccionará el molde en el criostato. De esta manera, el usuario puede orientar los tejidos en el molde de una manera que permita que el área de interés sea fácilmente accesible. Para el TA, esto se lograría colocando el extremo más grueso (opuesto al lado del tendón) frente a la superficie que se seccionará. Esto permite que la AT se seccione fácilmente en su parte más gruesa (vientre) y permite el corte transversal de las fibras musculares. Prepare una suspensión de isopentano sumergiendo parcialmente un recipiente que contenga isopentano en nitrógeno líquido. Asegúrese de que haya suficiente isopentano líquido en el recipiente para sumergir aproximadamente la mitad del molde de la muestra que se utilizará para incrustar los tejidos. Comience a congelar los moldes poniéndolos cuidadosamente en la suspensión de isopentano y asegurándose de que aproximadamente la mitad del molde esté sumergido. Además, asegúrese de que el moho se congele por igual desde los cuatro lados. Saque el molde del isopentano justo antes de que todo el molde se congele visiblemente desde la parte superior. La cantidad de tiempo que esto toma depende de los moldes que se utilizan. Mantenga los moldes congelados en un recipiente con hielo seco mientras congela el resto de los bloques, luego guárdelos a -80 ° C.NOTA: El isopentano para congelación se puede reutilizar. Póngalo en una botella de vidrio, pero no apriete la tapa hasta que el isopentano alcance la temperatura ambiente (RT). De lo contrario, el cambio en la presión podría romper la botella. 5. Seccionamiento Ajuste el criostato a -22 a -24 °C, agregue moldes que contengan TA en el criostato y espere un mínimo de 30 minutos para la aclimatación a la temperatura. Mientras tanto, etiquete una serie de portaobjetos de microscopio cargados positivamente. Inserte una placa estabilizadora y alinee con el criostato de tal manera que haya cortes mínimos en la placa donde hace contacto con el bloque de muestra. Seguro en su lugar. Inserte una cuchilla de criostato fresca en el soporte de la cuchilla y asegúrela en su lugar.PRECAUCIÓN: La cuchilla es afilada. Cubra la cuchilla cuando manipule otras partes del criostato o moldes congelados. Retire el bloque congelado del molde. Agregue una capa uniforme de medio de incrustación al mandril de criostato y coloque el bloque en el medio. Déjelo reposar durante 1-3 minutos hasta que el medio de incrustación esté completamente congelado (blanco opaco).NOTA: Para los TA, el área más gruesa (vientre) debe ser visible cuando está en el mandril. Coloque el mandril del criostato con el bloque de tejido en el criostato. Destapa la cuchilla y avanza el criostato hacia adelante hasta que entre en contacto con la cuchilla. Sección a través del bloque a secciones de 25 μm hasta que el tejido ya no esté oscurecido por el medio de incrustación.NOTA: Durante la sección, ajuste el ángulo del criostato y / o la posición de la etapa de tal manera que las secciones sean de espesor uniforme. Puede ser útil recolectar algunas secciones para garantizar la uniformidad en el grosor de la sección. Se recomienda que el usuario encuentre la posición adecuada de la placa antivuelco antes de seccionar a través de la región de interés dentro del TA (vientre), ya que esto permite al usuario probar varias posiciones de la placa antivuelco hasta que las secciones se desprendan rectas sin desperdiciar tejido. Cambie el grosor de la sección a 10-12 μm y recoja las secciones en portaobjetos de microscopio etiquetados. Se recomienda la seccionamiento en serie mediante la recolección de secciones adyacentes en 6-10 diapositivas (etiquetadas 1-x), lo que permite la tinción para múltiples marcadores. Si es necesario, use un pincel delgado para desenroscar las secciones antes de recogerlas en la diapositiva.NOTA: Si las secciones se están curvando, verifique que la temperatura se mantenga estable dentro del rango de -22 a -24 ° C. Si hay estrías verticales en las secciones, esto podría deberse a un corte en la placa estabilizadora o la cuchilla; esto se puede arreglar ajustando la posición de la placa estabilizadora y / o cambiando a una nueva cuchilla. Después de recolectar secciones adyacentes del mismo plano de seccionamiento en cada diapositiva, ajuste el grosor a 25 μm para avanzar 150-200 μm a través del bloque, luego ajuste el grosor a 10-12 μm y comience a seccionar nuevamente.NOTA: Esta sección en serie permite al usuario visualizar, visualizar y cuantificar a diferentes profundidades a través de la TA; tres o cuatro secciones en