İskelet Kasında Kas İçi Yağ Oluşumunu ve Hücresel Kökenini İnceleme Kılavuzu

Tüm hayvan protokolleri, Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. FAP’ların genetik soy takibi NOT: FAP’ların genetik soy takibi istenmiyorsa, adım 1 atlanabilir. FAP’ların soy çizgisi izlemesini gerçekleştirmek için, gerekli fare alellerini edinin.NOT: Pdgfrα promotorunun kontrolü altında, Hogan29, Rando27 ve Bergles32 laboratuvarları da dahil olmak üzere FAP’ları başarılı bir şekilde hedeflemek için çeşitli tamoksifen kaynaklı Cre hatları üretilmiştir. Cre aktivitesinin genetik bir muhabiri olarak, Rosa26 EYFP33 gibi çok sayıda Rosa26 muhabir aleli mevcuttur. Her laboratuvarın hangi Cre-Reporter kombinasyonunun en etkili olduğunu belirlemesi önerilse de, Pdgfrα CreERT2 farelerini (29 ve Jax # 032770) Rosa26EYFP (33 ve Jax # 006148) muhabirine geçerek, ortaya çıkan PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFPfareleri, FAP20’yi verimli ve özel olarak işaretlemek için kullanılabilir. Olgun FAP’ların kaderini izlemek için, tamoksifen uygulamadan önce farelerin en az ~ 10 haftalık olana kadar beklemeniz önerilir. Soy izleme deneyleri hem erkekler hem de kadınlar üzerinde yapılabilir. Oral gavaging yoluyla tamoksifen uygulaması Mısır yağında 40 mg / mL tamoksifen hazırlayın ve gavagingden 1 gün önce karıştırmak için iyice vorteks yapın. O/N’yi 37 °C’de döner hibridizasyon fırınında inkübe edin.DİKKAT: Tamoksifen bir kanserojendir ve dikkatli kullanılmalıdır. Kullanırken daima eldiven giyin ve toz olarak tartarken maske takın, çünkü solunması tehlikesi vardır. Alanı protokole göre temizleyin ve 1 mL’lik bir şırıngaya bir gavaging iğnesi takın. Şırıngaya 200 μL tamoksifen çekin. Scruff PdgfrαCreERT2 ; Rosa26EYFP fareleri (10 haftalık; her iki cinsiyet de kullanılır) düz bir yüzeye yerleştirerek ve kuyruğun tabanını sıkıca kavrayarak. Farenin ortasını başparmak ve işaret parmağıyla kavramak için serbest bir el kullanın, ardından hafifçe ve hafif bir basınçla omuzları geçene kadar tutuşu kaydırın. Cildi başparmak ve işaret parmağıyla geri sıkıştırın, fareyi alın ve eli fare kullanıcıya bakacak şekilde çevirin ve kuyruğu fareyi tutan elin pembemsi ve yüzük parmağı arasına sıkıştırın. Bu noktada, farenin iyi hareketsiz olduğundan ve başını veya kollarını hareket ettiremediğinden emin olun. Gavaging iğnesini ağzınıza yerleştirin ve farenin başını hafifçe geriye doğru eğmek için kullanın; bu, yemek borusunun daha iyi erişilebilir olmasını sağlar. İğneyi dikkatlice ve yavaşça yemek borusuna yerleştirin. Herhangi bir direnç karşılaşılırsa iğneyi zorlamayın; iğne kolayca aşağı kaymalıdır. Tamoksifeni yavaşça enjekte edin. Gavaging sırasında herhangi bir sorun oluşmadığından emin olmak için fareleri 15-20 dakika boyunca izleyin.NOT: Tamoksifenin art arda 2 günde uygulanması tipik olarak herhangi bir olumsuz etkiye neden olmadan FAP’ların ~% 75 -% 85 rekombinasyon verimliliği ile sonuçlanır. Kullanıcının yaralanmaya neden olmadan önce 1-2 hafta beklemesi önerilir, bu da kalan tamoksifenin sistemden çıkarılmasına ve kalan proteinin döndürülmesine izin verecektir. 