骨格筋における筋肉内脂肪形成とその細胞起源を調べるためのガイド

すべての動物プロトコルは、フロリダ大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。 1. FAPの遺伝的系統追跡 注: FAP の遺伝的系統トレースが望ましくない場合は、ステップ 1 をスキップできます。 FAPの系統追跡を行うには、必要なマウス対立遺伝子を得る。注:Pdgfrαプロモータの制御下で、ホーガン29、ランド27、およびベルグルズ32研究所を含むFAPを首尾よく標的にするために、いくつかのタモキシフェン誘導性Creラインが生成されました。Cre活性の遺伝子レポーターとして、Rosa26 EYFP33などの多数のRosa26レポーター対立遺伝子が利用可能である。各研究室では、どのCre-Reporterの組み合わせが最も効果的であるかを判断することが推奨されていますが、Pdgfrα CreERT2マウス(29およびJax#032770)をRosa26EYFP(33およびJax#006148)レポーターに交配することによって、PdgfrαCreERT2が得られます。Rosa26EYFPマウスは、FAPs20を効率的かつ特異的にマーキングするために使用することができる。成熟FAPの運命をたどるためには、タモキシフェンを投与する前に、マウスが少なくとも〜10週齢に達するまで待つことが推奨される。系統追跡実験は、男性と女性の両方に対して行うことができる。 経口経管栄養によるタモキシフェン投与 40mg/mLのタモキシフェンをコーンオイルとボルテックスによく調製し、経管栄養の1日前に混合する。回転ハイブリダイゼーションオーブン中で37°CでO / Nをインキュベートします。注意:タモキシフェンは発がん性物質であり、慎重に取り扱う必要があります。取り扱い時には必ず手袋を着用し、粉末として計量する場合は吸入の危険性があるためマスクを着用してください。 プロトコルに従って領域を清掃し、経管栄養針を1mLシリンジに取り付けます。200μLのタモキシフェンをシリンジに引き込む。 Scruff PdgfrαCreERT2 ;Rosa26EYFPマウス(生後10週;両性使用)を平らな面に置き、尾の付け根をしっかりとつかむ。空いている手で親指と人差し指でマウスの中央をつかみ、軽く少しの圧力でグリップを肩のすぐそばまでスライドさせます。 親指と人差し指で皮膚をつまみ返し、マウスを拾い上げてマウスがユーザーの方を向くように手をひっくり返し、マウスを持つ手のピンキー指と薬指の間に尾を挟みます。 この時点で、マウスがしっかりと固定されていて、頭や腕を動かすことができないことを確認してください。経管栄養針を口に挿入し、マウスの頭をわずかに後ろに傾けるためにそれを使用します。これにより、食道へのアクセス性が向上します。 慎重にゆっくりと針を食道に挿入します。抵抗が満たされた場合、針を強制しないでください。針は簡単に滑り落ちるはずです。ゆっくりとタモキシフェンを注入する。マウスを15〜20分間監視して、経管栄養中に問題が発生していないことを確認します。注:タモキシフェンを2日間連続して投与すると、典型的には、有害作用を引き起こすことなく、FAPの〜75%〜85%の組換え効率が得られる。ユーザーは、残りのタモキシフェンを系から除去し、残りのタンパク質をひっくり返すことを可能にする傷害を誘発する前に1〜2週間待つことが推奨される。 2.前脛骨筋(TA)の損傷 注:筋肉内脂肪を研究するには、大量の筋肉内脂肪形成をもたらすグリセロールベースの傷害モデル(滅菌生理食塩水中の50%グリセロール)を使用することが推奨される34,35,36,37。 イソフルランを添加し、マウスチャンバーとノーズコーンの両方にチューブが開いていることを確認することによって麻酔機を準備します。チャンバーと作業領域を70%エタノールまたは過酸化物溶液(プロトコルに応じて)で洗浄します。 