Guide d’examen de la formation de graisse intramusculaire et de son origine cellulaire dans le muscle squelettique

Tous les protocoles pour animaux ont été approuvés par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Floride. 1. Traçage génétique de la lignée des PAF REMARQUE: Si le traçage de la lignée génétique des PAF n’est pas souhaité, l’étape 1 peut être ignorée. Pour effectuer le traçage de la lignée des PAF, procurez-vous les allèles de souris nécessaires.REMARQUE: Plusieurs lignées cre inductibles au tamoxifène, sous le contrôle du promoteur Pdgfrα, ont été générées pour cibler avec succès les PAF, notamment à partir des laboratoires Hogan29, Rando27 et Bergles32. En tant que rapporteur génétique de l’activité cre, de nombreux allèles rapporteurs Rosa26 sont disponibles tels que Rosa26EYFP33. Bien qu’il soit suggéré à chaque laboratoire de déterminer quelle combinaison Cre-Reporter est la plus efficace, en croisant des souris PdgfrαCreERT2 (29 et Jax # 032770) avec le rapporteur Rosa26EYFP (33 et Jax # 006148), le PdgfrαCreERT2 résultant; Les souris EyFPRosa26peuvent être utilisées pour marquer efficacement et spécifiquement lesPAF 20. Pour retracer le sort des PAP matures, il est recommandé d’attendre que les souris aient atteint au moins ~ 10 semaines avant d’administrer du tamoxifène. Des expériences de traçage de lignée peuvent être effectuées sur des mâles et des femelles. Administration de tamoxifène par gavaging oral Préparer 40 mg/mL de tamoxifène dans de l’huile de maïs et du vortex bien pour mélanger 1 jour avant le gavaging. Incuber O/N à 37 °C dans un four d’hybridation rotatif.ATTENTION : Le tamoxifène est cancérigène et doit être manipulé avec précaution. Portez toujours des gants lors de la manipulation et portez un masque lorsque vous le pesez sous forme de poudre, car il existe un risque d’inhalation. Nettoyez la zone conformément au protocole et fixez une aiguille à gicler à une seringue de 1 mL. Aspirer 200 μL de tamoxifène dans la seringue. Scruff PdgfrαCreERT2 ; Rosa26souris EYFP (âgées de 10 semaines; les deux sexes utilisés) en les plaçant sur une surface plane et en saisissant fermement la base de la queue. Utilisez une main libre pour saisir le milieu de la souris avec le pouce et l’index, puis faites glisser doucement et avec une légère pression la poignée jusqu’à juste après les épaules. Pincez la peau en arrière avec le pouce et l’index, ramassez la souris et retournez la main pour que la souris soit face à l’utilisateur, et placez la queue entre le petit doigt et l’annulaire de la main qui tient la souris. À ce stade, assurez-vous que la souris est bien immobilisée et incapable de bouger la tête ou les bras. Insérez l’aiguille de gavaging dans la bouche et utilisez-la pour incliner légèrement la tête de la souris vers l’arrière; cela permet à l’œsophage d’être mieux accessible. Insérez soigneusement et lentement l’aiguille dans l’œsophage. Ne forcez pas l’aiguille si une résistance est rencontrée; l’aiguille devrait glisser facilement vers le bas. Injecter lentement le tamoxifène. Surveillez les souris pendant 15 à 20 minutes pour vous assurer qu’aucun problème ne se produit pendant la gavage.REMARQUE: L’administration de tamoxifène pendant 2 jours consécutifs entraîne généralement une efficacité de recombinaison d’environ 75% à 85% des PAF sans causer d’effets indésirables. Il est recommandé à l’utilisateur d’attendre 1 à 2 semaines avant d’induire une blessure, ce qui permettra d’éliminer le tamoxifène restant du système et de retourner toute protéine restante. 