2. Tibialis anterior (TA) kas yaralanması NOT: Kas içi yağları incelemek için, gliserol bazlı bir yaralanma modeli (steril salinde gliserol) kullanılması önerilir, bu da masif kas içi yağ oluşumu34,35,36,37 ile sonuçlanır. İzofluran ekleyerek ve hem fare odasına hem de burun konisine tüplerin açık olduğundan emin olarak anestezi makinesini hazırlayın. Odayı ve çalışma alanını% 70 etanol veya peroksit çözeltisi ile temizleyin (protokollere bağlı olarak). Oksijen akış hızını 2,5 L/dak’ya ve izofluran konsantrasyonunu %2,5’e ayarlayın. Anestezi odasına bir fare yerleştirin ve anestezi altına alınması için ~ 5 dakika bekleyin. Fareyi sırtüstü yatarak temiz bir ısıtma yastığına yerleştirin ve burnu burun konisine yerleştirin. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için veteriner oftalmik merhemini pamuk uçlu bir aplikatör ile gözlere nazikçe uygulayın. Anesteziyi sürekli izleyin ve farenin tamamen anestezi altına alındığından emin olmak için yaralanmadan önce fareye ayak parmağınızı sıkıştırın. Dezenfekte etmek için enjekte edilecek bacağı taze bir alkollü mendille temizleyin. İnsülin şırıngasına 30-50 μL% 50 gliserol (farelerin boyutuna bağlı olarak) çekin. TA’nın yerini ortaya çıkarmak için saçları hafifçe fırçalayın.NOT: Alkollü mendilden hala ıslakken saçı hareket ettirmek ve daha iyi görselleştirme elde etmek daha kolaydır. TA’yı bulduktan sonra (tibiaya hemen yanal, deriden hafifçe çıkıntı yapar ve nazik palpasyonla hissedilebilir), iğneyi ayak bileğinin yakınında, distal olarak TA’ya yerleştirin. İğneyi kasın içine tamamen yerleştirin ve yavaşça gliserol enjekte ederken, iğneyi yavaş yavaş geri çekin, bu da kasın çoğuna zarar vermeye yardımcı olur.NOT: İğneyi bacağa paralel olarak, sadece hafifçe yükseltilmiş bir açıyla yerleştirmek en iyisidir. İyi bir yaralanma tipik olarak dorsifleksiyona neden olur, çünkü TA iğneyi çektikten sonra büzülür. Farenin ayak parmakları yayılmışsa, ekstansör digitorum longus (EDL) kasının enjekte edilmiş olması muhtemeldir. Fareyi tekrar kafese yerleştirin ve anestezi iyileşmesini sağlamak için yaklaşık 15-20 dakika boyunca izleyin. İğneyi keskin bir kaba atın. Asla bir iğneyi özetlemeyin.NOT: Gliserol enjeksiyonu sonrası analjezi, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandığı şekilde sağlanmalıdır. Adipositler yaralanmadan 5 gün sonra (dpi) gözlenebilir. 7 dpi ile, tüm adipositler oluşmuş ve 21 dpi ile tamamen olgunlaşmışlardır. 3. Doku hasadı 1x PBS’de% 4 PFA hazırlayın ve hasada başlamadan önce buzun üzerine yerleştirin. Buz üzerine kas fiksasyonu için kullanılan herhangi bir plakayı (12 veya 24 kuyucuk) yerleştirin ve her bir kuyucuğa% 4 PFA ekleyin, böylece her bir kuyucuğun sabitlenen dokudan 10-20 kat daha fazla PFA hacmine sahip olduğundan emin olun. Gliserol hasarından 7 ila 21 gün sonra, fareyi Kurumsal kılavuzlara göre ötenazi yapın (yani, izofluran doz aşımı ve ardından servikal çıkık). Histoloji veya RNA izolasyonu için kullanılacak dokuları toplamaya başlayın.NOT: Dokular fedakarlıktan sonraki 10-15 dakika içinde çıtçıtlı dondurulmalı veya PFA’ya yerleştirilmelidir (Şekil 2). Saçları diseksiyon alanından ve aletlerden uzak tutmaya yardımcı olmak için farenin kesilecek herhangi bir alanına% 70 etanol ile serbestçe püskürtün. Pelvisin yakınında, bacağın üst kısmındaki cildi kesmek için makas kullanın (Şekil 3A). Bacağın derisini yukarıdan aşağıya doğru yavaşça ayak bileğine doğru çekin (Şekil 3B).NOT: TA, medial