酸素流量を2.5L/min、イソフルラン濃度を2.5%に設定した。マウスを麻酔室に入れ、麻酔をかけるまで〜5分間待ちます。 マウスを清潔な加熱パッドの上に仰臥位に置き、ノーズをノーズコーンに挿入します。麻酔下での乾燥を防ぐために、綿の先端のアプリケーターで獣医の眼軟膏を目に優しく塗布します。麻酔を継続的に監視し、怪我をする前にマウスのつま先ピンチを実行して、マウスが完全に麻酔されていることを確認します。 消毒するために新鮮なアルコールワイプで注入する脚をきれいにします。 30〜50μLの50%グリセロール(マウスのサイズに応じて)をインスリンシリンジに引き込む。すねの毛をそっとブラッシングして、TAの位置を露出させます。注:髪を動かし、アルコールワイプからまだ濡れているときにより良い視覚化を達成する方が簡単です。 TAの位置を特定した後(脛骨のすぐ外側にあり、皮膚からわずかに突き出ており、穏やかな触診で感じることができます)、足首の近くの遠位でTAに針を挿入します。針を筋肉に完全に挿入し、徐々に針を引っ込めながらゆっくりとグリセロールを注入すると、筋肉の大部分を傷つけるのに役立ちます。注:針を脚に平行に挿入し、角度を少し上げるのが最善です。良好な傷害は、典型的には、針を抜いた後にTAが収縮するにつれて背屈を引き起こす。マウスのつま先が広がった場合は、伸筋桁ロンガス(EDL)筋肉が注入された可能性があります。 マウスをケージに戻して約15〜20分間監視し、麻酔回復を確実にします。 針を鋭利な容器に捨てます。針をふさいではいけません。注:グリセロール注射後の鎮痛は、施設動物ケアおよび使用委員会の承認に従って提供する必要があります。脂肪細胞は、傷害後5日(dpi)に直ちに観察することができる。7 dpiまでに、すべての脂肪細胞が形成され、21 dpiによって、それらは完全に成熟した。 3. ティッシュハーベスト 1x PBSで4%PFAを準備し、収穫を開始する前に氷の上に置きます。 筋肉固定に使用するプレート(12ウェルまたは24ウェル)を氷の上に置き、各ウェルに4%PFAを加え、各ウェルに固定されている組織よりも10〜20倍のPFA容量があることを確認します。 グリセロール傷害後7〜21日の間に、施設ガイドラインに従ってマウスを安楽死させる(すなわち、イソフルラン過剰摂取に続いて子宮頸部脱臼)。 組織学またはRNA単離に使用する組織の採取を開始します。メモ:組織は、犠牲を払ってから10~15分以内にスナップフリーズするかPFAに入れる必要があります(図2)。 切断するマウスの任意の領域に70%エタノールを自由にスプレーして、髪を解剖領域や器具から遠ざけます。 はさみを使用して、骨盤の近くの脚の上部付近の皮膚を切断します(図3A)。 脚の皮膚を上から足首までゆっくりと引き出します(図3B)。注:TAは涙滴型の筋肉で、内側楔形文字と第1中足骨に付着した明確に定義された遠位腱を有する。それは脛骨の側方にあり、下膝まで伸びています。 まず、TAを採取する前に、先端の鋭いピンセットを用いて外側結合組織層(エピミシウム)を除去する(図3C)。解剖顕微鏡を使用して、エピミシウムをよりよく視覚化します。 遠位腱から始めて、筋肉の下からTAの下にあるピンセットをスライドさせ、膝に向かってゆっくりと上向きに引っ張ります(図3D)。筋肉の端で停止します;下膝で感じた抵抗を押しのけないでください。 下膝に達する前に大きな抵抗がある場合は、停止して、結合組織の残りの層を除去し続けます。注:EDLに付着するTA腱のすぐ外側に別の遠位腱があり、これはTAの外側の細い筋肉である。TA腱の下にピンセットだけをスライドさせるように注意することで、EDLの偶発的な収穫を防ぐことができますが、固定後に簡単に取り外すこともできます。 ピンセットでTAを脚から部分的に持ち上げたら、メスで同じ動きをして、TAと下膝の接続を切断します(図3E)。