Een gids voor het onderzoeken van intramusculaire vetvorming en de cellulaire oorsprong ervan in skeletspieren

Alle dierprotocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Florida. 1. Genetische afstamming van FAP’s OPMERKING: Als genetische afstamming van FAPs niet gewenst is, kan stap 1 worden overgeslagen. Om afstammingstracering van FAPs uit te voeren, moet u de benodigde muisallelen verkrijgen.OPMERKING: Verschillende tamoxifen-induceerbare Cre-lijnen, onder controle van de Pdgfrα-promotor , zijn gegenereerd om met succes FAP’s te targeten, waaronder van de Hogan29, Rando27 en Bergles32 laboratoria. Als genetisch verslaggever van Cre-activiteit zijn er talloze Rosa26-verslaggever-allelen beschikbaar, zoals Rosa26EYFP33. Hoewel het voor elk laboratorium wordt voorgesteld om te bepalen welke Cre-Reporter-combinatie het meest effectief is, door PdgfrαCreERT2-muizen (29 en Jax # 032770) te kruisen met de Rosa26EYFP (33 en Jax # 006148) -verslaggever, de resulterende PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFP-muizenkunnen worden gebruikt om FAPs20 efficiënt en specifiek te markeren. Om het lot van volwassen FAPs te traceren, wordt aanbevolen om te wachten tot muizen ten minste ~ 10 weken oud zijn voordat tamoxifen wordt toegediend. Afstammingstraceringsexperimenten kunnen worden uitgevoerd op zowel mannen als vrouwen. Toediening van tamoxifen door orale gavaging Bereid 40 mg / ml tamoxifen in maïsolie en vortex goed om 1 dag voor het gavagen te mengen. Incubeer O/N bij 37 °C in een roterende hybridisatieoven.LET OP: Tamoxifen is een carcinogeen en moet zorgvuldig worden behandeld. Draag altijd handschoenen bij het hanteren en draag een masker bij het wegen als poeder, omdat er gevaar is voor inademing. Reinig het gebied volgens protocol en bevestig een gavaging naald aan een spuit van 1 ml. Zuig 200 μL tamoxifen in de spuit. Nekvel PdgfrαCreERT2 ; Rosa26EYFP-muizen (10 weken oud; beide geslachten gebruikt) door ze op een plat oppervlak te plaatsen en de basis van de staart stevig vast te pakken. Gebruik een vrije hand om het midden van de muis vast te pakken met de duim en wijsvinger en schuif vervolgens voorzichtig en met lichte druk de grip tot net voorbij de schouders. Knijp de huid terug met de duim en wijsvinger, pak de muis op en draai de hand zodat de muis naar de gebruiker is gericht en stop de staart tussen de pink en ringvinger van de hand die de muis vasthoudt. Zorg er op dit punt voor dat de muis goed geïmmobiliseerd is en zijn hoofd of armen niet kan bewegen. Steek de gavaging naald in de mond en gebruik deze om het hoofd van de muis iets naar achteren te kantelen; hierdoor kan de slokdarm beter toegankelijk zijn. Steek de naald voorzichtig en langzaam in de slokdarm. Forceer de naald niet als aan enige weerstand wordt voldaan; de naald moet gemakkelijk naar beneden glijden. Injecteer de tamoxifen langzaam. Controleer de muizen gedurende 15-20 minuten om ervoor te zorgen dat er geen problemen optreden tijdens het broeden.OPMERKING: Toediening van tamoxifen op 2 opeenvolgende dagen resulteert meestal in ~ 75% -85% recombinatie-efficiëntie van FAPs zonder nadelige effecten te veroorzaken. Het wordt aanbevolen dat de gebruiker 1-2 weken wacht voordat het letsel veroorzaakt, waardoor de resterende tamoxifen uit het systeem kunnen worden verwijderd en het resterende eiwit kan worden omgedraaid. 