检查骨骼肌中肌内脂肪形成及其细胞起源的指南

所有动物协议均由佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。 1. FAPs的遗传谱系追踪 注意：如果不需要 FAP 的遗传谱系追踪，则可以跳过步骤 1。 要对FAPs进行谱系追踪，请获得必要的小鼠等位基因。注意：在 Pdgfrα 前驱体的控制下，已经产生了几种他莫昔芬诱导的Cre品系，以成功靶向FAP，包括来自霍根29，兰多27和Bergles32 实验室。作为Cre活性的遗传报告基因，有许多Rosa26报告基因等位基因可用，例如 Rosa26EYFP33。虽然建议每个实验室确定哪种克雷报告基因组合最有效，但通过将 PdgfrαCreERT2 小鼠（29 和Jax#032770）与 Rosa26EYFP （33 和Jax#006148）报告者杂交，得到 PdgfrαCreERT2;罗莎26EYFP小鼠可用于有效和特异性地标记FAP20。为了追踪成熟FAPs的命运，建议等到小鼠达到至少约10周龄后再施用他莫昔芬。谱系追踪实验可以在男性和女性身上进行。 通过口服强饲法给予他莫昔芬 在玉米油中准备40mg / mL他莫昔芬，并在刮饲前1天充分涡旋混合。在旋转杂交炉中在37°C下孵育O / N。注意：他莫昔芬是一种致癌物质，应小心处理。处理时一定要戴手套，称量成粉末时戴口罩，因为有吸入的危险。 根据方案清洁该区域，并将强饲针头连接到1 mL注射器上。将200μL他莫昔芬吸入注射器中。 斯克鲁夫 · Rosa26EYFP小鼠（10周龄，两性使用），将它们放在平坦的表面上并牢牢抓住尾巴的基部。用空闲的手用拇指和食指抓住鼠标中间，然后轻轻地用轻微的压力滑动手柄，直到刚好越过肩膀。 用拇指和食指向后捏皮肤，拿起鼠标并翻转手，使鼠标面向用户，并将尾巴塞在握鼠标的手的小指和无名指之间。 此时，请确保鼠标已完全固定，无法移动其头部或手臂。将强饲针插入口腔，并用它来稍微倾斜小鼠的头部;这使得食道更容易接近。 小心而缓慢地将针头插入食道。如果遇到任何阻力，不要用力打针;针应该很容易滑落。慢慢注射他莫昔芬。监测小鼠15-20分钟，以确保在强饲时没有问题。注意：连续 2 天给药他莫昔芬通常可使 FAP 的重组效率达到约 75%-85%，而不会引起任何不良反应。建议用户在诱导损伤之前等待1-2周，这将使剩余的他莫昔芬从系统中除去，并将任何剩余的蛋白质翻转过来。 2. 胫骨前肌（TA）损伤 注意：为了研究肌内脂肪，建议使用基于甘油的损伤模型（无菌盐水中的甘油为50%），这导致大量的肌内脂肪形成34，35，36，37。 通过添加异氟醚并确保小鼠室和鼻锥的管子打开来准备麻醉机。用70%乙醇或过氧化物溶液清洁腔室和工作区域（取决于实验方案）。 将氧气流速设置为2.5 L / min，异氟醚浓度设置为2.5%。将鼠标放入麻醉室，等待约5分钟，使其被麻醉。 将鼠标仰卧放在干净的加热垫上，然后将鼻子插入鼻锥。用棉头涂抹器将兽医眼药膏轻轻涂抹在眼睛上，以防止麻醉时干燥。持续监测麻醉情况，并在受伤前对鼠标进行脚趾捏合，以确保完全麻醉鼠标。 用新鲜的酒精擦拭巾清洁腿部以进行消毒。 将30-50μL 50%甘油（取决于小鼠的大小）吸入胰岛素注射器中。轻轻梳理胫骨上的头发，露出TA的位置。注意：当头发仍然被酒精擦拭弄湿时，更容易移动头发并实现更好的可视化。 定位TA后（刚好在胫骨的侧面，它稍微突出穿过皮肤，轻轻触诊即可感觉到），将针头插入TA远端，靠近脚踝。将针头完全插入肌肉中，慢慢注射甘油，同时逐渐拔出针头，这有助于损伤大部分肌肉。注意：最好将针头平行于腿部插入，角度略微升高。良好的损伤通常会导致背屈，因为 TA 在拔出针头后会收缩。如果小鼠的脚趾向外伸展，则很可能是注射了长指伸肌（EDL）。 将鼠标放回笼子中，监测约15-20分钟，以确保麻醉恢复。 将针头丢弃在尖锐容器中。永远不要重装针头。