足首の腱をはさみで切ってTAを完全に外します。繊維を傷つけないように、腱の筋肉だけを扱います。 腱の反対側の端でTAの1/3をカットし(図3F)、微量遠心管に入れ、液体窒素に滴下してスナップフリーズします(図3H)。 組織の他の2/3を組織学のために4%PFAで標識されたウェルに沈める(図3I)。最初と最後の組織が固定液に入れられた時期を必ず追跡してください。シェーカーの上に4°Cで2〜2.5時間置きます。 固定の持続時間は、組織およびそのサイズに依存する。組織の固定に必要な期間を決定します。TAを4°Cで2〜2.5時間固定すると、通常、組織の過剰固定を引き起こすことなく脂肪細胞の形態が良好に維持されます。注:ホールマウント免疫蛍光染色にTAを使用することを計画している場合は、セクション7:「ホールマウント免疫蛍光染色」に到達するまで、このプロトコルの残りの部分をスキップしてください。 固定後、PFAをウェルから取り出し、冷たい1x PBSで組織を2〜3回すすぎ、次いで冷たい1x PBSで2〜3回、洗浄あたり5分間洗浄する。 PBSをウェルから取り出し、組織が浮遊できるように1x PBSに十分な30%スクロースを加える。シェーカーの上に置き、4°Cで一晩置きます。 (A)皮膚は脚の付け根で切断され、(B)後肢の筋肉は露出している。(C)エピミシウムがTAから除去されると、(D)鉗子を使用して筋肉を部分的に分離し、エピミシウムが完全に除去されたことを確認する。(E)TAをメスで脚から切断し、腱を切断した後に除去する。(G)TAを3分の1と3分の2のピースに切断した後、(H)3分の1をRT-qPCR分析のために液体窒素中でスナップフリーズし、(I)残りの3分の2を組織学のために4%PFAに固定する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 4. 埋め込み 組織を完全に沈めるのに十分な包埋媒体で標識し、充填することによって、包埋に使用する試料型を準備する。 ウェルから組織を取り出し、ペーパータオルで余分なスクロースを乾燥させ、凍結培地で満たされた試料型に移動します。注: 金型がクライオスタット上でどの向きで切断されているかを知っておくと便利です。このようにして、ユーザは、関心領域が容易にアクセス可能となるような方法で、鋳型内の組織を配向させることができる。TAの場合、これは、最も厚い端(腱側とは反対側)を切片化する表面を向くことによって達成されるであろう。これにより、TAを最も厚い部分(腹部)で容易に切断することができ、筋線維の断面切断が可能になる。 イソペンタンを保持した容器を液体窒素に部分的に浸漬することによりイソペンタンスラリーを調製する。組織を埋め込むために使用する標本型の約半分を沈めるのに十分な液体イソペンタンが容器内にあることを確認してください。 イソペンタンスラリーに慎重に入れ、金型の約半分が水没していることを確認することによって、金型を凍結し始めます。また、金型が 4 つの側面すべてから均等に凍結していることを確認してください。 金型全体が上から目に見えて凍結する直前に、イソペンタンから金型を取り出します。この処理にかかる時間は、使用する金型によって異なります。 残りのブロックを凍結させながら、ドライアイスを入れた容器に凍結した金型を保管し、-80 °C で保管します。注:凍結用のイソペンタンは再利用できます。ガラス瓶に入れますが、イソペンタンが室温(RT)に達するまで蓋を締めないでください。さもなければ、圧力の変化はボトルを粉砕する可能性がある。 5. セクショニング クライオスタットを-22~-24°Cに設定し、TAを含む型をクライオスタットに加え、温度順応のために最低30分間待ちます。その間、一連の正に帯電した顕微鏡スライドにラベルを付けます。 アンチロールプレートを挿入し、試料ブロックと接触するプレートに最小限のニックがあるようにクライオスタットに合わせます。