2. Letsel van tibialis anterieure (TA) spier OPMERKING: Om intramusculair vet te bestuderen, wordt aanbevolen om een op glycerol gebaseerd verwondingsmodel te gebruiken (50% glycerol in steriele zoutoplossing), wat resulteert in massale intramusculaire vetvorming 34,35,36,37. Bereid de verdovingsmachine voor door isofluraan toe te voegen en ervoor te zorgen dat de buizen naar zowel de muizenkamer als de neuskegel open zijn. Reinig de kamer en het werkgebied met 70% ethanol of peroxide-oplossing (afhankelijk van protocollen). Stel het zuurstofdebiet in op 2,5 l/min en de isofluraanconcentratie op 2,5%. Plaats een muis in de anesthesiekamer en wacht ~ 5 minuten totdat deze is verdoofd. Plaats de muis in rugligging op een schoon verwarmingskussen en steek de neus in de neuskegel. Breng voorzichtig vet oogheelkundige zalf aan op de ogen met een katoenen applicator om uitdroging te voorkomen terwijl u onder narcose bent. Controleer voortdurend de anesthesie en voer voorafgaand aan het letsel een teenknijper uit op de muis om ervoor te zorgen dat de muis volledig verdoofd is. Reinig het te injecteren been met een vers alcoholdoekje om te desinfecteren. Zuig 30-50 μL 50% glycerol (afhankelijk van de grootte van de muizen) op in de insulinespuit. Borstel voorzichtig het haar op het scheenbeen om de locatie van de TA bloot te leggen.OPMERKING: Het is gemakkelijker om het haar te bewegen en een betere visualisatie te bereiken wanneer het nog nat is van het alcoholdoekje. Na het lokaliseren van de TA (net lateraal aan het scheenbeen, steekt het lichtjes door de huid en kan het met zachte palpatie worden gevoeld), steek de naald distaal in de TA, in de buurt van de enkel. Steek de naald volledig in de spier en injecteer langzaam glycerol terwijl de naald geleidelijk wordt teruggetrokken, wat helpt om het grootste deel van de spier te verwonden.OPMERKING: Het is het beste om de naald parallel aan het been in te brengen, met slechts een iets verhoogde hoek. Een goede blessure veroorzaakt meestal dorsiflexie omdat de TA samentrekt na het terugtrekken van de naald. Als de tenen van de muis zich uitspreiden, is het waarschijnlijk dat de extensor digitorum longus (EDL) spier is geïnjecteerd. Plaats de muis terug in de kooi en controleer gedurende ongeveer 15-20 minuten om herstel van de anesthesie te garanderen. Gooi de naald weg in een naaldencontainer. Vat nooit een naald samen.OPMERKING: Analgesie na glycerolinjectie moet worden verstrekt zoals goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee. Adipocyten kunnen worden waargenomen zodra 5 dagen na het letsel (dpi). Door 7 dpi hebben alle adipocyten zich gevormd en met 21 dpi zijn ze volledig gerijpt. 3. Weefseloogst Bereid 4% PFA in 1x PBS en plaats op ijs voordat u begint met oogsten. Plaats alle platen (12- of 24-well) die worden gebruikt voor spierfixatie op ijs en voeg 4% PFA toe aan elke put, zorg ervoor dat elke put 10-20 keer meer volume PFA heeft dan het weefsel dat wordt gefixeerd. Tussen 7 en 21 dagen na glycerolletsel, euthanaseer de muis volgens institutionele richtlijnen (d.w.z. overdosering van isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie). Begin met het oogsten van alle weefsels die moeten worden gebruikt voor histologie of RNA-isolatie.OPMERKING: Weefsels moeten binnen 10-15 minuten na het opofferen worden vastgevroren of in PFA worden geplaatst (figuur 2). Besproei royaal alle delen van de muis die moeten worden gesneden met 70% ethanol om het haar van het ontledende gebied en instrumenten te houden. Gebruik een schaar om de huid rond de bovenkant van het been te knippen, in de buurt van het bekken (figuur 3A). Trek de huid van het been voorzichtig van de bovenkant naar beneden naar de enkel (figuur 