2. Lésion du muscle tibialis antérieur (TA) REMARQUE: Pour étudier la graisse intramusculaire, il est recommandé d’utiliser un modèle de blessure à base de glycérol (50% de glycérol dans une solution saline stérile), ce qui entraîne une formation massive de graisse intramusculaire 34,35,36,37. Préparez l’appareil d’anesthésie en ajoutant de l’isoflurane et en vous assurant que les tubes de la chambre de la souris et du cône du nez sont ouverts. Nettoyez la chambre et la zone de travail avec une solution d’éthanol ou de peroxyde à 70% (selon les protocoles). Réglez le débit d’oxygène à 2,5 L/min et la concentration d’isoflurane à 2,5 %. Placez une souris dans la chambre d’anesthésie et attendez environ 5 minutes pour qu’elle soit anesthésiée. Placez la souris en décubitus dorsal sur un coussin chauffant propre et insérez le nez dans le cône du nez. Appliquez doucement une pommade ophtalmique vétérinaire sur les yeux avec un applicateur à pointe de coton pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Surveillez en permanence l’anesthésie et effectuez un pincement des orteils sur la souris avant la blessure pour vous assurer que la souris est complètement anesthésiée. Nettoyez la jambe à injecter avec une lingette d’alcool frais pour désinfecter. Prélever 30 à 50 μL de glycérol à 50 % (selon la taille des souris) dans la seringue à insuline. Brossez doucement les cheveux sur le tibia pour exposer l’emplacement de l’AT.REMARQUE: Il est plus facile de déplacer les cheveux et d’obtenir une meilleure visualisation lorsqu’ils sont encore mouillés par la lingette alcoolisée. Après avoir localisé l’AT (juste latéralement au tibia, il dépasse légèrement à travers la peau et peut être ressenti avec une légère palpation), insérez l’aiguille dans l’AT distalement, près de la cheville. Insérez complètement l’aiguille dans le muscle et injectez lentement du glycérol tout en retirant progressivement l’aiguille, ce qui aide à blesser la majeure partie du muscle.REMARQUE: Il est préférable d’insérer l’aiguille parallèlement à la jambe, avec juste un angle légèrement surélevé. Une bonne blessure provoque généralement une dorsiflexion lorsque l’AT se contracte après le retrait de l’aiguille. Si les orteils de la souris se sont écartés, il est probable que le muscle extenseur digitorum longus (EDL) ait été injecté. Replacez la souris dans la cage et surveillez pendant environ 15 à 20 minutes pour assurer la récupération de l’anesthésie. Jeter l’aiguille dans un récipient pour objets tranchants. Ne récapitulez jamais une aiguille.REMARQUE: L’analgésie après l’injection de glycérol doit être fournie comme approuvé par le Comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement. Les adipocytes peuvent être observés dès 5 jours après la blessure (dpi). À 7 dpi, tous les adipocytes se sont formés et à 21 dpi, ils ont complètement mûri. 3. Prélèvement de tissus Préparer 4 % de PFA dans 1x PBS et placer sur la glace avant de commencer la récolte. Placez toutes les plaques (12 ou 24 puits) utilisées pour la fixation musculaire sur la glace et ajoutez 4% de PFA à chaque puits, en vous assurant que chaque puits a 10 à 20 fois plus de volume de PFA que le tissu fixé. Entre 7 et 21 jours après une lésion au glycérol, euthanasier la souris selon les directives institutionnelles (c.