所定の位置に固定します。 新しいクライオスタットブレードをブレードホルダーに挿入し、所定の位置に固定します。警告: 刃は鋭くなっています。クライオスタットまたは凍結金型の他の部分を操作するときは、ブレードを覆います。 凍結したブロックを金型から取り出します。クライオスタットチャックに均一な包埋剤の層を追加し、培地にブロックを配置します。包埋剤が完全に凍結(不透明な白)になるまで1〜3分間放置します。メモ:TAの場合、チャックを装着すると最も厚い領域(腹)が見えるようにします。 組織ブロック付きのクライオスタットチャックをクライオスタットに入れます。ブレードを覆い、ブレードに接触するまでクライオスタットを前方に進めます。組織が包埋媒体によって覆い隠されなくなるまで、25μm切片でブロックを通る切片。メモ: 断面の厚さが均一になるように、クライオスタットの角度やステージの位置を調整してください。断面の厚さの均一性を確保するために、いくつかの断面を収集すると役立つ場合があります。TA内の関心領域(腹部)まで切片化する前に適切なアンチロールプレートの位置を見つけることをお勧めします。 断面の厚さを10-12 μmに変更し、ラベル付けされた顕微鏡スライドに切片を収集します。シリアルセクショニングは、6〜10枚のスライド(1〜xとラベル付けされた)に隣接するセクションを収集することによって推奨され、複数のマーカーの染色を可能にする。必要に応じて、薄いブラシを使用してセクションをカール解除してから、スライド上に集めます。メモ: 断面がカールしている場合は、温度が -22 ~ -24 °C の範囲で安定していることを確認します。セクションに垂直な縞模様がある場合は、アンチロールプレートまたはブレードの傷が原因である可能性があります。これは、アンチロールプレートの位置を調整したり、新しいブレードに切り替えたりすることで固定できます。 同じ断面平面の隣接する切片を各スライドに集めた後、厚さを25 μmに戻してブロックを通って150〜200 μm前進させ、厚さを10〜12 μmに調整して再び切片化を開始します。メモ: このシリアル セクショニングにより、ユーザーは TA を介してさまざまな深さで視覚化、イメージ化、定量化できます。スライドごとに3~4つのシリアルセクションで十分です。 スライドおよび組織ブロックを-80°Cで保存する。 6. 組織切片の免疫蛍光(IF)染色 注:抗体濃度はロットとメーカーによって異なる可能性があるため、目的のスライドを染色する前に、テストスライド上の抗体の濃度をいくつか評価して最適化することをお勧めします。 RTまたは37°Cのウォームプレート上で10〜20分間、スライドを解凍/乾燥させます。 疎水性ペンを使用して、スライドの紙面の端に線を引き、ガラスと接します。 スライドをコプリン瓶に入れ、1x PBS + 0.1% Tween20 (PBST) 3-5xでシェーカーで洗浄し、洗浄あたり少なくとも5分間洗浄して組織切片を再水和させます。注:この時点では、スライドをPBSTに沈めずに(疎水性ラインまで)座らせないことが重要です。 スライドを加湿チャンバーのラックに置き、スライドに310-350 μLのブロッキング溶液(5%ロバ血清と0.3%Triton X-100 in 1x PBS)をRTで1〜2時間重ねます。注:ブロッキング溶液には0.3%のTriton X-100が含まれており、組織切片の十分な透過処理を可能にするため、追加の透過処理ステップは必要ありません。マウス由来の一次抗体(すなわち、以下に列挙するPAX7およびMYOD1)を使用する場合、ブロッキングステップのためのブロッキング溶液中にFabフラグメント(1:50)を使用するマウスオンマウスブロッキングステップを含めることが推奨される。これは、一次抗体以外の抗体に対するマウス二次抗体の非特異的結合によるバックグラウンドを低減するのに役立つであろう。 