3B).OPMERKING: De TA is een druppelvormige spier met een duidelijk gedefinieerde distale pees die zich hecht aan het mediale spijkerschrift en het eerste middenvoetsbeentje. Het is lateraal aan het scheenbeen en strekt zich uit tot aan de onderste knie. Verwijder eerst de buitenste bindweefsellaag (epimysium) met een scherp pincet voordat u de TA oogst (figuur 3C). Gebruik een ontleedmicroscoop om het epimysium beter te visualiseren. Schuif het pincet onder de TA vanaf de onderkant van de spier, beginnend bij de distale pees, en trek voorzichtig omhoog naar de knie (figuur 3D). Stop aan het einde van de spier; duw niet voorbij de weerstand die bij de onderste knie wordt gevoeld. Als er aanzienlijke weerstand is voordat u de onderste knie bereikt, stop dan en ga door met het verwijderen van overgebleven lagen bindweefsel.OPMERKING: Er is nog een distale pees net lateraal aan de TA-pees die zich hecht aan de EDL, wat een slanke spier lateraal aan de TA is. Voorzichtig zijn om het pincet alleen onder de TA-pees te schuiven voorkomt onbedoeld oogsten van de EDL, maar het kan ook gemakkelijk worden verwijderd na fixatie. Zodra de TA gedeeltelijk van het been is opgetild met het pincet, gebruikt u dezelfde beweging met een scalpel om de verbinding van de TA met de onderste knie te verbreken (figuur 3E). Knip de pees bij de enkel met een schaar om de TA volledig te verwijderen. Behandel alleen de spier bij de pees om beschadiging van de vezels te voorkomen. Snijd 1/3 van de TA aan het einde tegenover de pees (figuur 3F), plaats deze in een microcentrifugebuis en bevries door deze in vloeibare stikstof te laten vallen (figuur 3H). Dompel de andere 2/3 van het weefsel onder in een gelabelde put met 4% PFA voor histologie (figuur 3I). Zorg ervoor dat u bijhoudt wanneer het eerste en laatste weefsel in fixatief is geplaatst. Plaats op een shaker gedurende 2-2,5 uur bij 4 °C. De duur van de fixatie is afhankelijk van het weefsel en de grootte ervan. Bepaal de duur die nodig is voor het fixeren van de weefsels. Het fixeren van TA’s gedurende 2-2,5 uur bij 4 °C behoudt doorgaans de morfologie van adipocyten goed zonder overfixatie van het weefsel te veroorzaken.OPMERKING: Als u van plan bent TA te gebruiken voor immunofluorescente kleuring in de hele montage, slaat u de rest van dit protocol over totdat u sectie 7 bereikt: “Whole Mount Immunofluorescent Staining”. Verwijder na fixatie PFA uit de putjes, spoel de weefsels 2-3 keer koud 1x PBS en was vervolgens 2-3 keer met koud 1x PBS gedurende 5 minuten per wasbeurt. Verwijder de PBS uit de putjes en voeg voldoende 30% sucrose toe in 1x PBS om het weefsel te laten zweven. Zet op de shaker bij 4 °C een nacht. Figuur 3: Samenvatting van de weefseloogst. (A) De huid wordt aan de basis van het been gesneden en (B) de spieren van de achterpoten worden blootgelegd. (C) Zodra het epimysium uit de TA is verwijderd, wordt (D) een tang gebruikt om de spier gedeeltelijk te scheiden en ervoor te zorgen dat het epimysium volledig is verwijderd. (E) De TA wordt met een scalpel uit het been gesneden en verwijderd na het doorsnijden van de pees. (G) Na het snijden van de TA in een derde en een tweederde stuk, (H) wordt een derde vastgevroren in vloeibare stikstof voor RT-qPCR-analyse en (I) wordt de andere twee derde gefixeerd in 4% PFA voor histologie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 4. Inbedding Bereid de specimenvormen voor om te worden gebruikt voor inbedding door te labelen en te vullen met voldoende insluitmedium om de weefsels volledig onder te