serie por diapositiva es suficiente. Guarde los portaobjetos y los bloques de tejido a -80 °C. 6. Tinción inmunofluorescente (IF) de secciones de tejido NOTA: Como las concentraciones de anticuerpos pueden variar entre lotes y fabricantes, se recomienda la optimización mediante la evaluación de varias concentraciones diferentes de los anticuerpos en las diapositivas de prueba antes de teñir las diapositivas de interés. Descongelar/secar los toboganes a RT o en una placa caliente a 37 °C durante 10-20 min. Use un bolígrafo hidrófobo para dibujar una línea en el borde de la superficie de papel de la diapositiva, donde se encuentra con el vidrio. Coloque las diapositivas en un frasco de Coplin y lave con 1x PBS + 0.1% Tween20 (PBST) 3-5x en una coctelera durante al menos 5 minutos por lavado para rehidratar las secciones de tejido.NOTA: En este punto, es importante no dejar que los portaobjetos se asienten sin estar sumergidos en PBST (hasta la línea hidrofóbica), o las secciones de tejido se secarán. Coloque los portaobjetos en el bastidor de una cámara humidificadora y superponga los portaobjetos con 310-350 μL de solución de bloqueo (5% de suero de burro y 0.3% de Tritón X-100 en 1x PBS) durante 1-2 h en RT.NOTA: No se necesita ningún paso de permeabilización adicional, ya que la solución de bloqueo contiene 0.3% Triton X-100, lo que permite una permeabilización suficiente de las secciones de tejido. Cuando se utilizan anticuerpos primarios derivados de ratones (es decir, PAX7 y MYOD1 enumerados a continuación), se recomienda incluir un paso de bloqueo de ratón sobre ratón utilizando fragmentos Fab (1:50) en la solución de bloqueo para el paso de bloqueo. Esto ayudará a reducir el fondo debido a la unión inespecífica del anticuerpo secundario del ratón a anticuerpos distintos del primario. Diluya los anticuerpos primarios que se utilizarán en la solución de bloqueo poco antes de pasar al siguiente paso de la siguiente manera: Anticuerpos primarios para la tinción de adipocitos e imágenes de sección completa: Diluir anti-perilipina de conejo a una relación de dilución de 1:1000. Anticuerpos primarios para el rastreo del linaje de los adipocitos: Diluir el pollo anti-GFP en una proporción de 1:1000 y el anti-perilipina de conejo en 1:1000. Anticuerpos primarios para el rastreo del linaje de FAPs: Diluir pollo anti-GFP en una proporción de 1:1000 y anti-PDGFRα de cabra en 1:250. Anticuerpos primarios para marcadores miogénicos: Diluir anti-PAX7 de ratón en una proporción de 1:25 o anti-MYOD1 de ratón en 1:250, y anti-LAMININA de conejo en 1:1000.NOTA: Si bien los anticuerpos enumerados anteriormente se han evaluado con éxito con este protocolo, es probable que otros marcadores y anticuerpos para etiquetar FAPs, adipocitos y / u otros tipos de células también sean compatibles con este protocolo. Se recomienda encarecidamente cuando se usan anticuerpos primarios por primera vez que el usuario incluya una diapositiva de control negativa, en la que se omiten los anticuerpos primarios. Esto controlará la especificidad de los anticuerpos. Se siguen todos los demás pasos del protocolo, incluida la adición de anticuerpos secundarios, pero la solución de bloqueo se usa sola en el siguiente paso en lugar del anticuerpo primario en la solución de bloqueo. Vierta la solución de bloqueo de las diapositivas y colóquela con 310-350 μL de solución de bloqueo con anticuerpos primarios e incube durante la noche a 4 °C en la cámara humidificadora. Al día siguiente, vierta la solución de bloqueo / anticuerpos primarios de las diapositivas y colóquelos en un frasco de Coplin. Enjuague las diapositivas 2-3 veces con PBST y lave 3-5x con PBST en un agitador durante al menos 5 minutos por lavado. Durante el último lavado, prepare los anticuerpos secundarios o cualquier conjugado directo que se utilizará en la solución de bloqueo. Minimice la cantidad de tiempo que estos anticuerpos pasan a la luz para evitar el fotoblanqueo. Anticuerpos secundarios diluidos/conjugados directos: 488 nm burro anti-pollo (1:1000) o anti-conejo (1:1000) o anti-ratón (1:1000), burro de 568 nm anti-cabra (1:1000) o anti-conejo (1:1000) o faloidina (miofiberes; 1:100), tinción DAPI (núcleos; 1:500). Superponga las diapositivas con 310-350 μL de la solución de bloqueo con anticuerpos secundarios y/o conjugados directos en la cámara humidificadora. Incubar en RT durante 1-2 h. Proteja las muestras de la luz a partir de ahora. Vierta la solución de bloqueo/anticuerpos secundarios y colóquelos en un frasco de Coplin. Enjuague