تصور الخصائص المورفولوجية للوصلة العصبية العضلية في عضلة الجرذ الإنسية المعدية
Summary
يوضح البروتوكول طريقة لفحص الارتباط المكاني بين المحطات الطرفية قبل المشبكي ، والمستقبلات ما بعد المشبكي ، وخلايا شوان شبه المشبكية في عضلة المعدة الإنسية للفئران باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية الفلورية مع مؤشرات حيوية مختلفة ، وهي الخيوط العصبية 200 ، ناقل الأسيتيل كولين الحويصلي ، ألفا بونغاروتوكسين ، و S100.
Abstract
الوصلة العصبية العضلية (NMJ) هي بنية معقدة تعمل على توصيل الإشارة من الخلية العصبية الحركية إلى العضلات الهيكلية وتتكون من ثلاثة مكونات نسيجية أساسية: أطراف المحور العصبي الحركي قبل المشبكي ، ومستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية بعد المشبكي (AchRs) ، وخلايا شوان شبه المشبكية (PSCs). من أجل إثبات الخصائص المورفولوجية ل NMJ ، تم اختيار عضلة gastrocnemius الإنسية للفئران كنسيج مستهدف وفحصها باستخدام تلطيخ فلورسنت متعدد مع أنواع مختلفة من المؤشرات الحيوية ، بما في ذلك الخيوط العصبية 200 (NF200) وناقل الأسيتيل كولين الحويصلي (VAChT) للألياف العصبية الحركية ومحطاتها قبل المشبكية ، ألفا بونغاروتوكسين (α-BTX) ل AchRs النيكوتينية بعد المشبكية ، و S100 ل PSCs. في هذه الدراسة ، تم إجراء التلطيخ في مجموعتين: في المجموعة الأولى ، تم تلطيخ العينات ب NF200 و VAChT و α-BTX ، وفي المجموعة الثانية ، تم تلطيخ العينات ب NF200 و α-BTX و S100. وقد تبين أن كلا البروتوكولين يمكن أن يظهرا بفعالية الهيكل التفصيلي لل NMJ. باستخدام المجهر البؤري ، شوهدت الخصائص المورفولوجية للمحطات الطرفية ما قبل المشبكي ، والمستقبلات ما بعد المشبكي ، و PSC ، وتم إعادة بناء صور مكدسات Z الخاصة بهم في نمط ثلاثي الأبعاد لمواصلة تحليل الارتباط المكاني بين العلامات المختلفة. من منظور المنهجية ، توفر هذه البروتوكولات مرجعا قيما للتحقيق في الخصائص المورفولوجية ل NMJ في ظل الظروف الفسيولوجية ، والتي قد تكون مناسبة أيضا لتقييم التغيير المرضي ل NMJ ، مثل إصابة الأعصاب الطرفية وتجديدها.
Introduction
كثلاثة مكونات هيكلية أساسية للوصلة العصبية العضلية (NMJ) 1،2،3،4 ، تم التحقيق على نطاق واسع في الجوانب المورفولوجية لمحطات المحور الحركي قبل المشبكي ، والغشاء ما بعد المشبكي الذي يحتوي على مستقبلات أستيل كولين النيكوتينية (AchRs) ، وخلايا شوان شبه المشبكية (PSCs). تم فحص المقاطع الرقيقة والعينات الكاملة من عضلات الهيكل العظمي باستخدام تقنيات نسيجية مختلفة ، مثل المجهر الإلكتروني 5,6 ، والمجهر البؤري7,8 ، والمجهر الضوئي 9,10. على الرغم من أن الخصائص المورفولوجية ل NMJ قد تم إثباتها من خلال هذه التقنيات من جوانب مختلفة ، على سبيل المقارنة ، لا يزال المجهر البؤري خيارا مثاليا لتصوير المورفولوجيا التفصيلية ل NMJ.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير العديد من التقنيات الجديدة لإظهار المكونات الهيكلية ل NMJ. على سبيل المثال ، تم استخدام الفئران الفلورية المعدلة وراثيا الخاصة بك 1-YFP مباشرة لمراقبة محاور المحرك ولوحات نهاية المحرك في الجسم الحي وفي المختبر10,11. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيق الحقن الوريدي للفلورسنت α-BTX للكشف عن التوزيع المكاني للوحات نهاية المحرك في العضلات الهيكلية الكاملة للفئران الفلورية من النوع البري والمعدلة وراثيا ، باستخدام علاج إزالة الأنسجة البصرية للفحص باستخدام المجهر الضوئي 9,12. ومع ذلك ، إلى جانب العناصر قبل وبعد المشبكية التي يمكن عرضها بواسطة هذه الأساليب المتقدمة ، لا يمكن إثبات PSCs في نفس الوقت.