dompelen. Verwijder tissues uit de putjes, droog overtollige sucrose af op een papieren handdoek en ga naar de ijskoude medium gevulde monstervormen.OPMERKING: Het is handig om te weten in welke richting de mal op de cryostaat wordt gesneden. Op deze manier kan de gebruiker de weefsels in de mal zo oriënteren dat het interessegebied gemakkelijk toegankelijk is. Voor de TA zou dit worden bereikt door het dikste uiteinde (tegenovergesteld aan de peeszijde) naar het oppervlak te plaatsen dat zal worden doorsneden. Hierdoor kan de TA gemakkelijk worden doorsneden op het dikste deel (buik) en kan de spiervezels door de dwarsdoorsnede worden gesneden. Bereid een isopentaanbrij door een container met isopentaan gedeeltelijk onder te dompelen in vloeibare stikstof. Zorg ervoor dat er voldoende vloeibare isopentaan in de container zit om ongeveer de helft van de specimenvorm onder te dompelen om te worden gebruikt om de weefsels in te bedden. Begin met het invriezen van de mallen door ze voorzichtig in de isopentaan slurry te doen en ervoor te zorgen dat ongeveer de helft van de schimmel wordt ondergedompeld. Zorg er ook voor dat de schimmel van alle vier de kanten gelijk bevriest. Haal de mal uit de isopentaan net voordat de hele mal zichtbaar is ingevroren vanaf de bovenkant. De hoeveelheid tijd die dit kost, is afhankelijk van de mallen die worden gebruikt. Bewaar de bevroren mallen in een container met droogijs terwijl je de rest van de blokken invriest en bewaar ze vervolgens bij -80 °C.OPMERKING: Isopentaan voor het invriezen kan worden hergebruikt. Doe in een glazen fles, maar draai het deksel niet aan totdat isopentane kamertemperatuur (RT) bereikt. Anders zou de verandering in druk de fles kunnen verbrijzelen. 5. Secties Stel de cryostaat in op -22 tot -24 °C, voeg mallen met TA’s toe aan de cryostaat en wacht minimaal 30 minuten op temperatuuraclimatisatie. Label in de tussentijd een reeks positief geladen microscoopglaasjes. Plaats een antirolplaat en lijn uit op de cryostaat, zodat er minimale inkepingen in de plaat zijn waar deze contact maakt met het monsterblok. Veilig op zijn plaats. Steek een vers cryostaatmes in de meshouder en zet het op zijn plaats.LET OP: Het lemmet is scherp. Bedek het mes bij het manipuleren van andere delen van de cryostaat of bevroren mallen. Verwijder het bevroren blok uit de vorm. Voeg een uniforme laag insluitmedium toe aan de cryostaathouder en plaats het blok in het medium. Laat het 1-3 minuten zitten totdat het insluitmedium volledig bevroren is (ondoorzichtig wit).OPMERKING: Voor TA’s moet het dikste gebied (buik) zichtbaar zijn wanneer het op de klauwplaat zit. Plaats de cryostaathouder met het weefselblok in de cryostaat. Ontdek het mes en breng de cryostaat naar voren totdat het net in contact komt met het blad. Snijd door het blok bij secties van 25 μm totdat het weefsel niet langer wordt verduisterd door het insluitmedium.OPMERKING: Pas tijdens het snijden de hoek van de cryostaat en/of de positie van het podium zodanig aan dat de secties een uniforme dikte hebben. Het kan nuttig zijn om een paar secties te verzamelen om uniformiteit in sectiedikte te garanderen. Het wordt aanbevolen dat de gebruiker de juiste antirolplaatpositie vindt voordat hij doorsnijdt naar het interessante gebied binnen de TA (buik), omdat dit de gebruiker in staat stelt om verschillende posities van de antirolplaat te proberen totdat de secties recht afkomen zonder weefsel te verspillen. Verander de sectiedikte in 10-12 μm en verzamel de secties op gelabelde microscoopglaasjes. Seriële