çivi yazısı ve ilk metatarsal kemiğe bağlanan açıkça tanımlanmış bir distal tendona sahip gözyaşı damlası şeklinde bir kastır. Tibiaya yanaldır ve alt dize kadar uzanır. İlk olarak, TA’yı hasat etmeden önce keskin uçlu cımbız kullanarak dış bağ dokusu tabakasını (epimisyum) çıkarın (Şekil 3C). Epimisyumu daha iyi görselleştirmek için diseksiyon mikroskobu kullanın. TA’nın altındaki cımbızı kasın altından distal tendondan başlayarak kaydırın ve yavaşça dize doğru yukarı doğru çekin (Şekil 3D). Kasın sonunda durun; alt dizde hissedilen direnci geçmeyin. Alt diz seviyesine ulaşmadan önce önemli bir direnç varsa, artık bağ dokusu katmanlarını durdurun ve çıkarmaya devam edin.NOT: TA’ya yanal ince bir kas olan EDL’ye bağlanan TA tendonunun hemen yanında başka bir distal tendon vardır. Cımbızları sadece TA tendonunun altına kaydırmaya dikkat etmek, EDL’nin yanlışlıkla toplanmasını önler, ancak fiksasyondan sonra kolayca çıkarılabilir. TA, cımbızla bacaktan kısmen kaldırıldıktan sonra, TA’nın alt dize bağlantısını kesmek için aynı hareketi bir neşterle kullanın (Şekil 3E). TA’yı tamamen çıkarmak için ayak bileğindeki tendonu makasla kesin. Liflere zarar vermemek için sadece tendondaki kası tutun. TA’nın 1/3’ünü tendonun karşısındaki uçta kesin (Şekil 3F), bir mikrosantrifüj tüpüne koyun ve sıvı azota düşürerek dondurun (Şekil 3H). Dokunun diğer 2 / 3’ünü histoloji için% 4 PFA ile etiketlenmiş bir kuyuya batırın (Şekil 3I). İlk ve son dokunun fiksatif olarak ne zaman yerleştirildiğini takip ettiğinizden emin olun. 4 °C’de 2-2,5 saat çalkalayıcıya yerleştirin. Fiksasyon süresi dokuya ve büyüklüğüne bağlıdır. Dokuları sabitlemek için gereken süreyi belirleyin. TA’ların 4 ° C’de 2-2.5 saat boyunca sabitlenmesi tipik olarak dokunun aşırı fiksasyonuna neden olmadan adiposit morfolojisini iyi korur.NOT: TA’yı tam montajlı immünofloresan boyama için kullanmayı planlıyorsanız, Bölüm 7’ye ulaşana kadar bu protokolün geri kalanını atlayın: “Tüm Mount İmmünofloresan Boyama”. Fiksasyondan sonra, PFA’yı kuyucuklardan çıkarın, dokuları soğuk 1x PBS ile 2-3 kez durulayın ve ardından yıkama başına 5 dakika boyunca soğuk 1x PBS ile 2-3 kez yıkayın. PBS’yi kuyucuklardan çıkarın ve dokunun yüzmesine izin vermek için 1x PBS’ye yeteri kadar% 30 sakkaroz ekleyin. Çalkalayıcıya gece boyunca 4 ° C’de yerleştirin. Şekil 3: Doku hasadı özeti . (A) Deri bacağın tabanında kesilir ve (B) arka ekstremite kasları açığa çıkar. (C) Epimisyum TA’dan çıkarıldıktan sonra, (D) forseps kası kısmen ayırmak ve epimisyumun tamamen çıkarılmasını sağlamak için kullanılır. (E) TA, bacaktan neşterle kesilir ve tendon kesildikten sonra çıkarılır. (G) TA’yı üçte bir ve üçte iki parçaya kestikten sonra, (H) üçte biri RT-qPCR analizi için sıvı azotta dondurulur ve (I) diğer üçte ikisi histoloji için% 4 PFA’da sabitlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 4. Katıştırma Gömme için kullanılacak numune kalıplarını, dokuları tamamen suya batırmak için yeterli gömme ortamı ile etiketleyerek ve doldurarak hazırlayın. Kuyucuklardan mendilleri çıkarın, fazla sakarozu bir kağıt havlu üzerinde kurutun ve dondurucu orta dolgulu numune kalıplarına geçin.NOT: Kalıbın kriyostat üzerinde hangi yönde bölümleneceğini bilmek yararlıdır. Bu sayede kullanıcı kalıptaki dokuları