注意：甘油注射后的镇痛应按照机构动物护理和使用委员会的批准提供。足脂肪细胞可以在损伤后5天（dpi）观察到。到7 dpi时，所有脂肪细胞都已形成，到21 dpi时，它们已完全成熟。 3. 组织采集 在1x PBS中准备4%的PFA，并在开始收获前放在冰上。 将任何用于肌肉固定的板（12孔或24孔）放在冰上，并向每个孔中加入4%的PFA，确保每个孔的PFA体积是被固定组织的10-20倍。 在甘油损伤后7至21天之间，根据机构指南（即异氟醚过量后颈椎脱位）对小鼠实施安乐死。 开始收获任何用于组织学或RNA分离的组织。注意：组织应在牺牲后10-15分钟内速冻或置于PFA中（图2）。 用70%乙醇充分喷洒要切入的小鼠的任何区域，以帮助防止头发远离解剖区域和器械。 用剪刀切开腿部顶部周围的皮肤，靠近骨盆（图3A）。 轻轻地将腿部皮肤从上到脚踝拉到脚踝（图3B）。注意：TA是一种泪滴形的肌有清晰定义的远端肌腱，连接到内侧楔形骨和第一跖骨。它位于胫骨的侧面，并延伸到下膝盖。 首先，在收获TA之前，使用尖头镊子除去外结缔组织层（表皮）（图3C）。使用解剖显微镜更好地观察表皮。 从肌肉底部开始，从肌腱远端开始，将TA下方的镊子滑出，然后轻轻向上拉向膝盖（图3D）。停在肌肉的末端;不要推过膝盖下部感觉到的阻力。 如果在到达下膝盖之前有明显的阻力，请停止并继续去除结缔组织剩余的层。注意：还有另一条远端肌腱刚好在TA肌腱的外侧，附着在EDL上，EDL是TA外侧的细长肌肉。小心地将镊子仅滑到TA肌腱下方可以防止EDL的意外收获，但也可以在固定后轻松将其移除。 一旦TA用镊子从腿上部分抬起，用手术刀使用相同的动作切断TA与下膝盖的连接（图3E）。用剪刀剪断脚踝处的肌腱，以完全去除TA。只处理肌腱处的肌肉，以避免损伤纤维。 在肌腱对面的末端切开1/3的TA（图3F），将其放入微量离心管中，然后将其放入液氮中快速冷冻（图3H）。 将其他2/3的组织浸没在标记的孔中，其中4%PFA用于组织学（图3I）。一定要跟踪第一个和最后一个组织何时被放置在固定剂中。在4°C下置于振荡器上2-2.5小时。 固定的持续时间取决于组织及其大小。确定固定组织所需的持续时间。在4°C下固定TA2-2.5小时通常可以很好地保持脂肪细胞形态，而不会引起组织的过度固定。注意：如果计划使用TA进行全载免疫荧光染色，请跳过本方案的其余部分，直到达到第7节：“全载免疫荧光染色”。 固定后，从孔中除去PFA，用冷1x PBS冲洗组织2-3次，然后用冷的1x PBS洗涤2-3次，每次洗涤5分钟。 从孔中取出PBS，并在1x PBS中加入足够的30%蔗糖以使组织漂浮。置于振荡器上，在4°C下过夜。 图3：组织收获摘要 （A）皮肤在腿部底部被切开，（B）后肢肌肉暴露在外。（C）一旦从TA中去除表皮，（D）镊子用于部分分离肌肉并确保表膜已被完全去除。（E）TA用手术刀从腿上切下，并在切除肌腱后取出。（G）将TA切割成三分之一和三分之二的碎片后，（H）三分之一在液氮中速冻以进行RT-qPCR分析，（I）另外三分之二固定在4%PFA中以进行组织学检查。 请点击此处查看此图的大图。 4. 嵌入 通过标记和填充足够的包埋介质以完全浸没组织来准备用于包埋的标本模具。 从孔中取出纸巾，在纸巾上干燥多余的蔗糖，然后移动到冷冻介质填充的标本模具中。注意：了解模具在低温恒温器上的切口方向是有帮助的。通过这种方式，用户可以以一种易于接近感兴趣区域的方式定位模具中的组织。对于TA，这将通过将最厚的一端（与肌腱侧相反）朝向将要切割的表面来实现。这使得TA可以很容易地在其最厚的部分（腹部）处切片，并允许肌肉纤维的横截面切割。 通过将装有异戊烷的容器部分浸入液氮中来制备异戊烷浆料。确保容器中有足够的液体异戊烷浸没约一半的标本模具以用于包埋组织。 开始冷冻模具，小心地将它们放入异戊烷浆料中，并确保大约一半的模具被浸没。另外，确保模具从四个侧面均匀冻结。 