-à-d. surdosage d’isoflurane suivi d’une luxation cervicale). Commencez à prélever tous les tissus à utiliser pour l’histologie ou l’isolement de l’ARN.REMARQUE : Les tissus doivent être congelés ou placés dans du PFA dans les 10 à 15 minutes suivant le sacrifice (Figure 2). Vaporisez généreusement toutes les zones de la souris à couper avec de l’éthanol à 70% pour aider à empêcher les cheveux de disséquer la zone et les instruments. Utilisez des ciseaux pour couper la peau autour du haut de la jambe, près du bassin (Figure 3A). Tirez doucement la peau de la jambe du haut vers le bas jusqu’à la cheville (Figure 3B).REMARQUE: Le TA est un muscle en forme de larme avec un tendon distal clairement défini se fixant au cunéiforme médian et au premier os métatarsien. Il est latéral au tibia et s’étend jusqu’au bas du genou. Tout d’abord, retirez la couche externe de tissu conjonctif (épimysium) à l’aide d’une pince à pointe pointue avant de prélever l’AT (figure 3C). Utilisez un microscope à dissection pour mieux visualiser l’épimysium. Faites glisser la pince à épiler sous le TA à partir du bas du muscle, en commençant par le tendon distal, et tirez doucement vers le haut vers le genou (Figure 3D). Arrêtez-vous à la fin du muscle; ne poussez pas au-delà de la résistance ressentie au niveau du genou inférieur. S’il y a une résistance importante avant d’atteindre le bas du genou, arrêtez et continuez à enlever les couches restantes de tissu conjonctif.REMARQUE: Il y a un autre tendon distal juste latéral au tendon TA qui se fixe à l’EDL, qui est un muscle mince latéral à l’TA. En prenant soin de ne glisser que la pince à épiler sous le tendon TA, on évite la récolte accidentelle de l’EDL, mais elle peut également être facilement retirée après fixation. Une fois que l’AT a été partiellement soulevée de la jambe avec la pince à épiler, utilisez le même mouvement avec un scalpel pour couper la connexion de l’AT au genou inférieur (Figure 3E). Coupez le tendon à la cheville avec des ciseaux pour retirer complètement le TA. Ne manipulez le muscle qu’au niveau du tendon pour éviter d’endommager les fibres. Coupez 1/3 de l’AT à l’extrémité opposée au tendon (Figure 3F), mettez-le dans un tube de microcentrifugation et congelez-le en le déposant dans de l’azote liquide (Figure 3H). Immerger les 2/3 restants du tissu dans un puits marqué avec 4 % de PFA pour l’histologie (Figure 3I). Assurez-vous de garder une trace du moment où le premier et le dernier tissu ont été placés en fixateur. Placer sur un agitateur pendant 2-2,5 h à 4 °C. La durée de la fixation dépend du tissu et de sa taille. Déterminez la durée nécessaire à la fixation des tissus. La fixation des AT pendant 2-2,5 h à 4 °C préserve généralement bien la morphologie des adipocytes sans provoquer de surfixation du tissu.REMARQUE: Si vous prévoyez d’utiliser TA pour la coloration immunofluorescente à montage entier, sautez le reste de ce protocole jusqu’à ce que vous atteigniez la section 7: « Coloration immunofluorescente à montage entier ». Après la fixation, retirez le PFA des puits, rincez les tissus avec 1x PBS froid 2-3 fois, puis lavez 2-3 fois avec 1x PBS froid pendant 5 min par lavage. Retirez le PBS des puits et ajoutez suffisamment de saccharose à 30% dans 1x PBS pour permettre au tissu de flotter. Placer sur le shaker à 4 °C pendant la nuit. Figure 3: Résumé de la récolte de tissus. (A) La peau est coupée à la base de la jambe et (B) les muscles des membres postérieurs sont exposés. (C) Une fois que l’épimysium est retiré de l’AT, des pinces (D) sont utilisées pour séparer partiellement le muscle et s’assurer que l’épimysium a été complètement retiré. (E) L’AT est coupé de la jambe avec un scalpel et retiré après avoir coupé le tendon. (G) Après avoir coupé l’AT en un tiers et deux tiers, (H) un tiers est congelé dans de l’azote liquide pour l’analyse RT-qPCR et (I) l’autre tiers est fixé dans 4% de PFA pour l’histologie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 4. Intégration Préparez les moules d’échantillon à utiliser pour l’encastrement en les étiquetant et en les remplissant avec suffisamment de milieu d’incorporation pour immerger complètement les tissus. Retirez les tissus des puits, séchez