secties worden aanbevolen door aangrenzende secties op 6-10 dia’s (gelabeld 1-x) te verzamelen, waardoor kleuring voor meerdere markeringen mogelijk is. Gebruik indien nodig een dun penseel om secties los te maken voordat u ze op de dia verzamelt.OPMERKING: Als secties krullen, controleer dan of de temperatuur stabiel blijft binnen het bereik van -22 tot -24 °C. Als er verticale strepen in secties zijn, kan dit te wijten zijn aan een inkeping in de antirolplaat of het mes; dit kan worden verholpen door de positie van de antirolplaat aan te passen en/of over te schakelen naar een nieuw blad. Nadat u aangrenzende secties van hetzelfde sectievlak op elke dia hebt verzameld, past u de dikte terug naar 25 μm om 150-200 μm door het blok te gaan, past u de dikte vervolgens weer aan op 10-12 μm en begint u opnieuw met snijden.OPMERKING: Met deze seriële sectie kan de gebruiker op verschillende diepten visualiseren, beeld geven en kwantificeren via de TA; drie tot vier seriële secties per dia is voldoende. Bewaar de dia’s en weefselblokken bij -80 °C. 6. Immunofluorescente (IF) kleuring van weefselsecties OPMERKING: Aangezien antilichaamconcentraties kunnen variëren tussen partijen en fabrikanten, wordt optimalisatie aanbevolen door verschillende concentraties van de antilichamen op testglaasjes te evalueren voordat de interessante dia’s worden gekleurd. Ontdooien/droge glijden op RT of op een warme plaat bij 37 °C gedurende 10-20 min. Gebruik een hydrofobe pen om een lijn te tekenen aan de rand van het papieroppervlak van de dia, waar deze het glas ontmoet. Doe de dia’s in een Coplin pot en was met 1x PBS + 0,1% Tween20 (PBST) 3-5x op een shaker gedurende ten minste 5 minuten per wasbeurt om de weefselsecties te hydrateren.OPMERKING: Op dit punt is het belangrijk om de dia’s niet te laten zitten zonder ondergedompeld te worden in PBST (tot aan de hydrofobe lijn), anders zullen de weefselsecties uitdrogen. Plaats de dia’s op het rooster van een bevochtigingskamer en leg de dia’s met 310-350 μL blokkerende oplossing (5% ezelserum en 0,3% Triton X-100 in 1x PBS) gedurende 1-2 uur bij RT.OPMERKING: Er is geen extra permeabilisatiestap nodig, omdat de blokkerende oplossing 0,3% Triton X-100 bevat, waardoor voldoende permeabilisatie van de weefselsecties mogelijk is. Bij gebruik van primaire antilichamen afgeleid van muizen (d.w.z. PAX7 en MYOD1 hieronder vermeld), wordt aanbevolen om een muis-op-muis blokkerende stap met behulp van Fab-fragmenten (1:50) op te nemen in de blokkerende oplossing voor de blokkerende stap. Dit zal helpen de achtergrond te verminderen als gevolg van niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam van de muis aan andere antilichamen dan het primaire. Verdun de primaire antilichamen die in de blokkerende oplossing moeten worden gebruikt kort voordat u doorgaat naar de volgende stap als volgt: Primaire antilichamen voor adipocytkleuring en beeldvorming van de hele sectie: Verdun konijn anti-perilipin bij een verdunningsverhouding van 1:1000. Primaire antilichamen voor het traceren van afstamming van adipocyten: Verdun kip anti-GFP in een verhouding van 1:1000 en konijn anti-perilipin op 1:1000. Primaire antilichamen voor het traceren van afstamming van FAPs: Verdun kip anti-GFP in een verhouding van 1:1000 en geiten anti-PDGFRα op 1:250. Primaire antilichamen voor myogene markers: Verdun muis anti-PAX7 in een verhouding van 1:25 of muis anti-MYOD1 op 1:250, en konijn anti-LAMININ op 1:1000.OPMERKING: Hoewel de hierboven genoemde antilichamen met succes zijn beoordeeld met