Visualisierung der morphologischen Eigenschaften der neuromuskulären Verbindung im Musculus atralis guestrocnemius medialis der Ratte
Summary
Das Protokoll zeigt eine Methode zur Untersuchung der räumlichen Korrelation zwischen den präsynaptischen Terminals, postsynaptischen Rezeptoren und perisynaptischen Schwann-Zellen im medialen Gastrocnemius-Muskel der Ratte unter Verwendung der fluoreszierenden Immunhistochemie mit verschiedenen Biomarkern, nämlich Neurofilament 200, vesikulärem Acetylcholintransporter, Alpha-Bungarotoxin und S100.
Abstract
Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist eine komplexe Struktur, die für die Signalkommunikation vom Motoneuron zum Skelettmuskel dient und aus drei wesentlichen histologischen Komponenten besteht: den präsynaptischen motorischen Axonterminals, den postsynaptischen nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (AchR) und den perisynaptischen Schwann-Zellen (PSCs). Um die morphologischen Eigenschaften von NMJ zu demonstrieren, wurde der Musculus gastrocnemius medialis der Ratte als Zielgewebe ausgewählt und unter Verwendung mehrerer fluoreszierender Färbung mit verschiedenen Arten von Biomarkern, einschließlich Neurofilament 200 (NF200) und vesikulärem Acetylcholintransporter (VAChT) für die motorischen Nervenfasern und ihre präsynaptischen Terminals, alpha-Bungarotoxin (α-BTX) für die postsynaptischen nikotinischen AchRs, und S100 für die PSCs. In dieser Studie wurde die Färbung in zwei Gruppen durchgeführt: In der ersten Gruppe wurden die Proben mit NF200, VAChT und α-BTX gefärbt, und in der zweiten Gruppe wurden die Proben mit NF200, α-BTX und S100 gefärbt. Es zeigte sich, dass beide Protokolle die detaillierte Struktur von NMJ effektiv demonstrieren können. Mit dem konfokalen Mikroskop wurden morphologische Eigenschaften der präsynaptischen Terminals, postsynaptischen Rezeptoren und PSC gesehen, und ihre Z-Stacks-Bilder wurden in einem dreidimensionalen Muster rekonstruiert, um die räumliche Korrelation zwischen den verschiedenen Markierungen weiter zu analysieren. Aus methodischer Sicht bieten diese Protokolle eine wertvolle Referenz für die Untersuchung der morphologischen Eigenschaften von NMJ unter physiologischen Bedingungen, die auch geeignet sein können, die pathologische Veränderung von NMJ, wie periphere Nervenverletzung und Regeneration, zu bewerten.
Introduction
Als drei wesentliche strukturelle Komponenten der neuromuskulären Verbindung (NMJ)1,2,3,4 wurden morphologische Aspekte der präsynaptischen motorischen Axonterminals, der postsynaptischen Membran mit nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (AchR) und perisynaptischen Schwann-Zellen (PSCs) umfassend untersucht. Dünne Schnitte und Ganzkörperproben der Skelettmuskulatur wurden mit verschiedenen histologischen Techniken untersucht, wie Elektronenmikroskopie 5,6, konfokale Mikroskopie7,8 und Lichtblattmikroskopie 9,10. Obwohl die morphologischen Eigenschaften von NMJ durch diese Techniken unter verschiedenen Aspekten nachgewiesen wurden, ist die konfokale Mikroskopie zum Vergleich immer noch eine ideale Wahl für die Bildgebung der detaillierten Morphologie von NMJ.
In letzter Zeit wurden viele neue Technologien entwickelt, um die strukturellen Komponenten von NMJ zu zeigen. Zum Beispiel wurden thy1-YFP-transgene fluoreszierende Mäuse direkt verwendet, um motorische Axone und motorische Endplatten in vivo und in vitro10,11 zu beobachten. Darüber hinaus wurde die intravenöse Injektion von fluoreszierendem α-BTX angewendet, um die räumliche Verteilung der motorischen Endplatten in der gesamten Skelettmuskulatur von Wildtyp- und transgenen fluoreszierenden Mäusen aufzudecken, indem eine gewebeoptische Clearing-Behandlung zur Untersuchung mit Lichtblattmikroskopie 9,12 verwendetwurde. Abgesehen von den prä- und postsynaptischen Elementen, die mit diesen fortgeschrittenen Methoden betrachtet werden können, können die PSCs jedoch nicht gleichzeitig demonstriert werden.
