Visualisatie van de morfologische kenmerken van neuromusculaire overgang in rat mediale gastrocnemiusspier
Summary
Het protocol toont een methode om ruimtelijke correlatie tussen de pre-synaptische terminals, post-synaptische receptoren en peri-synaptische Schwann-cellen in de mediale gastrocnemius-spier van de rat te onderzoeken met behulp van fluorescerende immunohistochemie met verschillende biomarkers, namelijk neurofilament 200, vesiculaire acetylcholinetransporter, alfa-bungarotoxine en S100.
Abstract
De neuromusculaire junctie (NMJ) is een complexe structuur die dient voor de signaalcommunicatie van het motorneuron naar de skeletspier en bestaat uit drie essentiële histologische componenten: de pre-synaptische motor axonterminals, post-synaptische nicotine-acetylcholinereceptoren (AchR’s) en peri-synaptische Schwann-cellen (PSC’s). Om de morfologische kenmerken van NMJ aan te tonen, werd de mediale gastrocnemiusspier van de rat geselecteerd als het doelweefsel en onderzocht met behulp van meerdere fluorescerende kleuring met verschillende soorten biomarkers, waaronder neurofilament 200 (NF200) en vesiculaire acetylcholinetransporter (VAChT) voor de motorische zenuwvezels en hun pre-synaptische terminals, alfa-bungarotoxine (α-BTX) voor de post-synaptische nicotine-AchR’s, en S100 voor de PSC’s. In deze studie werd kleuring uitgevoerd in twee groepen: in de eerste groep werden monsters gekleurd met NF200, VAChT en α-BTX, en in de tweede groep werden monsters gekleurd met NF200, α-BTX en S100. Er werd aangetoond dat beide protocollen de gedetailleerde structuur van NMJ effectief kunnen aantonen. Met behulp van de confocale microscoop werden morfologische kenmerken van de pre-synaptische terminals, post-synaptische receptoren en PSC gezien en hun Z-stacks-afbeeldingen werden gereconstrueerd in een driedimensionaal patroon om de ruimtelijke correlatie tussen de verschillende etiketteringen verder te analyseren. Vanuit het perspectief van de methodologie bieden deze protocollen een waardevolle referentie voor het onderzoeken van de morfologische kenmerken van NMJ onder fysiologische omstandigheden, die ook geschikt kunnen zijn om de pathologische verandering van NMJ, zoals perifeer zenuwletsel en regeneratie, te evalueren.
Introduction
Als drie essentiële structurele componenten van de neuromusculaire junctie (NMJ)1,2,3,4, zijn morfologische aspecten van de pre-synaptische motor axonterminals, post-synaptisch membraan met nicotine-acetylcholinereceptoren (AchR’s) en peri-synaptische Schwann-cellen (PSC’s) uitgebreid onderzocht. Dunne secties en hele monsters van de skeletspieren zijn onderzocht met verschillende histologische technieken, zoals elektronenmicroscopie 5,6, confocale microscopie 7,8 en lichtbladmicroscopie 9,10. Hoewel de morfologische kenmerken van NMJ door deze technieken vanuit verschillende aspecten zijn aangetoond, is confocale microscopie ter vergelijking nog steeds een ideale keuze voor beeldvorming van de gedetailleerde morfologie van NMJ.
Onlangs zijn er veel nieuwe technologieën ontwikkeld voor het tonen van de structurele componenten van NMJ. Thy1-YFP transgene fluorescerende muizen zijn bijvoorbeeld direct gebruikt om motorische axonen en motoreindplaten in vivo en in vitro10,11 te observeren. Bovendien is intraveneuze injectie van fluorescerende α-BTX toegepast om de ruimtelijke verdeling van motorische eindplaten in hele skeletspieren van wild-type en transgene fluorescerende muizen te onthullen, door gebruik te maken van weefsel optische clearingbehandeling voor onderzoek met lichtplaatmicroscopie 9,12. Naast de pre- en post-synaptische elementen die met deze geavanceerde methoden kunnen worden bekeken, kunnen de PSC’s echter niet tegelijkertijd worden gedemonstreerd.