dit protocol, is het waarschijnlijk dat andere markers en antilichamen om FAPs, adipocyten en / of andere celtypen te labelen ook compatibel zijn met dit protocol. Het wordt sterk aanbevolen om bij het eerste gebruik van primaire antilichamen dat de gebruiker een negatieve controledia opneemt, waarin primaire antilichamen worden weggelaten. Dit zal controleren op de specificiteit van de antilichamen. Alle andere stappen in het protocol worden gevolgd, inclusief de toevoeging van secundaire antilichamen, maar de blokkerende oplossing wordt alleen gebruikt in de volgende stap in plaats van het primaire antilichaam in de blokkerende oplossing. Dump de blokkeeroplossing van de dia’s en leg met 310-350 μL blokkeringsoplossing met primaire antilichamen en incubeer ‘s nachts bij 4 °C in de bevochtigingskamer. Dump de volgende dag de blokkerende oplossing /primaire antilichamen van de dia’s en plaats ze in een Coplin-pot. Spoel de dia’s 2-3 keer af met PBST en was 3-5x met PBST op een shaker gedurende ten minste 5 minuten per wasbeurt. Bereid tijdens de laatste wasbeurt de secundaire antilichamen of eventuele directe conjugaten voor gebruik in de blokkerende oplossing. Minimaliseer de hoeveelheid tijd die deze antilichamen in het licht doorbrengen om fotobleaching te voorkomen. Verdunde secundaire antilichamen/directe conjugaten: 488 nm ezel anti-kip (1:1000) of anti-konijn (1:1000) of anti-muis (1:1000), 568 nm ezel anti-geit (1:1000) of anti-konijn (1:1000) of Falloidine (myofibers; 1:100), DAPI-kleur (kernen; 1:500). Bedek de dia’s met 310-350 μL van de blokkerende oplossing met secundaire antilichamen en/of directe conjugaten in de bevochtigingskamer. Incubeer bij RT gedurende 1-2 uur. Bescherm monsters vanaf nu tegen licht. Dump de blokkerende oplossing/secundaire antilichamen en plaats ze in een Coplin-pot. Spoel één keer met PBST en was 3-5x met PBST op een shaker gedurende ten minste 5 minuten per wasbeurt. Houd de Coplin-pot afgedekt om blootstelling aan licht te voorkomen. Droog de dia’s zo goed mogelijk door op de randen te tikken en de rug tegen een papieren handdoek af te vegen, maar laat de weefselsecties niet uitdrogen. Voeg drie of vier druppels waterig montagemedium toe aan de bovenste horizontale rand van de dia en voeg voorzichtig een coverslip toe. Druk niet naar beneden of beweeg niet als zich luchtbellen vormen onder de deklip; elke druk of beweging kan de fragiele cellulaire architectuur van adipocyten verstoren. Laat het montagemedium ‘s nachts in het donker instellen voordat u gaat fotograferen. 7. Immunofluorescente kleuring met volledige montage Gebruik na ~1 uur fixatie (zie stap 3.14) een scherp pincet om myofibers van de vaste TA af te pellen. Doe de gescheiden vezels in een 24-well plaat en was 3x gedurende 3 minuten elk met PBST. Zorg er voor alle volgende incubaties voor dat u het deksel toevoegt om verdamping te voorkomen. Incubeer gedurende 1 uur in 1% Triton X-100 in 1x PBS bij RT (200-300 μL) op een shaker om een betere penetratie van antilichamen mogelijk te maken. Na een paar keer spoelen met PBST, overlay met blokkerende oplossing (200-300 μL) en blok op een nutator of shaker ‘s nachts bij 4 °C. Verdun de primaire antilichamen op de gewenste concentratie (verdubbeling van de concentratie is meestal een goed startpunt) in de blokkerende oplossing. Incubeer de monsters (200-300 μL) op een notenmaker of shaker gedurende een nacht bij 4 °C. Was de monsters rigoureus met PBST gedurende de dag met frequente veranderingen bij RT op de shaker, ongeveer 4-6x gedurende 30-60 