l’excès de saccharose sur une serviette en papier et passez aux moules d’échantillons remplis de milieu de congélation.REMARQUE: Il est utile de savoir dans quelle direction le moule doit être sectionné sur le cryostat. De cette façon, l’utilisateur peut orienter les tissus dans le moule de manière à permettre à la zone d’intérêt d’être facilement accessible. Pour l’AT, cela serait réalisé en plaçant l’extrémité la plus épaisse (opposée au côté du tendon) face à la surface qui sera sectionnée. Cela permet au TA d’être facilement sectionné à sa partie la plus épaisse (ventre) et permet une coupe transversale des fibres musculaires. Préparer une boue d’isopentane en immergeant partiellement un récipient contenant de l’isopentane dans de l’azote liquide. Assurez-vous qu’il y a suffisamment d’isopentane liquide dans le récipient pour immerger environ la moitié du moule de l’échantillon à utiliser pour intégrer les tissus. Commencez à congeler les moules en les mettant soigneusement dans la boue d’isopentane et en vous assurant qu’environ la moitié de la moisissure est submergée. Assurez-vous également que le moule gèle également des quatre côtés. Retirez la moisissure de l’isopentane juste avant que la moisissure entière ne soit visiblement gelée par le haut. Le temps que cela prend dépend des moules utilisés. Conservez les moules congelés dans un récipient avec de la glace carbonique tout en congelant le reste des blocs, puis conservez-les à -80 °C.REMARQUE: Isopentane pour la congélation peut être réutilisé. Mettez dans une bouteille en verre mais ne serrez pas le couvercle jusqu’à ce que l’isopentane atteigne la température ambiante (RT). Sinon, le changement de pression pourrait briser la bouteille. 5. Sectionnement Réglez le cryostat sur -22 à -24 °C, ajoutez des moules contenant des AT dans le cryostat et attendez au moins 30 minutes pour l’acclimatation à la température. En attendant, étiquetez une série de lames de microscope chargées positivement. Insérez une plaque anti-roulis et alignez-la sur le cryostat de manière à ce qu’il y ait un minimum d’entailles dans la plaque où elle entre en contact avec le bloc d’échantillon. Sécurisez sur place. Insérez une lame de cryostat fraîche dans le porte-lame et fixez-la en place.ATTENTION : La lame est tranchante. Couvrez la lame lorsque vous manipulez d’autres parties du cryostat ou des moules congelés. Retirez le bloc congelé du moule. Ajoutez une couche uniforme de milieu d’incorporation au mandrin du cryostat et positionnez le bloc dans le milieu. Laissez reposer pendant 1 à 3 minutes jusqu’à ce que le support d’enrobage soit complètement congelé (blanc opaque).REMARQUE: Pour les AT, la zone la plus épaisse (ventre) doit être visible sur le mandrin. Placez le mandrin de cryostat avec le bloc de tissu dans le cryostat. Découvrez la lame et avancez le cryostat jusqu’à ce qu’il entre en contact avec la lame. Section à travers le bloc à des sections de 25 μm jusqu’à ce que le tissu ne soit plus obscurci par le milieu d’incorporation.REMARQUE: Lors du sectionnement, ajustez l’angle du cryostat et / ou la position de la scène de manière à ce que les sections soient d’épaisseur uniforme. Il peut être utile de rassembler quelques sections pour assurer l’uniformité de l’épaisseur de la section. Il est recommandé que l’utilisateur trouve la position appropriée de la plaque anti-roulis avant de sectionner la région d’intérêt dans le TA (ventre), car cela permet à l’utilisateur d’essayer plusieurs positions de la plaque anti-roulis jusqu’à ce que les sections se détachent directement sans gaspiller de tissu. Modifiez l’épaisseur de la section à 10-12 μm et collectez les sections sur des lames de microscope