ilgi alanına kolayca ulaşılmasını sağlayacak şekilde yönlendirebilir. TA için bu, en kalın ucu (tendon tarafının karşısında) kesitlenecek yüzeye bakacak şekilde koyarak elde edilebilir. Bu, TA’nın en kalın kısmında (göbek) kolayca kesitlenebilmesini sağlar ve kas liflerinin kesitsel olarak kesilmesine izin verir. İzopentan tutan bir kabı kısmen sıvı azota batırarak bir isopentan bulamacı hazırlayın. Kapta, dokuları gömmek için kullanılacak numune kalıbının yaklaşık yarısını batırmak için yeterli sıvı isopentan bulunduğundan emin olun. Kalıpları dikkatlice isopentan bulamacına koyarak ve kalıbın yaklaşık yarısının suya batırıldığından emin olarak dondurmaya başlayın. Ayrıca, kalıbın dört taraftan da eşit şekilde donduğundan emin olun. Tüm kalıp üstten gözle görülür şekilde dondurulmadan hemen önce kalıbı isopentandan çıkarın. Bunun ne kadar süreceği, kullanılan kalıplara bağlıdır. Dondurulmuş kalıpları, blokların geri kalanını dondururken kuru buzlu bir kapta saklayın, ardından -80 ° C’de saklayın.NOT: Donma için isopentan tekrar kullanılabilir. Bir cam şişeye koyun, ancak isopentan oda sıcaklığına (RT) ulaşana kadar kapağı sıkmayın. Aksi takdirde, basınçtaki değişiklik şişeyi parçalayabilir. 5. Bölümleme Kriyostatı -22 ila -24 ° C’ye ayarlayın, kriyostata TA’lar içeren kalıplar ekleyin ve sıcaklık iklimlendirmesi için en az 30 dakika bekleyin. Bu arada, bir dizi pozitif yüklü mikroskop slaytını etiketleyin. Bir anti-roll plaka yerleştirin ve kriyostat’a, numune bloğuyla temas ettiği plakada minimum çentik olacak şekilde hizalayın. Yerinde emniyete alın. Bıçak tutucuya yeni bir kriyostat bıçağı yerleştirin ve yerine sabitleyin.DİKKAT: Bıçak keskindir. Kriyostatın veya donmuş kalıpların diğer kısımlarını manipüle ederken bıçağı örtün. Donmuş bloğu kalıptan çıkarın. Kriyostat mandrene düzgün bir gömme ortamı tabakası ekleyin ve bloğu ortama yerleştirin. Gömme ortamı tamamen donana kadar 1-3 dakika bekletin (opak beyaz).NOT: TA’lar için, en kalın alan (göbek) mandren üzerindeyken görünür olmalıdır. Kriyostat mandrenini doku bloğu ile kriyostatın içine yerleştirin. Bıçağı ortaya çıkarın ve kriyostatı bıçakla temas edene kadar ileri doğru ilerletin. Doku artık gömme ortamı tarafından gizlenmeyene kadar 25 μm kesitlerde blok boyunca kesitleyin.NOT: Bölümleme sırasında, kriyostatın açısını ve / veya sahnenin konumunu, bölümler eşit kalınlıkta olacak şekilde ayarlayın. Kesit kalınlığında homojenliği sağlamak için birkaç bölüm toplamak yararlı olabilir. Kullanıcının, TA (göbek) içindeki ilgili bölgeye doğru bölümlemeden önce uygun yuvarlanma önleyici plaka konumunu bulması önerilir, çünkü bu, kullanıcının bölümler doku israf etmeden düz bir şekilde çıkana kadar yuvarlanma önleyici plakanın birkaç konumunu denemesine izin verir. Bölüm kalınlığını 10-12 μm’ye değiştirin ve bölümleri etiketli mikroskop slaytlarında toplayın. Seri kesitleme, bitişik bölümlerin 6-10 slaytta (1-x etiketli) toplanmasıyla önerilir, bu da birden fazla işaretleyici için lekelenmeye izin verir. Gerekirse, bölümleri slaytta toplamadan önce açmak için ince bir fırça kullanın.NOT: Kesitler kıvrılıyorsa, sıcaklığın -22 ila -24 °C aralığında sabit kaldığını kontrol edin. Bölümlerde dikey çizgiler varsa, bunun nedeni yuvarlanma önleyici plakadaki veya bıçaktaki