minuten per wasbeurt. Verdun de secundaire antilichamen in de blokkerende oplossing in de gewenste concentratie (1:500 heeft de neiging om goed te werken) plus nucleaire kleuring en incubeer de monsters (200-300 μL) op een nutator of shaker ‘s nachts bij 4 °C. Was monsters rigoureus met PBST gedurende de dag met frequente veranderingen bij RT op de shaker, ongeveer 4-6x keer gedurende 30-60 minuten elke wasbeurt of was ‘s nachts op 4 °C. Om te monteren, droogt u het overtollige PBST voorzichtig af en plaatst u de vezels vervolgens in een of twee druppels montagemedium op een glazen schuif (figuur 4A). Om de deklip (18 mm x 18 mm) op te tillen, voegt u kleine kleivoetjes toe; dit voorkomt dat de vezels worden geplet en bevestigt de coverslip aan de glijbaan. Modelleringsverbindingen werken hiervoor goed. Zodra de coverslip is bevestigd, voegt u meer medium toe aan de rand totdat het gebied onder de coverslip vol is.OPMERKING: In plaats van een montagemedium te gebruiken dat anti-fadingmiddelen bevat, kan het weefsel ook worden verplaatst door een oplopende reeks glycerol (30% tot 80% glycerol in PBS). Wacht 1-2 dagen voordat u het montagemedium in beeld brengt om uitharding van het montagemedium mogelijk te maken. 8. Beeldvorming van intramusculair vet Schakel de microscoop in en start de beeldbewerkingssoftware. Zet de dia op het podium vast.OPMERKING: Voor het afbeelden van adipocyten in spiersecties is een 5x of 10x objectief in combinatie met widefield microscopie vaak voldoende. Voor het visualiseren van WM-IF is een confocale microscoop vereist. Gebruik een willekeurig kanaal om het gebied te identificeren dat moet worden afgebeeld. Pas in de beeldvormingssoftware de versterking en belichtingstijd voor elk kanaal aan. Maak foto’s van het hele weefsel in elk kanaal (automatisch of handmatig volgens de gebruikte microscoop en software) en voeg individuele tegels samen tot een samenstelling van de volledige TA-doorsnede.OPMERKING: Het wordt aanbevolen om foto’s te maken van twee of drie verschillende secties van dezelfde TA op verschillende diepten. Door de adipocyten in elke sectie te kwantificeren en vervolgens de gemiddelde, gelokaliseerde verschillen in de hoeveelheid intramusculair vet als gevolg van bijvoorbeeld injectiefouten te rapporteren, worden vermeden. 9. Adipocyten kwantificeren Als u deze nog niet eerder hebt geïnstalleerd, voegt u de cell counter-plug-in toe aan ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). Importeer de afbeeldingen in ImageJ als TIF-bestanden of originele microscoopbestanden. Bekijk elk kanaal in ImageJ als een afzonderlijk TIF-bestand.OPMERKING: Als u LIF of vergelijkbare microscoopbestandstypen gebruikt, kiest u onder Opties voor importeren van bio-indelingen de optie Hyperstack voor Stapel weergeven met en vinkt u het selectievakje voor Gesplitste kanalen in. Klik op OK om het bestand te openen. Zorg er ook voor dat het selectievakje Automatisch schalen is uitgeschakeld. Zorg ervoor dat afbeeldingen voor elk kanaal de 8-bits indeling (en grijs) hebben: afbeelding > Type > 8-bits. DAPI-afbeeldingen (blauw), GFP (groen), PERILIPIN (rood) en PHALLOIDIN (grijs) samenvoegen: Afbeelding > Kleur > Kanalen samenvoegen. Controleer of de schaal (Analyseren > Schaal instellen) in micron is. Gebruik de selectietool uit de vrije hand om het gewonde en niet-gewonde deel van elke doorsnede te schetsen, vervolgens te meten (analyseren > meten) en het gewonde versus niet-gewonde gebied in een spreadsheet vast te leggen.OPMERKING: Gewonde spieren kunnen worden geïdentificeerd als gebieden zonder myofibers of gebieden bevolkt door myofibers die centraal gelegen kernen bevatten. Cell Counter starten: Plug-ins > CellCounter > initialiseren. Selecteer een tellertype en tel vervolgens elke adipocyt. Noteer het totale aantal adipocyten in een spreadsheet en bereken vervolgens het aantal adipocyten per 1 mm2 van het gewonde gebied. 