étiquetées. La section en série est recommandée en collectant les sections adjacentes sur 6 à 10 diapositives (étiquetées 1-x), ce qui permet de tacher plusieurs marqueurs. Si nécessaire, utilisez un pinceau fin pour dérouler les sections avant de les collecter sur la diapositive.REMARQUE: Si les sections sont enroulées, vérifiez que la température se maintient dans la plage de -22 à -24 ° C. S’il y a des stries verticales dans les sections, cela pourrait être dû à une entaille dans la plaque anti-roulis ou la lame; cela peut être corrigé en ajustant la position de la plaque anti-roulis et / ou en passant à une nouvelle lame. Après avoir collecté les sections adjacentes du même plan de sectionnement sur chaque diapositive, ajustez l’épaisseur à 25 μm pour avancer de 150 à 200 μm à travers le bloc, puis ajustez l’épaisseur à 10-12 μm et recommencez la section.REMARQUE: Cette section série permet à l’utilisateur de visualiser, d’imager et de quantifier à différentes profondeurs via le TA; trois à quatre sections série par diapositive suffisent. Conservez les lames et les blocs de tissus à -80 °C. 6. Coloration immunofluorescente (FI) des coupes tissulaires REMARQUE: Comme les concentrations d’anticorps peuvent varier entre les lots et les fabricants, l’optimisation est recommandée en évaluant plusieurs concentrations différentes des anticorps sur les lames d’essai avant de colorer les lames d’intérêt. Décongélation/lames sèches soit à RT, soit sur une plaque chaude à 37 °C pendant 10-20 min. Utilisez un stylo hydrophobe pour tracer une ligne au bord de la surface de papier de la diapositive, où elle rencontre le verre. Mettez les lames dans un pot Coplin et lavez avec 1x PBS + 0,1% Tween20 (PBST) 3-5x sur un shaker pendant au moins 5 min par lavage pour réhydrater les sections de tissu.REMARQUE: À ce stade, il est important de ne pas laisser les lames reposer sans être immergées dans le PBST (jusqu’à la ligne hydrophobe), sinon les sections de tissus se dessècheront. Placez les lames sur le support d’une chambre d’humidification et superposez les lames avec 310-350 μL de solution bloquante (sérum d’âne à 5% et Triton X-100 à 0,3% dans 1x PBS) pendant 1-2 h à TA.REMARQUE: Aucune étape de perméabilisation supplémentaire n’est nécessaire, car la solution bloquante contient 0,3% de Triton X-100 permettant une perméabilisation suffisante des sections tissulaires. Lors de l’utilisation d’anticorps primaires dérivés de souris (c’est-à-dire PAX7 et MYOD1 énumérés ci-dessous), il est recommandé d’inclure une étape de blocage souris sur souris à l’aide de fragments Fab (1:50) dans la solution de blocage pour l’étape de blocage. Cela aidera à réduire le fond dû à la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire de la souris à des anticorps autres que le primaire. Diluer les anticorps primaires à utiliser dans la solution bloquante peu de temps avant de passer à l’étape suivante comme suit: Anticorps primaires pour la coloration des adipocytes et l’imagerie de section entière: Diluer l’anti-périlamine de lapin à un taux de dilution de 1:1000. Anticorps primaires pour le traçage de la lignée des adipocytes: Diluer l’anti-GFP du poulet dans un rapport de 1:1000 et l’anti-périlipine du lapin à 1:1000. Anticorps primaires pour le traçage de la lignée des PAF : Anti-GFP dilué du poulet dans un rapport de 1:1000 et anti-PDGFRα de chèvre à 1:250. Anticorps primaires pour marqueurs myogéniques : Diluer l’anti-PAX7 de la souris dans un rapport de 1:25 ou l’anti-MYOD1 de la souris à 1:250, et l’anti-LAMININ du lapin à 1:1000.REMARQUE: Bien que les anticorps énumérés ci-dessus aient été évalués avec succès avec ce protocole, il est probable que d’autres marqueurs