bir çentik olabilir; bu, yuvarlanma önleyici plakanın konumunu ayarlayarak ve/veya yeni bir bıçağa geçerek düzeltilebilir. Aynı kesit düzleminin bitişik bölümlerini her slaytta topladıktan sonra, blok boyunca 150-200 μm ilerlemek için kalınlığı tekrar 25 μm’ye ayarlayın, ardından kalınlığı tekrar 10-12 μm’ye ayarlayın ve tekrar bölümlemeye başlayın.NOT: Bu seri bölümleme, kullanıcının TA aracılığıyla farklı derinliklerde görselleştirmesine, görüntülemesine ve ölçmesine olanak tanır; slayt başına üç ila dört seri bölüm yeterlidir. Slaytları ve doku bloklarını -80 °C’de saklayın. 6. Doku kesitlerinin immünofloresan (IF) boyanması NOT: Antikor konsantrasyonları lotlar ve üreticiler arasında değişebildiğinden, ilgili slaytları boyamadan önce test slaytlarındaki antikorların birkaç farklı konsantrasyonunun değerlendirilmesiyle optimizasyon önerilir. RT’de veya 37 °C’de sıcak bir plaka üzerinde 10-20 dakika boyunca çözülme/kuru kızaklar. Slaytın kağıt yüzeyinin kenarında, camla buluştuğu yerde bir çizgi çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın. Slaytları bir Coplin kavanozuna koyun ve doku bölümlerini yeniden sulandırmak için yıkama başına en az 5 dakika boyunca bir çalkalayıcıda 1x PBS +% 0.1 Tween20 (PBST) 3-5x ile yıkayın.NOT: Bu noktada, slaytların PBST’ye batırılmadan (hidrofobik çizgiye kadar) oturmasına izin vermemek önemlidir, aksi takdirde doku bölümleri kurur. Slaytları bir nemlendirme odasının rafına yerleştirin ve slaytları RT’de 1-2 saat boyunca 310-350 μL bloke çözeltisi (% 5 eşek serumu ve% 0.3 Triton X-100 1x PBS’de) ile örtün.NOT: Ekstra geçirgenlik adımına gerek yoktur, çünkü bloke edici çözelti doku kesitlerinin yeterli geçirgenliğine izin veren% 0.3 Triton X-100 içerir. Farelerden türetilen birincil antikorları (yani, aşağıda listelenen PAX7 ve MYOD1) kullanırken, engelleme adımı için engelleme çözeltisine Fab parçaları (1:50) kullanarak fare üzerinde fare engelleme adımı eklemeniz önerilir. Bu, fare sekonder antikorunun primer dışındaki antikorlara spesifik olmayan bağlanması nedeniyle arka planın azaltılmasına yardımcı olacaktır. Bir sonraki adıma geçmeden kısa bir süre önce bloke edici çözeltide kullanılacak birincil antikorları aşağıdaki gibi seyreltin: Adiposit boyama ve tüm kesit görüntüleme için birincil antikorlar: Tavşan anti-Perilipin’i 1:1000 seyreltme oranında seyreltin. Adipositlerin soy takibi için birincil antikorlar: Tavuk anti-GFP’sini 1:1000 oranında ve tavşan anti-Perilipin’i 1:1000 oranında seyreltin. FAP’ların soy takibi için birincil antikorlar: Tavuk anti-GFP’yi 1:1000 oranında ve keçi anti-PDGFRα’yı 1:250 oranında seyreltin. Miyojenik belirteçler için birincil antikorlar: Fare anti-PAX7’yi 1:25 oranında veya fare anti-MYOD1’i 1:250’de ve tavşan anti-LAMININ’i 1:1000’de seyreltin.NOT: Yukarıda listelenen antikorlar bu protokolle başarılı bir şekilde değerlendirilmiş olsa da, FAP’ları, adipositleri ve / veya diğer hücre tiplerini etiketleyen diğer belirteçlerin ve antikorların da bu protokolle uyumlu olması muhtemeldir. Birincil antikorları ilk kez kullanırken, kullanıcının birincil antikorların atlandığı negatif bir kontrol slaytı içermesi şiddetle tavsiye edilir. Bu, antikorların özgüllüğünü kontrol edecektir. Sekonder antikorların eklenmesi de dahil olmak üzere