تشير الأدلة المتراكمة إلى أن PSCs ، باعتبارها الخلايا الدبقية الطرفية ، ترتبط ارتباطا وثيقا بالأطراف ما قبل المشبكية التي تساهم في تطوير واستقرار NMJ ، وتعديل النشاط المشبكي ل NMJ في ظل الحالة الفسيولوجية ، وتجديد NMJ بعد إصابة الأعصاب13,14,15 . بالنظر إلى البنية الخلوية ل NMJ ، يعد هذا البروتوكول مرشحا مناسبا لتسمية PSCs في وقت واحد ، والعناصر قبل وبعد المشبكي ، ومن المحتمل أن يستخدم لتقييم سلامة ومرونة NMJ في ظل الظروف الطبيعية والمرضية. على سبيل المثال ، قارن شدة NMJ ، ومورفولوجيا وحجم الألواح الطرفية الحركية بعد المشبكي ، وتعصيب وإزالة NMJ ، وعدد PSCs في عضلات الحالة الفسيولوجية والمرضية.
العضلة المعدية هي أكبر عضلة تشكل الانتفاخ في ربلة الساق ، والتي يتم تشريحها بسهولة عن طريق إزالة الجلد وعضلة عظم الفخذ ذات الرأسين من الطرف. غالبا ما يتم اختيار العضلات لتقييم ضمور العضلات ، والتنكس العصبي العضلي ، وأداء العضلات ، وقوة الوحدة الحركية خارج الجسم الحي أو في الجسم الحي16،17،18. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية مناسبة أيضا للكشف عن الخصائص المورفولوجية ل NMJ من مختلف العضلات الهيكلية. في الوقت نفسه ، يمكن أن تكشف أقسام العضلات السميكة عن مورفولوجيا وكمية أكثر اكتمالا من NMJ مقارنة بالأقسام الرقيقة 7,8 وألياف العضلات الضايقة19.
تمشيا مع هذه الدراسات ، تم اختيار عضلة gastrocnemius الإنسية للفئران كنسيج مستهدف في هذه الدراسة وتم تقطيعها بسماكة 80 ميكرومتر لتلطيخ الفلورسنت المتعدد بأنواع مختلفة من المؤشرات الحيوية وفقا للمكونات الهيكلية ل NMJ. هنا ، تم استخدام الخيوط العصبية 200 (NF200) 20,21 ، ناقل الأسيتيل كولين الحويصلي (VAChT)22 ، ألفا بونغاروتوكسين (α-BTX) 23,24 ، و S100 25,26 لتسمية الألياف العصبية ، والمحطات الطرفية قبل المشبكية ، و AchRs بعد المشبكية ، و PSCs على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، تم مواجهة خلفية الأنسجة العضلية والنوى الخلوية بشكل أكبر مع phalloidin و DAPI.
في هذه الدراسة ، نتوقع تطوير بروتوكول مكرر لتلطيخ البنية الخلوية ل NMJ في وقت واحد مع المؤشرات الحيوية المقابلة لها على عينات ثابتة أكثر سمكا ، وهو أكثر ملاءمة للاستخدام في الفحص المجهري البؤري ويساعد على الحصول على مزيد من المعلومات حول البنية التفصيلية ل PSCs ، والعناصر قبل وبعد المشبكي ، وكذلك ارتباطها المكاني ببعضها البعض. من منظور المنهجية ، قد يفيد هذا البروتوكول في تقييم الخصائص المورفولوجية ل NMJ في ظل الظروف الطبيعية والمرضية.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد وصفنا التفاصيل التقنية المطلوبة لإجراء تلطيخ متعدد ناجح لشرائح العضلات واستخدام الكيمياء النسيجية المناعية الفلورية للكشف عن الخصائص المورفولوجية ل NMJ على الأقسام السميكة من عضلة المعدة الإنسية للفئران. باستخدام هذا النهج ، يمكن تحليل التفاصيل الدقيقة والارتباط المكاني ل PSCs والعنا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة من قبل صندوق الابتكار CACMS (No. CI2021A03407)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82004299)، وصناديق البحوث الأساسية للمعاهد المركزية لبحوث الرفاه العام (رقم ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
References
- Kawabuchi, M., et al. The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats. TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).
- Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
- Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).
- Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).
- Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).
- Desaki, J., Uehara, Y. Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study. Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).
- Marques, M., Santo Neto, H. Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals. Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).
- Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice. Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).
- Yin, X., et al. Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle. Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Chen, W. T., et al. In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling. Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).
- Sugiura, Y., Lin, W. Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function. Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).
- Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. Perisynaptic schwann cells – The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).
- Walker, C. L. Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research. Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).
- Michaud, M., et al. Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy. Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).
- Sharma, S., et al. Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats. Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).
- Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).
- Marinello, M., et al. Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).
- Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).
- Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).
- Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).
- Karlin, A. Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors. Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).
- Rudolf, R., Straka, T. Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation. Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
- Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries. Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. Molecular architecture of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).
- Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).