et anticorps pour marquer les FAP, les adipocytes et / ou d’autres types de cellules sont également compatibles avec ce protocole. Il est fortement recommandé lors de l’utilisation d’anticorps primaires pour la première fois que l’utilisateur inclue une lame de contrôle négative, dans laquelle les anticorps primaires sont omis. Cela permettra de contrôler la spécificité des anticorps. Toutes les autres étapes du protocole sont suivies, y compris l’ajout d’anticorps secondaires, mais la solution bloquante est utilisée seule à l’étape suivante au lieu de l’anticorps primaire dans la solution bloquante. Déposer la solution bloquante des lames et la superposer avec 310-350 μL de solution bloquante avec des anticorps primaires et incuber pendant la nuit à 4 °C dans la chambre d’humidification. Le lendemain, jetez la solution bloquante / les anticorps primaires des lames et placez-les dans un pot Coplin. Rincez les lames 2-3 fois avec PBST et lavez 3-5x avec PBST sur un shaker pendant au moins 5 min par lavage. Lors du dernier lavage, préparer les anticorps secondaires ou tout conjugué direct à utiliser dans la solution bloquante. Minimisez le temps que ces anticorps passent dans la lumière pour éviter le photoblanchiment. Anticorps secondaires dilués/conjugués directs : 488 nm âne anti-poulet (1:1000) ou anti-lapin (1:1000) ou anti-souris (1:1000), 568 nm âne anti-chèvre (1:1000) ou anti-lapin (1:1000) ou phalloïdine (myofibres; 1:100), coloration DAPI (noyaux; 1:500). Superposer les lames avec 310-350 μL de la solution bloquante avec des anticorps secondaires et/ou des conjugués directs dans la chambre d’humidification. Incuber à RT pendant 1-2 h. Protégez les échantillons de la lumière à partir de maintenant. Jetez la solution bloquante / les anticorps secondaires et placez-les dans un pot Coplin. Rincez avec PBST une fois et lavez 3-5x avec PBST sur un shaker pendant au moins 5 min par lavage. Gardez le pot Coplin couvert pour éviter toute exposition à la lumière. Séchez les lames aussi bien que possible en tapotant les bords et en essuyant le dos contre une serviette en papier, mais ne laissez pas les sections de tissu sécher. Ajouter trois ou quatre gouttes de support de montage aqueux sur le bord horizontal supérieur de la glissière et ajouter doucement un couvercle. N’appuyez pas vers le bas et ne bougez pas si des bulles d’air se forment sous le couvercle; toute pression ou tout mouvement peut déformer l’architecture cellulaire fragile des adipocytes. Laissez le support de montage se mettre dans l’obscurité pendant la nuit avant l’imagerie. 7. Coloration immunofluorescente de montage entier Après environ 1 h de fixation (voir étape 3.14), utilisez une pince à épiler à pointe pointue pour décoller les myofibres de l’AT fixe. Placez les fibres séparées dans une plaque de 24 puits et lavez 3x pendant 3 minutes chacune avec PBST. Pour toutes les incubations ultérieures, assurez-vous d’ajouter le couvercle pour éviter l’évaporation. Incuber pendant 1 h dans 1% de Triton X-100 dans 1x PBS à RT (200-300 μL) sur un agitateur pour permettre une meilleure pénétration des anticorps. Après rinçage plusieurs fois avec du PBST, superposer avec une solution bloquante (200-300 μL) et bloquer sur un nutateur ou un agitateur pendant la nuit à 4 °C. Diluer les anticorps primaires à la concentration souhaitée (doubler la concentration tend à être un bon point de départ) dans la solution bloquante. Incuber les échantillons (200-300 μL) sur un nutateur ou un agitateur pendant la nuit à 4 °C. Lavez rigoureusement les échantillons avec PBST tout au long de la journée avec des changements fréquents à RT sur le shaker, environ 4-6x pendant 30-60 min chaque lavage. Diluer