protokoldeki diğer tüm adımlar izlenir, ancak bloke edici çözeltideki birincil antikor yerine bir sonraki adımda bloke edici çözelti tek başına kullanılır. Blokaj çözeltisini slaytlardan boşaltın ve birincil antikorlarla 310-350 μL bloke çözeltisi ile örtün ve nemlendirme odasında gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin. Ertesi gün, bloke edici çözeltiyi / birincil antikorları slaytlardan boşaltın ve bir Coplin kavanozuna yerleştirin. Slaytları PBST ile 2-3 kez durulayın ve yıkama başına en az 5 dakika boyunca bir çalkalayıcıda PBST ile 3-5x yıkayın. Son yıkama sırasında, ikincil antikorları veya blokaj çözeltisinde kullanılacak herhangi bir doğrudan konjugatı hazırlayın. Fotobeyazlatmayı önlemek için bu antikorların ışıkta geçirdiği süreyi en aza indirin. Sekonder antikorları/doğrudan konjugatları seyreltin: 488 nm eşek anti-tavuk (1:1000) veya tavşan karşıtı (1:1000) veya fare karşıtı (1:1000), 568 nm eşek anti-keçi (1:1000) veya anti-tavşan (1:1000) veya Phalloidin (miyofiberler; 1:100), DAPI boyası (çekirdekler; 1:500). Kızakları, nemlendirme odasında ikincil antikorlar ve / veya doğrudan konjugatlarla bloke edici çözeltinin 310-350 μL’si ile örtün. RT’de 1-2 saat boyunca inkübe edin. Örnekleri şu andan itibaren ışıktan koruyun. Bloke edici çözeltiyi / ikincil antikorları boşaltın ve bir Coplin kavanozuna yerleştirin. PBST ile bir kez durulayın ve yıkama başına en az 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde PBST ile 3-5x yıkayın. Işığa maruz kalmayı önlemek için Coplin kavanozunu kapalı tutun. Kenarlara dokunarak ve sırtı bir kağıt havluya karşı silerek slaytları mümkün olduğunca kurutun, ancak mendil bölümlerinin kurumasına izin vermeyin. Kızağın üst yatay kenarına üç veya dört damla sulu montaj ortamı ekleyin ve yavaşça bir kapak kayması ekleyin. Kapak kaymasının altında hava kabarcıkları oluşursa aşağı bastırmayın veya hareket etmeyin; herhangi bir basınç veya hareket, adipositlerin kırılgan hücresel mimarisini bozabilir. Görüntülemeden önce montaj ortamının gece boyunca karanlıkta kalmasına izin verin. 7. Tam montajlı immünofloresan boyama ~ 1 saatlik fiksasyondan sonra (bkz. adım 3.14), sabit TA’dan miyolifleri soymak için keskin uçlu cımbız kullanın. Ayrılan lifleri 24 delikli bir tabağa yerleştirin ve PBST ile her biri 3 dakika boyunca 3 kat yıkayın. Sonraki tüm inkübasyonlar için, buharlaşmayı önlemek için kapağı eklediğinizden emin olun. Antikorların daha iyi penetrasyonunu sağlamak için bir çalkalayıcıda RT’de (200-300 μL) 1x PBS’de% 1 Triton X-100’de 1 saat boyunca inkübe edin. PBST ile birkaç kez duruladıktan sonra, blokaj çözeltisi (200-300 μL) ile örtün ve 4 ° C’de gece boyunca bir nutator veya çalkalayıcı üzerinde bloke edin. Blokaj çözeltisinde birincil antikorları istenen konsantrasyonda seyreltin (konsantrasyonun iki katına çıkarılması iyi bir başlangıç noktası olma eğilimindedir). Numuneleri (200-300 μL) bir nutator veya çalkalayıcı üzerinde gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin. Numuneleri gün boyunca PBST ile titizlikle yıkayın, çalkalayıcıdaki RT’de sık sık değişiklik yapın, her yıkamada 30-60 dakika boyunca yaklaşık 4-6x. Blokaj çözeltisindeki ikincil antikorları istenen konsantrasyonda (1:500 iyi çalışma eğilimindedir) artı nükleer boyama