ブロッキング溶液中で使用する一次抗体を、次のステップに進む直前に次のように希釈する: 脂肪細胞染色および全切片イメージングのための一次抗体:ウサギ抗ペリリピンを1:1000の希釈比で希釈する。 脂肪細胞の系統追跡のための一次抗体:ニワトリ抗GFPを1:1000の比率で希釈し、ウサギ抗ペリリピンを1:1000で希釈する。 FAPの系統追跡のための一次抗体:ニワトリ抗GFPを1:1000の比率で希釈し、ヤギ抗PDGFRαを1:250の比率で希釈する。 筋原性マーカーに対する一次抗体:マウス抗PAX7を1:25の比率で、またはマウス抗MYOD1を1:250で、ウサギ抗ラミニンを1:1000の比率で希釈する。注:上記の抗体はこのプロトコルで正常に評価されていますが、FAP、脂肪細胞および/または他の細胞型を標識するための他のマーカーおよび抗体もこのプロトコルと適合している可能性があります。一次抗体を初めて使用する場合は、一次抗体が省略されたネガティブコントロールスライドを含めることを強くお勧めします。これは、抗体の特異性について制御するであろう。プロトコルの他のすべてのステップ(二次抗体の添加を含む)に従いますが、ブロッキング溶液中の一次抗体の代わりに、次のステップではブロッキング溶液が単独で使用されます。 ブロッキング溶液をスライドからダンプし、一次抗体を含む310〜350μLのブロッキング溶液を重ね、加湿チャンバ内で4°Cで一晩インキュベートする。 翌日、ブロッキング溶液/一次抗体をスライドから取り出し、コプリン瓶に入れます。スライドをPBSTで2〜3回すすぎ、シェーカーでPBSTで3〜5倍を洗濯あたり少なくとも5分間洗浄します。 最後の洗浄中に、ブロッキング溶液に使用する二次抗体または任意の直接コンジュゲートを調製する。これらの抗体が光の中で過ごす時間を最小限に抑えて、フォトブリーチングを回避します。 希釈二次抗体/直接コンジュゲート:488nmロバ抗ニワトリ(1:1000)または抗ウサギ(1:1000)または抗マウス(1:1000)、568nmロバ抗ヤギ(1:1000)または抗ウサギ(1:1000)またはファロイジン(筋繊維;1:100)、DAPI染色(核;1:500)。 加湿チャンバー内で、二次抗体および/または直接コンジュゲートを含む310〜350μLのブロッキング溶液でスライドを重ねる。RTで1〜2時間インキュベートする。これからもサンプルを光から守ります。 ブロッキング溶液/二次抗体をダンプし、コプリン瓶に入れます。PBSTで1回すすぎ、シェーカーでPBSTで3〜5倍を洗濯あたり少なくとも5分間洗浄します。光が当たらないように、コプリンの瓶を覆ったままにしておきます。 スライドの端を叩き、ペーパータオルで背中を拭いてできるだけ乾かしますが、組織切片を乾燥させないでください。 スライドの上端の水平端に水性マウント媒体を3〜4滴加え、カバースリップをそっと追加します。カバースリップの下に気泡が形成されている場合は、押し下げたり動かしたりしないでください。圧力や動きは、脂肪細胞の脆弱な細胞構造を歪める可能性があります。 イメージングの前に、マウント媒体を一晩暗闇にセットしてください。 7. ホールマウント免疫蛍光染色 約1時間の固定後(ステップ3.14を参照)、先端の鋭いピンセットを使用して、固定されたTAから筋線維を剥離する。 分離した繊維を24ウェルプレートに入れ、PBSTでそれぞれ3xを3分間洗浄する。その後のすべてのインキュベーションでは、蒸発を防ぐために蓋を追加するようにしてください。 シェーカー上のRT(200-300 μL)で1% Triton X-100 in 1x PBS中で1時間インキュベートし、抗体のより良い浸透を可能にします。 PBSTで数回リンスした後、ブロッキング溶液(200-300μL)で重ね、4°Cで一晩、ヌーテーターまたはシェーカーでブロックします。 