在整个模具从顶部明显冻结之前，将模具从异戊烷中取出。这需要多长时间取决于所使用的模具。 将冷冻模具保存在装有干冰的容器中，同时冷冻其余块，然后将其储存在-80°C。注意：用于冷冻的异戊烷可以重复使用。放入玻璃瓶中，但在异戊烷达到室温（RT）之前不要拧紧盖子。否则，压力的变化可能会使瓶子破碎。 5. 切片 将低温恒温器设置为-22至-24°C，将含有TA的模具加入低温恒温器中，并等待至少30分钟以进行温度适应。同时，标记一系列带正电荷的显微镜载玻片。 插入防侧翻板并与低温恒温器对齐，使其与试样块接触的板中具有最小的缺口。牢固到位。 将新的低温恒温器刀片插入刀片支架并将其固定到位。注意：刀片锋利。在操作低温恒温器或冷冻模具的其他部件时，请盖上刀片。 从模具中取出冻结的块。向低温恒温器卡盘添加一层均匀的包埋介质，并将块放置在培养基中。静置1-3分钟，直到包埋介质完全冻结（不透明白色）。注：对于助产士，卡盘上应可以看到最厚的区域（腹部）。 将带有组织块的低温恒温器卡盘放入低温恒温器中。揭开刀片并向前推进低温恒温器，直到刚与刀片接触。以25μm切片穿过块，直到组织不再被包埋介质遮挡。注意：切片时，调整低温恒温器的角度和/或载物台的位置，使截面厚度均匀。收集几个截面以确保截面厚度的均匀性可能会有所帮助。建议用户在切入TA（腹部）内感兴趣的区域之前找到适当的防侧倾板位置，因为这允许用户尝试防侧辊板的多个位置，直到切片笔直而不会浪费组织。 将切片厚度更改为10-12μm，并在标记的显微镜载玻片上收集切片。建议通过在6-10张载玻片（标记为1-x）上收集相邻切片来进行连续切片，这允许对多个标记物进行染色。如果需要，使用细刷子展开切片，然后再将其收集到幻灯片上。注：如果截面卷曲，请检查温度是否在 -22 至 -24 °C 范围内保持稳定。如果部分有垂直条纹，这可能是由于防滚板或刀片上的缺口;这可以通过调整防侧倾板的位置和/或切换到新的刀片来修复。 将同一切片平面的相邻部分收集到每个滑块上后，将厚度调整回25μm以通过块前进150-200μm，然后将厚度调整回10-12μm并再次开始切片。注意：这种串行切片允许用户通过TA在不同深度进行可视化，成像和量化;每张幻灯片三到四个串行部分就足够了。 将载玻片和组织块储存在-80°C。 6. 组织切片的免疫荧光（IF）染色 注意：由于抗体浓度可能因批次和制造商而异，因此建议在染色目标载玻片之前，在测试载玻片上评估几种不同浓度的抗体，从而进行优化。 在室温下或在37°C的温板上解冻/干燥载玻片10-20分钟。 使用疏水笔在幻灯片纸张表面的边缘画一条线，使其与玻璃相遇。 将载玻片放入Coplin罐中，每次洗涤用1x PBS + 0.1%吐温20（PBST）3-5x在摇床上洗涤至少5分钟，以使组织切片再水化。注意：在这一点上，重要的是不要让载玻片在没有浸没在PBST（直到疏水线）的情况下静置，否则组织切片会变干。 将载玻片放在加湿室的架子上，并在室温下用310-350μL封闭溶液（5%驴血清和0.3%Triton X-100在1x PBS中）覆盖载玻片1-2小时。注意：不需要额外的透化步骤，因为封闭溶液含有0.3%的Triton X-100，允许组织切片的充分透化。当使用衍生自小鼠的一抗（即下面列出的PAX7和MYOD1）时，建议在阻断步骤的封闭溶液中使用Fab片段（1：50）的小鼠对小鼠封闭步骤。这将有助于减少由于小鼠二抗与一抗以外的抗体的非特异性结合而导致的背景。 在进行下一步之前，请先稀释封闭溶液中使用的一抗，如下所示： 用于脂肪细胞染色和全切片成像的一抗：以1：1000的稀释比例稀释兔抗佩里利平。 用于脂肪细胞谱系示踪的一抗：以1：1000的比例稀释鸡抗GFP，以1：1000的比例稀释兔抗蠕动蛋白。 用于FAPs谱系示踪的一抗：以1：1000的比例稀释鸡抗GFP，以1：250的比例稀释山羊抗PDGFRα。 