ile seyreltin ve numuneleri (200-300 μL) 4 ° C’de gece boyunca bir nutator veya çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Numuneleri çalkalayıcıdaki RT’de sık sık değişikliğe uğrayarak gün boyunca PBST ile titizlikle yıkayın, her yıkamada 30-60 dakika boyunca yaklaşık 4-6x kez veya gece boyunca 4 ° C’de yıkayın. Monte etmek için, fazla PBST’yi nazikçe kurutun ve ardından lifleri bir cam slayt üzerinde bir veya iki damla montaj ortamına yerleştirin (Şekil 4A). Kapak kaymasını (18 mm x 18 mm) yükseltmek için küçük kil ayaklar ekleyin; bu, liflerin ezilmesini önleyecek ve kapak kaymasını slayta sabitleyecektir. Modelleme bileşikleri bunun için iyi çalışır. Kapak kayması sabitlendikten sonra, kapak kaymasının altındaki alan dolana kadar kenara daha fazla orta ekleyin.NOT: Solma önleyici ajanlar içeren bir montaj ortamı kullanmak yerine, doku yükselen bir gliserol serisinden (PBS’de% 30 ila% 80 gliserol) de hareket ettirilebilir. Montaj ortamının kürlenmesini sağlamak için görüntülemeden önce 1-2 gün bekleyin. 8. Kas içi yağın görüntülenmesi Mikroskobu açın ve görüntüleme yazılımını başlatın. Slaytı sahne alanında sabitleyin.NOT: Kas kesitlerindeki adipositleri görüntülemek için, geniş alan mikroskobu ile kombine edilmiş 5x veya 10x objektif genellikle yeterlidir. WM-IF’yi görselleştirmek için bir konfokal mikroskop gereklidir. Görüntülenecek alanı tanımlamak için herhangi bir kanalı kullanın. Görüntüleme yazılımında, her kanal için kazanç ve pozlama süresini ayarlayın. Her kanaldaki tüm dokunun görüntülerini alın (mikroskop ve kullanılan yazılıma göre otomatik veya manuel) ve tam TA kesitinin bir bileşimini oluşturmak için tek tek karoları birleştirin.NOT: Aynı TA’nın iki veya üç farklı bölümünün görüntülerini farklı derinliklerde çekmeniz önerilir. Her bölümdeki adipositleri ölçerek ve daha sonra ortalamayı bildirerek, örneğin enjeksiyon hatalarından dolayı kas içi yağ miktarındaki lokalize farklılıklardan kaçınılacaktır. 9. Adipositlerin nicelleştirilmesi Daha önce yüklenmemişse, Hücre Sayacı eklentisini ImageJ’ye (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html) ekleyin. Görüntüleri ImageJ’ye TIF dosyaları veya orijinal mikroskop dosyaları olarak aktarın. ImageJ’deki her kanalı ayrı bir TIF dosyası olarak görüntüleyin.NOT: LIF veya benzeri mikroskop dosyası türleri kullanılıyorsa, Biyolojik Biçimler İçe Aktarma seçenekleri altında, Yığını Birlikte Görüntüle için Köprü Yığını’nı seçin ve Kanalları Böl kutusunu işaretleyin. Dosyayı açmak için Tamam’ı tıklatın. Ayrıca, Otomatik Ölçeklendirme kutusunun işaretli olmadığından emin olun. Her kanalın görüntülerinin 8 bit biçiminde (ve gri) olduğundan emin olun: Görüntü > > 8 bit yazın. DAPI (mavi), GFP (yeşil), PERILIPIN (kırmızı) ve PHALLOIDIN (gri) görüntüleri birleştirme: Görüntü > Renk > Kanalları Birleştirme. Ölçeğin (Analiz > Kümesi Ölçeği) mikron cinsinden olup olmadığını kontrol edin. Serbest seçim aracını kullanarak, her kesitin yaralı ve yaralanmamış kısmını ana hatlarıyla belirtin, ardından ölçün (Analiz > Ölçüm) ve yaralı ve yaralanmamış alanı bir elektronik tabloya kaydedin.NOT: Yaralı kas, miyoliflerden yoksun alanlar veya merkezi olarak yerleştirilmiş çekirdekler içeren miyoliflerin doldurduğu alanlar olarak tanımlanabilir. Hücre sayacını başlat: CellCounter> eklentileri başlatmak >. Bir sayaç türü seçin, ardından her adipositi sayın. Toplam adiposit sayısını bir elektronik tabloya kaydedin, ardından yaralı alanın 1mm2’si başına adiposit sayısını hesaplayın. 