一次抗体を所望の濃度に希釈する(濃度を2倍にすることが良好な出発点となりやすい)ブロッキング溶液中で。サンプル(200-300 μL)をヌーテーターまたはシェーカーで4°Cで一晩インキュベートします。 シェーカーのRTで頻繁に交換し、各洗浄を30〜60分間約4〜6倍にして、1日を通してPBSTでサンプルを厳密に洗浄します。 ブロッキング溶液中の二次抗体を所望の濃度(1:500がうまく機能する傾向がある)に希釈し、核染色を加え、サンプル(200-300 μL)をヌーテーターまたはシェーカーで4°Cで一晩インキュベートします。 シェーカーのRTで頻繁に変化させ、各洗浄または4°Cで一晩洗浄するたびに30〜60分間約4〜6倍の回数で、1日を通してPBSTでサンプルを厳密に洗浄します。 取り付けるには、余分なPBSTを静かに乾かしてから、スライドガラス上の1〜2滴の取り付け媒体に繊維を置きます(図4A)。カバースリップ(18 mm x 18 mm)を上げるには、粘土の足を少し加えます。これにより、繊維が押しつぶされるのを防ぎ、カバースリップをスライドに固定します。コンパウンドのモデリングは、このためにうまく機能します。カバースリップが固定されたら、カバースリップの下の領域がいっぱいになるまで、端にミディアムを追加します。注:退色防止剤を含むマウント媒体を使用する代わりに、組織を上昇系列のグリセロール(PBS中の30%〜80%グリセロール)を通して移動させることもできる。 マウント媒体の硬化を可能にするためにイメージングする前に1〜2日間待ってください。 8. 筋肉内脂肪のイメージング 顕微鏡の電源を入れ、イメージングソフトウェアを起動します。スライドをステージに固定します。注:筋肉切片の脂肪細胞をイメージングするには、広視野顕微鏡と組み合わせた5倍または10倍の対物レンズで十分です。WM-IFを可視化するためには、共焦点顕微鏡が必要です。 任意のチャンネルを使用して、画像化する領域を識別します。 イメージングソフトウェアで、各チャンネルのゲインと露光時間を調整します。 各チャンネルの組織全体の画像(顕微鏡と使用されるソフトウェアに応じて自動または手動)を撮影し、個々のタイルをマージして完全なTA断面を合成します。メモ: 同じ TA の 2 つまたは 3 つの異なるセクションの画像を異なる深さで撮影することをお勧めします。各セクションの脂肪細胞を定量化し、その平均を報告することにより、例えば注射エラーによる筋肉内脂肪の量の局所的な差異が回避される。 9. 脂肪細胞の定量化 以前にインストールされていない場合は、 セルカウンター プラグインをImageJに追加します(https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html)。 画像を TIF ファイルまたは元の顕微鏡ファイルとして ImageJ にインポートします。ImageJ の各チャンネルを個別の TIF ファイルとして表示します。メモ: LIF または同様の顕微鏡ファイルタイプを使用している場合は、[Bio-Formats のインポートオプション] で [スタックの表示] で [ハイパースタック] を選択し、[チャンネルの分割] チェックボックスをオンにします。「OK」をクリックしてファイルを開きます。また、[自動スケール] ボックスがオフになっていることを確認します。 各チャンネルの画像が 8 ビット形式 (およびグレー) であることを確認します: 画像> タイプ > 8 ビット。 DAPI(青)、GFP(緑)、ペリリピン(赤)、およびファロイジン(グレー)画像をマージする: 画像>カラー>チャンネルをマージします。 スケール (分析>セットスケール) がミクロン単位であることを確認します。フリーハンド選択ツールを使用して、各断面の負傷部分と負傷していない部分を概説し、測定(>測定の分析)し、負傷領域と負傷していない領域をスプレッドシートに記録します。