针对肌源性标志物的一抗：以 1：25 的比例稀释小鼠抗 PAX7 或以 1：250 的比例稀释小鼠抗 MYOD1，以 1：1000 稀释兔抗层粘连蛋白。注意：虽然上面列出的抗体已经成功地用该方案进行了评估，但其他标记FAP，脂肪细胞和/或其他细胞类型的标记物和抗体也可能与该方案兼容。强烈建议首次使用一抗时，用户应包括阴性对照载玻片，其中省略一抗。这将控制抗体的特异性。遵循方案中的所有其他步骤，包括添加二抗，但封闭溶液在下一步中单独使用，而不是封闭溶液中的一抗。 将封闭溶液从载玻片上倾倒，并用310-350μL具有一抗的封闭溶液覆盖，并在加湿室中于4°C孵育过夜。 第二天，将封闭溶液/一抗从载玻片上倒下，并将它们放入Coplin罐中。用PBST冲洗载玻片2-3次，每次洗涤用PBST在摇床上洗涤3-5次至少5分钟。 在最后一次洗涤期间，制备二抗或任何直接偶联物以用于封闭溶液中。尽量减少这些抗体在光线下花费的时间，以避免光漂白。 稀释的二抗/直接偶联物：488nm驴抗鸡（1：1000）或抗兔（1：1000）或抗小鼠（1：1000），568nm驴抗山羊（1：1000）或抗兔（1：1000）或鬼臼蛋白（肌纤维;1：100），DAPI染色（细胞核;1：500）。 在加湿室中用310-350μL具有二抗和/或直接偶联物的封闭溶液覆盖载玻片。在室温下孵育1-2小时。从现在开始保护样品免受光线照射。 倾倒封闭溶液/二抗并将其放入Coplin罐中。用PBST冲洗一次，每次洗涤用PBST在摇摇杯上洗涤3-5次至少5分钟。盖上科普林罐，以防止光线照射。 通过轻敲边缘并用纸巾擦拭背面来尽可能地干燥载玻片，但不要让纸巾部分变干。 将三滴或四滴水性安装介质添加到载玻片的顶部水平边缘，然后轻轻添加盖玻片。如果盖玻片下形成气泡，请勿按下或移动;任何压力或运动都会扭曲脂肪细胞脆弱的细胞结构。 在成像之前，让安装介质在黑暗中凝固过夜。 7. 全贴片免疫荧光染色 固定约1小时后（参见步骤3.14），使用尖头镊子从固定的TA上剥离肌纤维。 将分离的纤维放入24孔板中，并用PBST洗涤3x，每次3分钟。对于所有后续孵育，请确保盖上盖子以防止蒸发。 在振荡器上以RT（200-300μL）在1x PBS中在1%曲拉基X-100中孵育1小时，以允许更好的抗体渗透。 用PBST冲洗几次后，用封闭溶液（200-300μL）覆盖并在螺母或振荡器上在4°C下封闭过夜。 在封闭溶液中以所需浓度稀释一抗（浓度加倍往往是一个很好的起点）。将样品（200-300μL）在4°C的螺母或摇床上孵育过夜。 全天用PBST严格洗涤样品，并在摇床上的室温下频繁更换，每次洗涤约4-6x，持续30-60分钟。 将封闭溶液中的二抗稀释到所需浓度（1：500往往效果良好）加核染色，并将样品（200-300μL）在4°C的螺母或振荡器上孵育过夜。 全天用PBST严格洗涤样品，在摇床上的室温下频繁更换，每次洗涤约4-6次，每次洗涤30-60分钟或在4°C下洗涤过夜。 要安装，请轻轻干燥多余的PBST，然后将光纤放入载玻片上的一滴或两滴安装介质中（图4A）。要抬起盖玻片（18毫米x 18毫米），请添加小粘土脚;这将防止纤维被压扁，并将盖玻片固定在载玻片上。为此，对化合物进行建模效果很好。盖玻片固定后，向边缘添加更多介质，直到盖玻片下方的区域充满。注意：除了使用含有抗褪色剂的安装介质外，组织还可以通过一系列升序甘油（PBS中甘油为30%至80%）移动。 在成像前等待1-2天，以允许安装介质固化。 8. 肌内脂肪的成像 打开显微镜并启动成像软件。将幻灯片固定在舞台上。注意：对于肌肉切片中的脂肪细胞成像，5x或10x物镜结合宽视场显微镜通常就足够了。为了可视化WM-IF，需要共聚焦显微镜。 使用任何通道来标识要成像的区域。 在成像软件中，调整每个通道的增益和曝光时间。 在每个通道中拍摄整个组织的图像（根据显微镜和所使用的软件自动或手动），并合并各个瓷砖以形成整个TA横截面的复合物。