Accumulerend bewijs geeft aan dat PSC’s, als de perifere gliacellen, nauw verbonden zijn met de pre-synaptische terminals die bijdragen aan de ontwikkeling en stabiliteit van NMJ, de modulatie van synaptische activiteit van de NMJ onder fysiologische toestand, en de regeneratie van de NMJ na zenuwletsel 13,14,15 . Gezien de cellulaire architectuur van NMJ, is dit protocol een goede kandidaat om tegelijkertijd de PSC’s, pre- en post-synaptische elementen te labelen en wordt het mogelijk gebruikt om de integriteit en plasticiteit van de NMJ onder normale en pathologische omstandigheden te evalueren. Vergelijk bijvoorbeeld de intensiteit van NMJ, morfologie en volume van post-synaptische motoreindplaten, innervatie en denervatie van NMJ en het aantal PSC’s in spieren met fysiologische en pathologische status.
De gastrocnemiusspier is de grootste spier die de uitstulping in de kuit vormt, die gemakkelijk kan worden ontleed door de huid en de biceps femoris-spier uit de ledemaat te verwijderen. De spier wordt vaak gekozen om spieratrofie, neuromusculaire degeneratie, spierprestaties en motorische eenheidskracht ex vivo of in vivote beoordelen 16,17,18. De techniek is echter ook geschikt voor het onthullen van de morfologische kenmerken van NMJ van verschillende skeletspieren. Tegelijkertijd kunnen de dikke spiersecties een completere morfologie en hoeveelheid NMJ onthullen in vergelijking met dunne secties 7,8 en geplaagde spiervezels19.
In lijn met deze studies werd de mediale gastrocnemiusspier van de rat geselecteerd als het doelweefsel in deze studie en werd gesneden met een dikte van 80 μm voor meerdere fluorescerende kleuring met verschillende soorten biomarkers volgens de structurele componenten van NMJ. Hier werden neurofilament 200 (NF200)20,21, vesiculaire acetylcholinetransporter (VAChT)22, alfa-bungarotoxine (α-BTX)23,24 en S10025,26 gebruikt om respectievelijk zenuwvezels, pre-synaptische terminals, post-synaptische AchR’s en PSC’s te labelen. Bovendien werd de achtergrond van spierweefsel en cellulaire kernen verder bestreden met falloïdine en DAPI.
In deze studie verwachten we een verfijnd protocol te ontwikkelen voor het gelijktijdig kleuren van de cellulaire architectuur van NMJ met hun bijbehorende biomarkers op dikkere vaste monsters, wat handiger is voor gebruik in confocale microscopie en helpt om veel meer informatie te verkrijgen over de gedetailleerde structuur van de PSC’s, pre- en post-synaptische elementen, evenals hun ruimtelijke correlatie met elkaar. Vanuit het perspectief van de methodologie kan dit protocol nuttig zijn om de morfologische kenmerken van NMJ onder normale en pathologische omstandigheden te evalueren.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben de technische details beschreven die nodig zijn voor het uitvoeren van succesvolle meervoudige kleuring van spierplakken en het gebruik van fluorescerende immunohistochemie voor het onthullen van de morfologische kenmerken van NMJ op de dikke delen van de mediale gastrocnemiusspier van de rat. Door deze benadering te gebruiken, kunnen de fijne details en ruimtelijke correlatie van de PSC’s en pre- en post-synaptische elementen worden geanalyseerd en gewaardeerd onder confocale microscopie, en verder gereconstru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gefinancierd door het CACMS Innovation Fund (Nr. CI2021A03407), National Natural Science Foundation of China (nr. 82004299) en de fundamentele onderzoeksfondsen voor de Central Public Welfare Research Institutes (nr. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
References
- Kawabuchi, M., et al. The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats. TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).
- Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
- Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).
- Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).
- Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).
- Desaki, J., Uehara, Y. Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study. Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).
- Marques, M., Santo Neto, H. Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals. Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).
- Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice. Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).
- Yin, X., et al. Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle. Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Chen, W. T., et al. In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling. Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).
- Sugiura, Y., Lin, W. Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function. Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).
- Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. Perisynaptic schwann cells – The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).
- Walker, C. L. Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research. Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).
- Michaud, M., et al. Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy. Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).
- Sharma, S., et al. Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats. Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).
- Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).
- Marinello, M., et al. Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).
- Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).
- Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).
- Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).
- Karlin, A. Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors. Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).
- Rudolf, R., Straka, T. Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation. Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
- Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries. Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. Molecular architecture of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).
- Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).