10. RT-qPCR kullanılarak adipojenik gen ekspresyon analizi RNA İzolasyonu Başlamadan önce, RNaz içermeyen suyu önceden 45 ° C’ye ısıtın ve taze% 70 EtOH (numune başına 350 μL) hazırlayın. Numuneyi içeren her tüpe 1.000 μL guanidium tiyosiyanat ekleyin (bkz. adım 3.12.). Boncuk çırpıcı onaylı tüplerin kullanılması önemlidir.DİKKAT: Guanidium tiyosiyanat toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve bir duman başlığı içinde tutun. Her tüpe üç orta boy boncuk veya bir büyük ve bir küçük boncuk ekleyin. Bir boncuk çırpıcı kullanarak dokuyu 50 Hz’de 2-4 dakika homojenize edin. Doku tipine ve numune büyüklüğüne bağlı olarak, 10 dakika kadar sürebilir. 200 μL kloroform ekleyin.DİKKAT: Kloroform toksiktir. Kişisel koruyucu ekipman giyin ve bir duman başlığı içinde tutun. Örnekleri 15 s boyunca çalkalayın. RT’de 2-3 dakika kuluçkaya yatırın. 12.000 x g’da 15 dakika santrifüj. Şeffaf süpernatantın (RNA’yı içeren üst tabaka) 350 μL’sini pipetle çıkarın ve 350 μL% 70 etanol içeren yeni bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Alt protein ve / veya DNA katmanlarını aspire etmemeye dikkat edin 700 μL’ye kadar karışımı, 2 mL’lik bir toplama tüpüne yerleştirilmiş bir mini spin kolonuna aktarın. Üreticinin talimatlarını izleyerek RNA izolasyonu ile devam edin. Beklenen verime bağlı olarak 30-50 μL RNaz içermeyen su ile sültü. RNA’yı buz üzerinde tutun ve bir spektrofotometre kullanarak verimi ölçün. RNA’yı -80 °C’de saklayınNOT: DNaz tedavi adımını atlamak mümkündür, çünkü RNA tabakasının sadece üst 350 μL’sini dikkatlice çıkarmak DNA kontaminasyonunu önlemede yeterlidir. RT-qPCR analizine ek olarak, izole RNA, RNA dizilimi için de kullanılabilir, bu durumda bir DNaz tedavi adımı şiddetle tavsiye edilir. cDNA sentezi Üreticinin talimatlarını izleyerek cDNA’yı bir cDNA sentez kiti ile sentezlemek için 1 μg’a kadar RNA kullanın. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, 80 μL RNaz içermeyen su ekleyin. Numuneleri -20 °C’de saklayın. Adiposit seçici genlerin RT-qPCR’si. 384 kuyucuklu bir format kullanarak, her bir kuyucuğun dibine 1 μL astar (~ 1 μM nihai konsantrasyon) ekleyin. Ön kurutma astarları daha sıkı teknik kopyalarla sonuçlanır. Astarlar tamamen buharlaşana kadar kapalı bırakın (plaka, buharlaşmayı hızlandırmak için 37 ° C’ye ayarlanmış bir ısıtma bloğuna yerleştirilebilir). Dört ila sekiz teknik replikasyonla numune reaksiyonlarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 2.5 μL boya bazlı RT-PCR ana karışımı, 2.1 μL RNaz içermeyen su ve kuyu başına 5 μL toplam hacim ile 0.4 μL cDNA (~ 1 ng). Aşağıdaki termal çevrim koşulları kullanılmıştır: 15 s için 95 ° C’de denatüre etme ve 40 döngü için 25 s için 60 ° C’de tavlama / uzatma. Burada açıklandığı gibi ΔΔCT’yi hesaplayarak ham BT (döngü eşiği) değerlerini temizlik genleri (yani Hprt ve Pde12) seviyelerine normalleştirin38. Astar dizileri için20’ye bakınız.NOT: RT-qPCR analizi için eksi Ters Transkripsiyon (-RT) kontrolü, PCR reaksiyonu ve primer validasyon kullanımı gibi standart uygulamalar izlenmelidir.