ラット内側腓腹筋における神経筋接合部の形態学的特徴の可視化

神経筋接合部(NMJ)1,2,3,4の³つの必須構造成分として、シナプス前運動軸索末端の形態学的側面、ニコチン性アセチルコリン受容体(AchRs)、およびシナプス周囲シュワン細胞(PSC)を含むシナプス後膜が広範囲に研究されている。骨格筋の薄切片および全マウント標本は、電子顕微鏡^5,6、共焦点顕微鏡^7,8、および光シート顕微鏡^9,10などの異なる組織学的技術を用いて検査されてきた。NMJの形態学的特徴は、異なる側面からこれらの技術によって実証されているが、比較として、共焦点顕微鏡はNMJの詳細な形態のイメージングのための理想的な選択肢である。

近年、NMJの構造成分を示すための多くの新しい技術が開発されている。例えば、thy1−YFPトランスジェニック蛍光マウスは、インビボおよびインビトロで運動軸索および運動エンドプレートを観察するために直接使用されている^10、11。さらに、蛍光α-BTXの静脈内注射は、光シート顕微鏡による検査に組織光学クリアリング処理を使用することにより、野生型およびトランスジェニック蛍光マウスの全マウント骨格筋におけるモーターエンドプレートの空間分布を明らかにするために適用されている^9,12。しかし、これらの高度な方法で見ることができるシナプス前部とシナプス後部の要素に加えて、PSCを同時に実証することはできません。

蓄積された証拠は、末梢グリア細胞としてのPSCが、NMJの発達および安定性、生理学的条件下でのNMJのシナプス活性の調節、および神経損傷後のNMJの再生に寄与するシナプス前末端と密接に関連していることを示している¹³、^14、15.NMJの細胞構造を考慮すると、このプロトコルは、シナプス前部およびシナプス後部の要素であるPSCを同時に標識するための適切な候補であり、正常および病理学的条件下でのNMJの完全性および可塑性を評価するために潜在的に使用される_。例えば、NMJの強度、シナプス後運動エンドプレートの形態および体積、NMJの神経支配および脱神経、ならびに生理学的および病理学的状態の筋肉におけるPSCの数を比較する。

腓腹筋はふくらはぎの膨らみを形成する最大の筋肉で、手足から皮膚や大腿二頭筋を取り除くことで簡単に解剖されます。筋肉は、しばしば、筋萎縮、神経筋変性、筋肉性能、および運動単位力をエキソビボまたはインビボで評価するために選択される¹⁶、^17、18。しかし、この技術は、様々な骨格筋からNMJの形態学的特徴を明らかにするのにも適している。同時に、太い筋肉切片は、細い切片⁷、⁸およびからかわれた筋線維¹⁹と比較して^、NMJのより完全な形態および量を明らかにすることができる。

これらの研究に沿って、ラット内側腓腹筋を本研究の標的組織として選択し、NMJの構造成分に従って様々な種類のバイオマーカーによる多重蛍光染色のために厚さ80μmでスライスした。ここで、ニューロフィラメント200(NF200)²⁰、²¹、小胞性アセチルコリントランスポーター(VAChT)^22、α−バンガロトキシン(α−BTX)^23、24、およびS100 ^25,26を用いて、神経線維、シナプス前終末、シナプス後部AchRs、およびPSCをそれぞれ標識した。さらに、筋肉組織および細胞核の背景を、ファロイジンおよびDAPIでさらに対比染色した。

本研究では、NMJの細胞構造とそれに対応するバイオマーカーを、より厚い固定標本上で同時に染色するための洗練されたプロトコールを開発することが期待されており、これは共焦点顕微鏡での使用がより便利であり、PSCの詳細な構造、シナプス前部およびシナプス後部の要素、ならびにそれらの相互の空間的相関に関するより多くの情報を得るのに役立つ。方法論の観点から、このプロトコールは、正常および病理学的条件下でのNMJの形態学的特徴を評価するのに有益であり得る。