con PBST una vez y lave 3-5 veces con PBST en una coctelera durante al menos 5 minutos por lavado. Mantenga el frasco de Coplin cubierto para evitar la exposición a la luz. Seque los toboganes lo mejor posible golpeando los bordes y limpiando la espalda contra una toalla de papel, pero no deje que las secciones de tejido se sequen. Agregue tres o cuatro gotas de medio de montaje acuoso al borde horizontal superior de la diapositiva y agregue suavemente un deslizamiento. No presione hacia abajo ni se mueva si se forman burbujas de aire debajo de la cubierta; cualquier presión o movimiento puede distorsionar la frágil arquitectura celular de los adipocitos. Permita que el medio de montaje se ajuste en la oscuridad durante la noche antes de la toma de imágenes. 7. Tinción inmunofluorescente de montaje completo Después de ~ 1 h de fijación (consulte el paso 3.14), use pinzas de punta afilada para despegar las miofiberes de la TA fija. Coloque las fibras separadas en una placa de 24 pocillos y lave 3 veces durante 3 minutos cada una con PBST. Para todas las incubaciones posteriores, asegúrese de agregar la tapa para evitar la evaporación. Incubar durante 1 h en Tritón X-100 al 1% en 1x PBS a RT (200-300 μL) en un agitador para permitir una mejor penetración de anticuerpos. Después de enjuagar varias veces con PBST, superponga con solución de bloqueo (200-300 μL) y bloquee en un nutator o agitador durante la noche a 4 ° C. Diluir los anticuerpos primarios a la concentración deseada (duplicar la concentración tiende a ser un buen punto de partida) en la solución de bloqueo. Incubar las muestras (200-300 μL) en un nutator o agitador durante la noche a 4 °C. Lave las muestras rigurosamente con PBST durante todo el día con cambios frecuentes en RT en el agitador, aproximadamente 4-6x durante 30-60 min cada lavado. Diluir los anticuerpos secundarios en la solución de bloqueo a la concentración deseada (1:500 tiende a funcionar bien) más la tinción nuclear e incubar las muestras (200-300 μL) en un nutator o agitador durante la noche a 4 °C. Lave las muestras rigurosamente con PBST durante todo el día con cambios frecuentes en RT en el agitador, aproximadamente 4-6 veces durante 30-60 minutos cada lavado o lave durante la noche a 4 ° C. Para montar, seque suavemente el exceso de PBST y luego coloque las fibras en una o dos gotas de medio de montaje en un portaobjetos de vidrio (Figura 4A). Para elevar el lape de cubierta (18 mm x 18 mm), agregue pequeños pies de arcilla; esto evitará que las fibras se aplasten y asegurará la cubierta a la corredera. Los compuestos de modelado funcionan bien para esto. Una vez que el coverlip esté asegurado, agregue más medio al borde hasta que el área debajo del coverslip esté llena.NOTA: En lugar de utilizar un medio de montaje que contenga agentes antidesvanecimiento, el tejido también se puede mover a través de una serie ascendente de glicerol (30% a 80% de glicerol en PBS). Espere 1-2 días antes de la toma de imágenes para permitir el curado del medio de montaje. 8. Imágenes de grasa intramuscular Encienda el microscopio e inicie el software de imágenes. Asegure la diapositiva en el escenario.NOTA: Para obtener imágenes de adipocitos en secciones musculares, un objetivo de 5x o 10x combinado con microscopía de campo ancho a menudo es suficiente. Para visualizar WM-IF, se requiere un microscopio confocal. Utilice cualquier canal para identificar el área a la que se va a crear una imagen. En el software de imágenes, ajuste el tiempo de ganancia y exposición para cada canal. Tome imágenes de todo el tejido en cada canal (automático o manual de acuerdo con el microscopio y el software utilizado) y fusione mosaicos individuales para hacer un compuesto de la sección transversal completa de TA.NOTA: Se recomienda tomar imágenes de dos o tres secciones diferentes de la misma AT a diferentes profundidades. Al cuantificar los adipocitos en cada sección y luego informar el promedio, se evitarán las diferencias localizadas en la cantidad de grasa intramuscular debido, por ejemplo, a errores de inyección. 