10. Adipogene genexpressie analyse met behulp van RT-qPCR RNA-isolatie Verwarm voor aanvang RNase-vrij water voor op 45 °C en bereid verse 70% EtOH (350 μL per monster). Voeg 1.000 μL guanidiumthiocyanaat toe aan elke buis die het monster bevat (zie stap 3.12). Het is belangrijk dat er door kraalkloppers goedgekeurde buizen worden gebruikt.LET OP: Guanidium thiocyanaat is giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en handvat in een zuurkast. Voeg drie middelgrote kralen of een grote en een kleine kraal toe aan elke buis. Homogeniseer het weefsel op 50 Hz gedurende 2-4 minuten met behulp van een kraalklopper. Afhankelijk van het weefseltype en de monstergrootte kan het tot 10 minuten duren. Voeg 200 μL chloroform toe.LET OP: Chloroform is giftig. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen en handvat in een zuurkast. Schud de monsters gedurende 15 s. Incubeer gedurende 2-3 minuten bij RT. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 x g. Pipetteer 350 μL van het heldere supernatant (bovenste laag met het RNA) en voeg toe aan een nieuwe microcentrifugebuis met 350 μL 70% ethanol. Pas op dat u de onderste eiwit- en/of DNA-lagen niet aspirateert Breng tot 700 μL van het mengsel over naar een mini-spinkolom in een opvangbuis van 2 ml. Ga verder met RNA-isolatie volgens de instructies van de fabrikant. Eluteer met 30-50 μL RNase-vrij water, afhankelijk van de verwachte opbrengst. Houd RNA op ijs en meet de opbrengst met behulp van een spectrofotometer. Bewaar het RNA bij -80 °COPMERKING: Het is mogelijk om de DNase-behandelingsstap weg te laten, omdat het zorgvuldig verwijderen van alleen de bovenste 350 μL van de RNA-laag voldoende is om DNA-besmetting te voorkomen. Naast RT-qPCR-analyse kan het geïsoleerde RNA ook worden gebruikt voor RNA-sequencing, in welk geval een DNase-behandelingsstap ten zeerste wordt aanbevolen. cDNA synthese Gebruik tot 1 μg RNA om cDNA te synthetiseren met een cDNA-synthesekit, volgens de instructies van de fabrikant. Nadat de run is voltooid, voegt u 80 μL RNase-vrij water toe. Bewaar de monsters bij -20 °C. RT-qPCR van adipocyt-selectieve genen. Gebruik een 384-well formaat en voeg 1 μL primer (~ 1 μM eindconcentratie) toe aan de bodem van elke put. Voordrogende primers resulteren in strakkere technische replica’s. Laat afgedekt totdat de primers volledig zijn verdampt (de plaat kan op een verwarmingsblok worden geplaatst dat is ingesteld op 37 °C om de verdamping te versnellen). Stel monsterreacties met vier tot acht technische replicaties als volgt in: 2,5 μL rt-pcr-mastermix op basis van kleurstof, 2,1 μl rnasevrij water en 0,4 μl cDNA (~1 ng) met een totaal volume van 5 μL per putje. De volgende thermische cyclusomstandigheden werden gebruikt: denaturatie bij 95 °C gedurende 15 s en gloeien/uitschuiven bij 60 °C gedurende 25 s gedurende 40 cycli. Normaliseer ruwe CT-waarden (cyclusdrempel) naar huishoudgenen (d.w.z. Hprt en Pde12) niveaus door ΔΔCT te berekenen zoals hier beschreven38. Zie20 voor primersequenties.OPMERKING: Standaardpraktijk voor RT-qPCR-analyse moet worden gevolgd, zoals het gebruik van een minus Reverse Transcription (-RT) -controle, PCR-reactie en primervalidatie.