Akkumulierende Beweise deuten darauf hin, dass PSCs als periphere Gliazellen eng mit den präsynaptischen Terminals verbunden sind, die zur Entwicklung und Stabilität von NMJ, zur Modulation der synaptischen Aktivität des NMJ unter physiologischen Bedingungen und zur Regeneration des NMJ nach Nervenverletzung beitragen13,14,15 . In Anbetracht der zellulären Architektur von NMJ ist dieses Protokoll ein geeigneter Kandidat für die gleichzeitige Kennzeichnung der PSCs, prä- und postsynaptischen Elemente, und wird möglicherweise verwendet, um die Integrität und Plastizität des NMJ unter normalen und pathologischen Bedingungen zu bewerten. Vergleichen Sie zum Beispiel die Intensität von NMJ, die Morphologie und das Volumen der postsynaptischen motorischen Endplatten, die Innervation und Denervierung von NMJ und die Anzahl der PSCs in Muskeln mit physiologischem und pathologischem Status.
Der Musculus gastrocnemius ist der größte Muskel, der die Ausbuchtung in der Wade bildet, die leicht durch Entfernen der Haut und des Bizeps femoris aus der Extremität herausgeschnitten werden kann. Der Muskel wird oft ausgewählt, um Muskelatrophie, neuromuskuläre Degeneration, Muskelleistung und motorische Einheit Kraft ex vivo oder in vivo16,17,18 zu beurteilen. Die Technik eignet sich aber auch, um die morphologischen Eigenschaften von NMJ aus verschiedenen Skelettmuskeln aufzudecken. Gleichzeitig können die dicken Muskelabschnitte eine vollständigere Morphologie und Menge an NMJ im Vergleich zu dünnen Abschnitten 7,8 und gehänselten Muskelfasern19 aufweisen.
In Übereinstimmung mit diesen Studien wurde der mediale Gastrocnemius-Muskel der Ratte als Zielgewebe in dieser Studie ausgewählt und in einer Dicke von 80 μm für die mehrfache fluoreszierende Färbung mit verschiedenen Arten von Biomarkern entsprechend den Strukturkomponenten von NMJ geschnitten. Hier wurden Neurofilament 200 (NF200)20,21, vesikulärer Acetylcholintransporter (VAChT)22, Alpha-Bungarotoxin (α-BTX)23,24 und S10025,26 verwendet, um Nervenfasern, präsynaptische Terminals, postsynaptische AchRs bzw. PSCs zu markieren. Darüber hinaus wurde der Hintergrund von Muskelgewebe und Zellkernen weiter mit Phalloidin und DAPI konterkariert.
In dieser Studie erwarten wir, ein verfeinertes Protokoll für die gleichzeitige Färbung der zellulären Architektur von NMJ mit ihren entsprechenden Biomarkern auf dickeren fixierten Proben zu entwickeln, das für den Einsatz in der konfokalen Mikroskopie bequemer ist und dazu beiträgt, viel mehr Informationen über die detaillierte Struktur der PSCs, prä- und postsynaptischen Elemente sowie deren räumliche Korrelation zueinander zu erhalten. Aus methodischer Sicht kann dieses Protokoll von Vorteil sein, um die morphologischen Eigenschaften von NMJ unter normalen und pathologischen Bedingungen zu bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben die technischen Details beschrieben, die für die Durchführung einer erfolgreichen Mehrfachfärbung von Muskelscheiben und die Verwendung der fluoreszierenden Immunhistochemie zur Aufdeckung der morphologischen Eigenschaften von NMJ an den dicken Abschnitten des medialen Gastrocnemius-Muskels der Ratte erforderlich sind. Mit diesem Ansatz können die feinen Details und die räumliche Korrelation der PSCs und prä- und postsynaptischen Elemente unter konfokaler Mikroskopie analysiert und geschätzt und in einem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde gefördert durch den CACMS Innovation Fund (Nr. CI2021A03407), National Natural Science Foundation of China (Nr. 82004299) und die Grundlagenforschungsfonds für die zentralen gemeinnützigen Forschungsinstitute (Nr. ZZ13-Bj.-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-BJ-034; ZZ201914001 ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
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