9. Cuantificación de los adipocitos Si no está instalado previamente, agregue el complemento Cell Counter a ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). Importe las imágenes a ImageJ como archivos TIF o archivos de microscopio originales. Vea cada canal en ImageJ como un archivo TIF independiente.NOTA: Si utiliza LIF o tipos de archivo de microscopio similares, en Opciones de importación de bioformatos , elija Hyperstack para Ver pila con y marque la casilla de Canales divididos. Haga clic en Aceptar para abrir el archivo. Además, asegúrese de que la casilla Escala automática no esté marcada. Asegúrese de que las imágenes de cada canal estén en formato de 8 bits (y gris): > de imagen Tipo > 8 bits. Combinar imágenes DAPI (azul), GFP (verde), PERILIPIN (rojo) y PHALLOIDIN (gris): Imagen > Color > Combinar canales. Compruebe que la escala (Analizar > Establecer escala) está en micras. Usando la herramienta de selección a mano alzada, describa la parte lesionada y no lesionada de cada sección transversal, luego mida (Analizar > Medir) y registre el área lesionada vs. no lesionada en una hoja de cálculo.NOTA: El músculo lesionado se puede identificar como áreas desprovistas de miofibras o áreas pobladas por miofibras que contienen núcleos ubicados centralmente. Iniciar contador de celdas: plugins > CellCounter > inicializar. Seleccione un tipo de contador y, a continuación, cuente cada adipocito. Registre el número total de adipocitos en una hoja de cálculo, luego calcule el número de adipocitos por 1 mm2 del área lesionada. 10. Análisis de expresión génica adipogénica mediante RT-qPCR Aislamiento de ARN Antes de comenzar, precaliente el agua libre de RNasa a 45 °C y prepare EtOH fresco al 70% (350 μL por muestra). Añadir 1.000 μL de tiocianato de guanidio a cada tubo que contenga la muestra (ver paso 3.12.). Es importante que se utilicen tubos aprobados por batidores de cuentas.PRECAUCIÓN: El tiocianato de guanidio es tóxico. Use el equipo de protección personal adecuado y el mango en una campana extractora de humos. Agregue tres cuentas medianas o una cuenta grande y una pequeña a cada tubo. Homogeneizar el tejido a 50 Hz durante 2-4 min usando un batidor de cuentas. Dependiendo del tipo de tejido y el tamaño de la muestra, puede tardar hasta 10 minutos. Añadir 200 μL de cloroformo.PRECAUCIÓN: El cloroformo es tóxico. Use equipo de protección personal y mango en una campana extractora. Agitar las muestras durante 15 s. Incubar durante 2-3 min en RT. Centrifugadora durante 15 min a 12.000 x g. Pipetear 350 μL del sobrenadante transparente (capa superior que contiene el ARN) y agregar a un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene 350 μL de etanol al 70%. Tenga cuidado de no aspirar las capas inferiores de proteína y/o ADN Transfiera hasta 700 μL de la mezcla a una mini columna de centrifugado colocada en un tubo de recolección de 2 ml. Continúe con el aislamiento de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante. Elute con 30-50 μL de agua libre de RNasa, dependiendo del rendimiento esperado. Mantenga el ARN en hielo y mida el rendimiento con un espectrofotómetro. Mantenga el ARN almacenado a -80 °CNOTA: Es posible omitir el paso de tratamiento de la DNasa, ya que quitar cuidadosamente solo los 350 μL superiores de la capa de ARN es suficiente para prevenir la contaminación del ADN. Además del análisis RT-qPCR, el ARN aislado también se puede utilizar para la secuenciación del ARN, en cuyo caso se recomienda encarecidamente un paso de tratamiento con DNasa. Síntesis de ADNc Utilice hasta 1 μg de ARN para sintetizar ADNc con un kit de síntesis de ADNc, siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez completada la ejecución, agregue 80 μL de agua libre de RNasa. Conservar las muestras a -20 °C. RT-qPCR de genes selectivos de adipocitos. Usando un formato de 384 pocillos, agregue 1 μL de imprimación (~1 μM de concentración final) al fondo de cada pozo. Las imprimaciones previas al secado dan como resultado réplicas técnicas más ajustadas. Deje cubrir hasta que las imprimaciones se hayan evaporado por completo (la placa se puede colocar en un bloque calefactor ajustado a 37 ° C para acelerar la evaporación). Configure reacciones de muestra con cuatro a ocho réplicas técnicas de la siguiente manera: 2,5 μL de mezcla maestra de RT-PCR a base de colorante, 2,1 μL de agua libre de RNasa y 0,4 μL de ADNc (~1 ng) con 5 μL de volumen total por pozo. Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclo térmico: desnaturalización a 95 °C durante 15 s y anneal/extend a 60 °C durante 25 s durante 40 ciclos. Normalizar los valores brutos de CT (umbral de ciclo) a los niveles de genes de limpieza (es decir, Hprt y Pde12) calculando ΔΔCT como se describe aquí38. Véase20 para las secuencias de imprimación.NOTA: Se debe seguir la práctica estándar para el análisis RT-qPCR, como el uso de un control de transcripción inversa (-RT) menos, la reacción de PCR y la validación de imprimación.