注意：建议在不同深度拍摄同一 TA 的两个或三个不同部分的图像。通过量化每个部分中的脂肪细胞，然后报告由于注射错误而导致的肌内脂肪量的平均局部差异。 9. 量化脂肪细胞 如果以前未安装，请将 细胞计数器 插件添加到 ImageJ （https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html）。 将图像作为TIF文件或原始显微镜文件导入图像J。在图像J中将每个通道作为单独的 TIF 文件进行查看。注：如果使用LIF或类似的显微镜文件类型，请在“生物格式导入选项”下，为“查看堆栈依据”选择“超堆叠”，然后选中“拆分通道”框。单击“确定”打开该文件。此外，请确保未选中“自动缩放”框。 确保每个通道的图像均为 8 位格式（灰色）： 图像>类型 > 8 位。 合并 DAPI（蓝色）、GFP（绿色）、佩里利平（红色）和鬼臼（灰色）图像： 图像>颜色>合并通道。 检查比例（分析>集比例）是否以微米为单位。使用手绘选择工具，勾勒出每个横截面的受伤和未受伤部分，然后测量（分析>测量）并在电子表格中记录受伤与未受伤的区域。注意：受伤的肌肉可以被识别为没有肌纤维的区域或由包含中央定位的肌纤维细胞填充的区域。 启动细胞计数器： >初始化>细胞计数器插件。 选择计数器类型，然后计数每个脂肪细胞。在电子表格中记录脂肪细胞的总数，然后计算每1 mm2 受伤区域的脂肪细胞数量。 10. 使用逆转录-qPCR进行脂肪生成基因表达分析 核糖核酸分离 在开始之前，将不含RNase的水预热至45°C，并制备新鲜的70%EtOH（每个样品350μL）。 向含有样品的每个管中加入1，000μL硫氰酸胍（参见步骤3.12）。重要的是使用珠子敲击器批准的管子。注意：硫氰酸閙是有毒的。在通风橱中穿戴适当的个人防护装备和手柄。 在每个管子上添加三个中等珠子或一个大珠子和一个小珠子。 使用磁珠敲打器在50 Hz下均质组织2-4分钟。根据组织类型和样品大小，可能需要长达10分钟。 加入200μL氯仿。注意：氯仿是有毒的。在通风橱中穿戴个人防护装备和手柄。 摇动样品15秒。在室温下孵育2-3分钟。 以12，000 x g 离心15分钟。移出350μL透明上清液（上层含有RNA）并加入到含有350μL 70%乙醇的新微量离心管中。注意不要吸出较低的蛋白质和/或DNA层 将多达700μL的混合物转移到放置在2 mL收集管中的迷你离心柱中。按照制造商的说明继续进行RNA分离。 根据预期产量，用30-50μL无RNase水洗脱。将RNA保存在冰上，并使用分光光度计测量产量。将RNA储存在-80°C注意：可以省略DNA酶处理步骤，因为小心地只取下RNA层的上部350μL就足以防止DNA污染。除了 RT-qPCR 分析外，分离的 RNA 还可用于 RNA 测序，在这种情况下，强烈建议使用 DNase 处理步骤。 二甲基烷合成 按照制造商的说明，使用多达 1 微克的 RNA 使用 cDNA 合成试剂盒合成 cDNA。 运行完成后，加入80μL无RN酶水。将样品储存在-20°C。 脂肪细胞选择性基因的 RT-qPCR。 使用384孔格式，向每个孔的底部加入1μL引物（约1μM终浓度）。预干燥底漆可产生更紧密的技术重复。盖上盖子直到引物完全蒸发（板可以放置在设置为37°C的加热块上以加速蒸发）。 使用四到八个技术重复设置样品反应，如下所示：2.5μL基于染料的RT-PCR预混液，2.1μL无RNase水和0.4μLcDNA（〜1 ng），每孔5μL总体积。使用以下热循环条件：在95°C下变性15秒，在60°C下退火/延伸25秒，持续40次循环。 通过计算ΔΔCT将原始CT（周期阈值）值归一化为管家基因（即 Hprt 和 Pde12）水平，如此处所述38。引物序列见20 。注意：应遵循 RT-qPCR 分析的标准做法，例如使用减号逆转录 （-RT） 对照、PCR 反应和引物验证。