les anticorps secondaires dans la solution bloquante à la concentration souhaitée (1:500 a tendance à bien fonctionner) plus la coloration nucléaire et incuber les échantillons (200-300 μL) sur un nutateur ou un agitateur pendant la nuit à 4 °C. Lavez rigoureusement les échantillons avec pbST tout au long de la journée avec des changements fréquents à TA sur le shaker, environ 4 à 6 fois pendant 30 à 60 minutes chaque lavage ou lavage pendant la nuit à 4 ° C. Pour monter, séchez doucement l’excès de PBST, puis placez les fibres dans une ou deux gouttes de support de montage sur une lame de verre (Figure 4A). Pour soulever le couvercle (18 mm x 18 mm), ajoutez de petits pieds en argile; cela empêchera les fibres d’être écrasées et fixera le couvercle à la glissière. Les composés de modélisation fonctionnent bien pour cela. Une fois le couvercle fixé, ajoutez plus de médium au bord jusqu’à ce que la zone sous le couvercle soit pleine.REMARQUE: Au lieu d’utiliser un milieu de montage contenant des agents anti-décoloration, le tissu peut également être déplacé à travers une série ascendante de glycérol (30% à 80% de glycérol dans pbS). Attendez 1-2 jours avant l’imagerie pour permettre le durcissement du support de montage. 8. Imagerie de la graisse intramusculaire Allumez le microscope et lancez le logiciel d’imagerie. Fixez la diapositive sur la scène.REMARQUE: Pour l’imagerie des adipocytes dans les sections musculaires, un objectif 5x ou 10x combiné à la microscopie à grand champ est souvent suffisant. Pour visualiser WM-IF, un microscope confocal est nécessaire. Utilisez n’importe quel canal pour identifier la zone à imager. Dans le logiciel d’imagerie, ajustez le gain et le temps d’exposition pour chaque canal. Prenez des images de l’ensemble du tissu dans chaque canal (automatique ou manuel selon le microscope et le logiciel utilisé) et fusionnez des carreaux individuels pour former un composite de la section transversale TA complète.REMARQUE: Il est recommandé de prendre des images de deux ou trois sections différentes de la même AT à différentes profondeurs. En quantifiant les adipocytes dans chaque section, puis en rapportant la moyenne, les différences localisées dans la quantité de graisse intramusculaire dues, par exemple, à des erreurs d’injection seront évitées. 9. Quantifier les adipocytes S’il n’est pas installé précédemment, ajoutez le plug-in Compteur de cellules à ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). Importez les images dans ImageJ sous forme de fichiers TIF ou de fichiers de microscope d’origine. Affichez chaque canal dans ImageJ sous la forme d’un fichier TIF distinct.REMARQUE: Si vous utilisez LIF ou des types de fichiers de microscope similaires, sous Options d’importation de bioformats , choisissez Hyperstack pour Afficher la pile avec et cochez la case Diviser les canaux. Cliquez sur OK pour ouvrir le fichier. Assurez-vous également que la case Mise à l’échelle automatique est décochée. Assurez-vous que les images de chaque canal sont au format 8 bits (et gris) : Image > Type > 8 bits. Fusionner les images DAPI (bleu), GFP (vert), PERILIPIN (rouge) et PHALLOIDIN (gris) : image > couleur > fusionner les couches. Vérifiez que l’échelle (Analyser > Définir l’échelle) est en microns. À l’aide de l’outil de sélection à main levée, décrivez la partie blessée et non blessée de chaque coupe transversale, puis mesurez (Analyser > Mesure) et enregistrez la zone blessée par rapport à la zone non blessée dans une feuille de calcul.REMARQUE: Les muscles blessés peuvent être identifiés comme des zones dépourvues de myofibres ou des zones peuplées de myofibres contenant des noyaux situés au centre. Lancer le compteur de cellules: Plugins > CellCounter > Initialize. Sélectionnez un type de compteur, puis comptez chaque adipocyte. Enregistrez le nombre total d’adipocytes dans une feuille de calcul, puis calculez le nombre d’adipocytes par 1 mm2 de la zone blessée. 