注:損傷した筋肉は、筋線維のない領域、または中央に位置する核を含む筋線維が生息する領域として識別することができる。 セルカウンターの起動: プラグイン>セルカウンター>初期化します。 カウンタータイプを選択し、各脂肪細胞を数えます。脂肪細胞の総数をスプレッドシートに記録し、傷害領域の1mm2 あたりの脂肪細胞数を計算する。 10. RT-qPCRを用いたアジポジェニック遺伝子発現解析 RNA アイソレーション 開始する前に、RNaseフリーの水を45°Cに予熱し、新鮮な70%EtOH(サンプルあたり350μL)を調製する。 1,000 μL のチオシアン酸グアニジウムをサンプルの入った各チューブに加えます (ステップ 3.12 を参照)。ビーズビーター承認のチューブが使用されていることが重要です。注意:チオシアン酸グアニジウムは有毒です。適切な個人用保護具を着用し、ヒュームフードで取り扱います。 3つのミディアムビーズまたは1つの大きなビーズと1つの小さなビーズを各チューブに追加します。 ビーズビーターを用いて組織を50Hzで2〜4分間均質化する。組織の種類とサンプルサイズによっては、最大10分かかる場合があります。 200μLのクロロホルムを加える。警告: クロロホルムは有毒です。個人用保護具を着用し、ヒュームフードで取り扱います。 サンプルを15秒間振る。RTで2〜3分間インキュベートする。 12,000 x gで15分間遠心分離機。350 μLの透明な上清(RNAを含む上層)をピペットアウトし、350 μLの70%エタノールを含む新しい微量遠心チューブに加える。下部のタンパク質および/またはDNA層を吸引しないように注意してください 最大 700 μL の混合物を 2 mL の収集管に入れたミニスピンカラムに移します。製造元の指示に従って RNA 単離を続行します。 30-50 μLのRNaseフリー水で、期待される収量に応じて溶出します。RNAを氷上に保ち、分光光度計を使用して収率を測定します。RNAを-80°Cで保存する注:DNA汚染防止にはRNA層の上部350 μLだけを慎重に取り除くだけで十分であるため、DNase処理工程を省略することも可能です。RT-qPCR 解析に加えて、単離された RNA を RNA シーケンシングにも使用でき、その場合は DNase 処理ステップを強くお勧めします。 cDNA合成 製造元の指示に従って、cDNA 合成キットで cDNA を合成するには、最大 1 μg の RNA を使用します。 実行が完了したら、RNaseを含まない水を80μL加えます。サンプルを-20°Cで保存します。 脂肪細胞選択的遺伝子のRT-qPCR。 384ウェルフォーマットを使用して、1 μLのプライマー(〜1 μM最終濃度)を各ウェルの底に加えます。プライマーを予備乾燥すると、よりタイトな技術的複製が得られます。プライマーが完全に蒸発するまで覆いを被ったままにします(蒸発をスピードアップするために、プレートを37°Cに設定した加熱ブロックの上に置くことができます)。 2.5 μL の色素ベースの RT-PCR マスターミックス、2.1 μL の RNase フリー水、および 0.4 μL の cDNA (~1 ng) (ウェルあたり 5 μL の全容量) で、4 ~ 8 回のテクニカルレプリケートでサンプル反応を設定します。次の熱サイクル条件を使用しました:95°Cで15秒間変性し、60°Cで25秒間40サイクルでアニール/延長します。 ここで説明するようにΔΔCTを計算することによって、生のCT(サイクル閾値)値をハウスキーピング遺伝子(すなわち 、Hprt および Pde12)レベルに正規化する38。プライマー配列については20 を参照されたい。注: マイナス逆転写(-RT)コントロール、PCR 反応、プライマーバリデーションの使用など、RT-qPCR 分析の標準的な方法に従う必要があります。