10. Analyse de l’expression génique adipogène à l’aide de la RT-qPCR Isolement de l’ARN Avant de commencer, préchauffer l’eau sans RNase à 45 °C et préparer de l’EtOH frais à 70 % (350 μL par échantillon). Ajouter 1 000 μL de thiocyanate de guanidium dans chaque tube contenant l’échantillon (voir étape 3.12.). Il est important que des tubes approuvés pour les batteurs de perles soient utilisés.ATTENTION : Le thiocyanate de guanidium est toxique. Portez un équipement de protection individuelle approprié et manipulez-le dans une hotte aspirante. Ajoutez trois perles moyennes ou une grande et une petite perle à chaque tube. Homogénéiser le tissu à 50 Hz pendant 2 à 4 min à l’aide d’un batteur de perles. Selon le type de tissu et la taille de l’échantillon, cela peut prendre jusqu’à 10 minutes. Ajouter 200 μL de chloroforme.ATTENTION : Le chloroforme est toxique. Portez un équipement de protection individuelle et manipulez une hotte aspirante. Agiter les échantillons pendant 15 s. Incuber pendant 2-3 min à RT. Centrifugeuse pendant 15 min à 12 000 x g. Pipeter 350 μL du surnageant clair (couche supérieure contenant l’ARN) et ajouter à un nouveau tube de microcentrifugation contenant 350 μL d’éthanol à 70%. Veillez à ne pas aspirer les couches inférieures de protéines et/ou d’ADN Transférer jusqu’à 700 μL du mélange dans une mini colonne de spin placée dans un tube collecteur de 2 mL. Poursuivez avec l’isolement de l’ARN en suivant les instructions du fabricant. Éluez avec 30 à 50 μL d’eau sans RNase, selon le rendement attendu. Gardez l’ARN sur la glace et mesurez le rendement à l’aide d’un spectrophotomètre. Conserver l’ARN stocké à -80 °CREMARQUE: Il est possible d’omettre l’étape de traitement par DNase, car il suffit de retirer soigneusement les 350 μL supérieurs de la couche d’ARN pour prévenir la contamination de l’ADN. En plus de l’analyse RT-qPCR, l’ARN isolé peut également être utilisé pour le séquençage de l’ARN, auquel cas une étape de traitement par DNase est fortement recommandée. Synthèse de l’ADNc Utilisez jusqu’à 1 μg d’ARN pour synthétiser l’ADNc avec un kit de synthèse d’ADNc, en suivant les instructions du fabricant. Une fois la course terminée, ajoutez 80 μL d’eau sans RNase. Conserver les échantillons à -20 °C. RT-qPCR des gènes sélectifs des adipocytes. À l’aide d’un format de 384 puits, ajouter 1 μL d’amorce (~1 μM de concentration finale) au fond de chaque puits. Les apprêts de pré-séchage se traduisent par des répliques techniques plus serrées. Laisser couvert jusqu’à ce que les amorces se soient complètement évaporées (la plaque peut être placée sur un bloc chauffant réglé à 37 °C pour accélérer l’évaporation). Mettre en place des réactions d’échantillon avec quatre à huit répétitions techniques comme suit : 2,5 μL de mélange maître RT-PCR à base de colorant, 2,1 μL d’eau sans RNase et 0,4 μL d’ADNc (~1 ng) avec un volume total de 5 μL par puits. Les conditions de cycle thermique suivantes ont été utilisées : dénaturer à 95 °C pendant 15 s et recuit/étendre à 60 °C pendant 25 s pendant 40 cycles. Normaliser les valeurs brutes de CT (seuil de cycle) aux niveaux de gènes d’entretien (c.-à-d. Hprt et Pde12) en calculant ΔΔCT comme décrit ici38. Voir20 pour les séquences d’amorce.REMARQUE: Les pratiques standard pour l’analyse RT-qPCR doivent être suivies, telles que l’utilisation d’un contrôle de transcription inverse (-RT) moins, la réaction PCR et la validation de l’amorce.